四溴双酚A的好氧降解菌的筛选方法和应用与流程

本发明涉及四溴双酚a的好氧降解菌的筛选方法和应用，属于微生物技术领域。

背景技术：

四溴双酚a(tetrabromobisphenola，tbbpa)是溴系阻燃剂(brfs)家族中的重要组成成员，是一种目前广泛运用在于电子产品、塑料材料、纺织品等这些亟需提高阻燃性能的日常生活用品之中。由于人工合成的tbbpa具有稳定性高(自然条件下的100mg/kg土壤的半衰期为80d)、耐热性好(分解温度为316℃)、合成工艺简单(直接在溶剂中对双酚a中进行溴化取代)等特性，成为了目前市场产量的最高的溴代阻燃剂，占整个溴系阻燃剂市场的60％。然而，在tbbpa的生产、或与日常用品聚合的过程中，可能会因为控制不严或聚合不完全而被释放到自然环境中，成为了水体、土壤、沉积物或大气的污染物。现已证实，tbbpa是一种人体内分泌干扰物，具有产生甲状腺激素干扰效应。与此同时，tbbpa也已被证实具有免疫毒性、细胞毒性和神经毒性。某些自然环境下的tbbpa的浓度，已达到危害自然环境及包括人类在内的所有生物的健康程度。

因此，寻找一种具有可以有效降解环境中tbbpa的技术至关重要。与较物理和化学方法相比，微生物降解tbbpa的方法具有环境友好、成本低廉和效果显著等优点，但是目前并没有寻找到以tbbpa为唯一碳源生长的并对高浓度的四溴双酚a有一定耐受性的好氧菌株。

技术实现要素：

针对目前微生物降解tbbpa的技术问题，提供四溴双酚a的好氧降解菌株的筛选方法和应用；本发明的微生物菌来自上海生活污水处理厂的活性污泥，经过人工驯化，分离纯化得到的。

本发明提供四溴双酚a的好氧降解菌株的筛选方法，即驯化，强化，分离，纯化和富集方法：将活性污泥以四溴双酚a为唯一碳源和能源驯化，以四溴双酚a和2，6-二溴苯酚强化；再将驯化强化后的液体涂布在以四溴双酚a为唯一碳源和能源的无机盐固体培养基上，分离纯化出具有降解四溴双酚a的单菌株；并将单菌株富集离心后接入以不同浓度的四溴双酚a为唯一碳源和能源的无机盐培养基中，了解其降解四溴双酚a的能力。本发明筛选的菌株可以在常规条件下以四溴双酚a为唯一碳源生长并降解去除四溴双酚a，无须添加其他能源，碳源，不产生二次污染；对四溴双酚a的毒性具有耐受性。

四溴双酚a的好氧降解菌株的筛选方法，具体步骤如下：

(1)将四溴双酚a溶于甲醇中配制成母液；

(2)将步骤(1)的母液加入到无机盐液体培养基中配制成四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅰ，以处理生活污水的活性污泥为菌源，接种至四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅰ中，在温度为29～31℃条件下摇床培养6.5～7.5d得到培养液体系ⅰ；

(3)将步骤(1)的母液加入到无机盐液体培养基中配制成四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅱ，将步骤(2)的培养液体系接种至四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅱ中摇床培养一个周期得到培养液体系ⅱ，然后将培养液体系ⅱ接种至四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅲ中摇床培养一个周期得到培养液体系ⅲ，将培养液体系ⅲ接种至四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅳ摇床培养一个周期得到培养液体系ⅳ，再将培养液体系ⅳ接种至新的四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅳ中摇床培养一个周期得到新的培养液体系ⅳ，重复将培养液体系ⅳ接种至新的四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅳ中摇床培养至两个月得到驯化培养液；其中四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅱ中四溴双酚a的浓度为40mg/l，四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅲ中四溴双酚a的浓度为60mg/l，四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅳ中四溴双酚a的浓度为80mg/l；

(4)将步骤(3)的驯化培养液接种于四溴双酚a无机盐培养基液体a-1中摇床培养一周得到a-1培养体系，或将步骤(3)的驯化培养液接种于1-溴苯酚无机盐培养基液体b-1中摇床培养一周得到b-1培养体系，或将步骤(3)的驯化培养液接种于2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-1中摇床培养一周得到c-1培养体系，或将步骤(3)的驯化培养液接种于四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-1中摇床培养一周得到d-1培养体系，或将步骤(3)的驯化培养液接种于四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-1中摇床培养一周得到e-1培养体系；其中四溴双酚a无机盐培养基液体a-1中四溴双酚a的浓度为20mg/l，1-溴苯酚无机盐培养基液体b-1中1-溴苯酚无机盐浓度为20mg/l，2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-1中2,6-二溴苯酚无机盐浓度为20mg/l，四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-1中四溴双酚a的浓度为10mg/l、1-溴苯酚无机盐的浓度为10mg/l，四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-1中四溴双酚a的浓度为10mg/l、2,6-二溴苯酚无机盐的浓度为10mg/l；

(5)将a-1培养体系接种至四溴双酚a无机盐培养基液体a-2中摇床培养一周得到a-2培养体系，将b-1培养体系接种至1-溴苯酚无机盐培养基液体b-2中摇床培养一周得到b-2培养体系，将c-1培养体系接种至2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-2中摇床培养一周得到c-2培养体系，将d-1培养体系接种至四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-2中摇床培养一周得到d-2培养体系，将e-1培养体系接种至四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-2中摇床培养一周得到e-2培养体系；其中四溴双酚a无机盐培养基液体a-2中四溴双酚a的浓度为40mg/l，1-溴苯酚无机盐培养基液体b-2中1-溴苯酚无机盐浓度为40mg/l，2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-2中2,6-二溴苯酚无机盐浓度为40mg/l，四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-2中四溴双酚a的浓度为20mg/l、1-溴苯酚无机盐的浓度为20mg/l，四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-2中四溴双酚a的浓度为20mg/l、2,6-二溴苯酚无机盐的浓度为20mg/l；

(6)将a-2培养体系接种至四溴双酚a无机盐培养基液体a-3中摇床培养一周得到a-3驯化培养液，将b-2培养体系接种至1-溴苯酚无机盐培养基液体b-3中摇床培养一周得到b-3驯化培养液，将c-2培养体系接种至2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-3中摇床培养一周得到c-3驯化培养液，将d-2培养体系接种至四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-3中摇床培养一周得到d-3驯化培养液，将e-2培养体系接种至四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-3中摇床培养一周得到e-3驯化培养液；其中四溴双酚a无机盐培养基液体a-3中四溴双酚a的浓度为60mg/l，1-溴苯酚无机盐培养基液体b-3中1-溴苯酚无机盐浓度为60mg/l，2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-3中2,6-二溴苯酚无机盐浓度为60mg/l，四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-3中四溴双酚a的浓度为30mg/l、1-溴苯酚无机盐的浓度为30mg/l，四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-3中四溴双酚a的浓度为30mg/l、2,6-二溴苯酚无机盐的浓度为30mg/l；

(7)采用灭菌冷却的去离子水分别稀释步骤(6)的a-3驯化培养液、b-3驯化培养液、c-3驯化培养液、d-3驯化培养液或e-3驯化培养液至10¹～10⁷倍，将稀释液涂布在以四溴双酚a为唯一碳源和能源的生长无机盐固体培养基上，在温度为29～31℃条件下恒温培养5天以上，挑选出形态颜色不同的菌株，分别划线纯化即得四溴双酚a的好氧降解菌株；将四溴双酚a的好氧降解菌株保存在温度为4℃的营养琼脂的固体斜面培养基上。

所述步骤(1)母液中四溴双酚a的浓度为2±0.01g/l。

所述无机盐液体培养基为k2hpo43g/l，kh2po41.5g/l，nacl1g/l，mgso40.008mg/l，cacl20.002mg/l，mnso40.002mg/l，feso40.002mg/l，cocl2·6h2o30mg/l，ph值为7.0～7.2；

所述步骤(2)四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅰ中四溴双酚a的浓度为20mg/l，摇床培养的转速为140～160rpm，菌源接种率为9％～11％。

所述步骤(3)步骤(3)中一个周期为7天，菌源接种率为9％～11％。

所述步骤(4)生长无机盐固体培养基为将琼脂粉溶解到无机盐液体培养基中，经灭菌后冷却得到生长无机盐固体培养基，生长无机盐固体培养基中四溴双酚a的浓度为80mg/l。

将保存的菌株在固体培养基中划线培养，培养后对其进行基因组dna提取，并采用引物27f和1492r进行扩增，其反应体系体积30ul：h2o17.8ul，buffer3ul，dntp2ul，dna模板1ul，酶0.2ul，前后引物各3ul。反应条件：1)95℃5min，2)95℃30sec，55℃30sec,72℃1min,35个循环，3)72℃10min，4)温度降至12℃；

扩增产物委托北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行测序,所得基因序列通过genbank进行同源性比对,确定其分类地位；序列比对结果表明其与假单胞菌pseudomonasmonteilii和pseudomonasputeda等多个种的基因序列相似，最高的达到99.9％；对其鉴定结果进行系统发育树分析表明该菌株属于香茅醇假单胞菌。

所述四溴双酚a的好氧降解菌株在降解四溴双酚a中的应用。

所述四溴双酚a的好氧降解菌株在降解四溴双酚a中的应用方法，具体步骤为：

(1)将保存在温度为4℃的营养琼脂的固体斜面培养基上的好氧降解菌株接种至灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基里，再将牛肉膏蛋白胨培养基置于温度为29～31℃条件下摇床培养19～29h得到培养液；

(2)将步骤(1)培养液离心处理去除上层清液，再加入灭菌水洗涤并离心处理，重复2次以上加灭菌水洗涤并离心处理得到菌液；

(3)将灭菌水加入至步骤(2)菌液中调整菌液使菌液的od600为1.0；

(4)将步骤(3)的调整的菌液接种至四溴双酚a-无机盐培养基中，并在温度为29～31℃条件下摇床培养5.0～5.5d降解四溴双酚a。

一种四溴双酚a的降解菌剂，该制剂的生产菌株为所述四溴双酚a的好氧降解菌株。

有益效果：

(1)本发明从生活污水处理的活性污泥筛选出的高效降解四溴双酚a的好氧菌株，经鉴定为香茅醇假单胞菌菌株；

(2)本发明好氧降解菌株可以以四溴双酚a为唯一碳源和能源生长并降解，降解过程中无需外加碳源，可节约应用成本，且菌株的适应范围广，无二次污染；

(3)本发明好氧降解菌株在较短时间内(5天)对浓度为20mg/l的四溴双酚a的降解率为81.57％，好氧降解菌株降解性能高；

(4)本发明好氧降解菌株在较高浓度(30mg/l)的四溴双酚a环境下在较短时间内(5天)对四溴双酚a的降解率可达77.20％；好氧降解菌株能够耐受高浓度四溴双酚a毒性；

(5)本发明好氧降解菌株可以制成菌剂，以用到实地的四溴双酚a污染环境修复中。

附图说明

图1为实施例1不同底物强化后的菌株好氧菌株在20mg/l的四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率，其中ia为a-3驯化培养液、ib为b-3驯化培养液、ic为c-3驯化培养液、id为d-3驯化培养液、ie为e-3驯化培养液；

图2为实施例2好氧降解菌株在不同浓度四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率；

图3为实施例2中初始浓度为20mg/l的样品降解前和5天降解后对比的高效液相色谱图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明进一步的详细说明，但是本发明的保护范围并不仅限于所述内容。

实施例1：四溴双酚a的好氧降解菌株菌株筛选方法

(1)将四溴双酚a溶于甲醇中配制成母液；其中母液中四溴双酚a的浓度为2±0.01g/l；

(2)将步骤(1)的母液加入到无机盐液体培养基中配制成四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅰ，以处理生活污水的活性污泥为菌源，接种至四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅰ中，在温度为29～31℃条件下摇床培养6.5～7.5d得到培养液体系ⅰ；其中无机盐液体培养基为k2hpo43g/l，kh2po41.5g/l，nacl1g/l，mgso40.008mg/l，cacl20.002mg/l，mnso40.002mg/l，feso40.002mg/l，cocl2·6h2o30mg/l，ph值为7.0～7.2，无机盐液体培养基经过温度为120℃、压力0.1mpa、20分钟灭菌冷却至室温；四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅰ中四溴双酚a的浓度为20mg/l，摇床培养的转速为140～160rpm，菌源接种率为10％；

(3)将步骤(1)的母液加入到无机盐液体培养基中配制成四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅱ，将步骤(2)的培养液体系接种至四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅱ中摇床培养一个周期得到培养液体系ⅱ，然后将培养液体系ⅱ接种至四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅲ中摇床培养一个周期得到培养液体系ⅲ，将培养液体系ⅲ接种至四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅳ摇床培养一个周期得到培养液体系ⅳ，再将培养液体系ⅳ接种至新的四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅳ中摇床培养一个周期得到新的培养液体系ⅳ，重复将培养液体系ⅳ接种至新的四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅳ中摇床培养至两个月得到驯化培养液；其中四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅱ中四溴双酚a的浓度为40mg/l，四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅲ中四溴双酚a的浓度为60mg/l，四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅳ中四溴双酚a的浓度为60mg/l；四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅱ、四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅲ、四溴双酚a-无机盐液体培养基ⅳ均经过温度为120℃、压力为0.1mpa、20分钟灭菌冷却至室温；一个周期为7天，菌源接种率为10％；

(4)将步骤(3)的驯化培养液接种于四溴双酚a无机盐培养基液体a-1中摇床培养一周得到a-1培养体系，或将步骤(3)的驯化培养液接种于1-溴苯酚无机盐培养基液体b-1中摇床培养一周得到b-1培养体系，或将步骤(3)的驯化培养液接种于2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-1中摇床培养一周得到c-1培养体系，或将步骤(3)的驯化培养液接种于四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-1中摇床培养一周得到d-1培养体系，或将步骤(3)的驯化培养液接种于四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-1中摇床培养一周得到e-1培养体系；其中四溴双酚a无机盐培养基液体a-1中四溴双酚a的浓度为20mg/l，1-溴苯酚无机盐培养基液体b-1中1-溴苯酚无机盐浓度为20mg/l，2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-1中2,6-二溴苯酚无机盐浓度为20mg/l，四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-1中四溴双酚a的浓度为10mg/l、1-溴苯酚无机盐的浓度为10mg/l，四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-1中四溴双酚a的浓度为10mg/l、2,6-二溴苯酚无机盐的浓度为10mg/l；四溴双酚a无机盐培养基液体a-1、1-溴苯酚无机盐培养基液体b-1、2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-1、四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-1、四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-1均经过温度为120℃、压力为0.1mpa、20分钟灭菌冷却至室温；一个周期为7天，菌源接种率为10％；

(5)将a-1培养体系接种至四溴双酚a无机盐培养基液体a-2中摇床培养一周得到a-2培养体系，将b-1培养体系接种至1-溴苯酚无机盐培养基液体b-2中摇床培养一周得到b-2培养体系，将c-1培养体系接种至2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-2中摇床培养一周得到c-2培养体系，将d-1培养体系接种至四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-2中摇床培养一周得到d-2培养体系，将e-1培养体系接种至四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-2中摇床培养一周得到e-2培养体系；其中四溴双酚a无机盐培养基液体a-2中四溴双酚a的浓度为40mg/l，1-溴苯酚无机盐培养基液体b-2中1-溴苯酚无机盐浓度为40mg/l，2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-2中2,6-二溴苯酚无机盐浓度为40mg/l，四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-2中四溴双酚a的浓度为20mg/l、1-溴苯酚无机盐的浓度为20mg/l，四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-2中四溴双酚a的浓度为20mg/l、2,6-二溴苯酚无机盐的浓度为20mg/l；四溴双酚a无机盐培养基液体a-2、1-溴苯酚无机盐培养基液体b-2、2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-2、四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-2、四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-2均经过温度为120℃、压力为0.1mpa、20分钟灭菌冷却至室温；一个周期为7天，菌源接种率为10％；

(6)将a-2培养体系接种至四溴双酚a无机盐培养基液体a-3中摇床培养一周得到a-3驯化培养液，将b-2培养体系接种至1-溴苯酚无机盐培养基液体b-3中摇床培养一周得到b-3驯化培养液，将c-2培养体系接种至2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-3中摇床培养一周得到c-3驯化培养液，将d-2培养体系接种至四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-3中摇床培养一周得到d-3驯化培养液，将e-2培养体系接种至四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-3中摇床培养一周得到e-3驯化培养液；其中四溴双酚a无机盐培养基液体a-3中四溴双酚a的浓度为60mg/l，1-溴苯酚无机盐培养基液体b-3中1-溴苯酚无机盐浓度为60mg/l，2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-3中2,6-二溴苯酚无机盐浓度为60mg/l，四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-3中四溴双酚a的浓度为30mg/l、1-溴苯酚无机盐的浓度为30mg/l，四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-3中四溴双酚a的浓度为30mg/l、2,6-二溴苯酚无机盐的浓度为30mg/l；四溴双酚a无机盐培养基液体a-3、1-溴苯酚无机盐培养基液体b-3、2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体c-3、四溴双酚a/1-溴苯酚无机盐培养基液体d-3、四溴双酚a/2,6-二溴苯酚无机盐培养基液体e-3均经过温度为120℃、压力为0.1mpa、20分钟灭菌冷却至室温；一个周期为7天，菌源接种率为10％；

(7)采用灭菌冷却的去离子水分别稀释步骤(6)的a-3驯化培养液、b-3驯化培养液、c-3驯化培养液、d-3驯化培养液或e-3驯化培养液至10⁵倍，将稀释液涂布在以四溴双酚a为唯一碳源和能源的生长无机盐固体培养基上，在温度为29～31℃条件下恒温培养5天以上，挑选出形态颜色不同的菌株，分别划线纯化即得四溴双酚a的好氧降解菌株；将四溴双酚a的好氧降解菌株保存在温度为4℃的营养琼脂的固体斜面培养基上；其中生长四溴双酚a无机盐固体培养基为将琼脂粉溶解到四溴双酚a无机盐液体培养基中(每1l的生长无机盐培养基液体中加20±5g琼脂粉)，经灭菌后冷却得到生长无机盐固体培养基，生长无机盐固体培养基中四溴双酚a的浓度为80mg/l；

将保存的菌株在固体培养基中划线培养，培养后对其进行基因组dna提取，并采用引物27f和1492r进行扩增，其反应体系体积30ul：h2o17.8ul，buffer3ul，dntp2ul，dna模板1ul，酶0.2ul，前后引物各3ul。反应条件：1)95℃5min，2)95℃30sec，55℃30sec,72℃1min,35个循环，3)72℃10min，4)温度降至12℃；

扩增产物委托北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进行测序,所得基因序列通过genbank进行同源性比对,确定其分类地位；序列比对结果表明其与假单胞菌pseudomonasmonteilii和pseudomonasputeda等多个种的基因序列相似，最高的达到99.9％；对其鉴定结果进行系统发育树分析表明该菌株属于香茅醇假单胞菌。

实施例2：将使用的培养基，锥形瓶及移液枪枪头等实验器材事先在121℃，100kpa的灭菌锅里灭菌20min后使用；

四溴双酚a的好氧降解菌株在降解四溴双酚a中的应用方法，具体步骤为：

(1)将保存在温度为4℃的营养琼脂的固体斜面培养基上的好氧降解菌株接种至灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉浸膏3g/l,鱼蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7.0～7.2)里，再将牛肉膏蛋白胨培养基置于温度为30℃、转速为150rpm条件下摇床培养24h得到培养液；其中四溴双酚a的好氧降解菌株分别为实施例1中a-3驯化培养液、b-3驯化培养液、c-3驯化培养液、d-3驯化培养液、e-3驯化培养液中的好氧降解菌株；

(2)将步骤(1)培养液离心处理去除上层清液，再加入灭菌水洗涤并离心处理，重复3次以上加灭菌水洗涤并离心处理得到菌液；

(3)将灭菌水加入至步骤(2)菌液中调整菌液使菌液的od600为1.0，即在紫外可见光分光的600nm的波长下数值为1.0；

(4)将步骤(3)的调整的菌液接种至四溴双酚a-无机盐培养基中，其中接种率为10％，四溴双酚a初始浓度分别为10mg/l，15mg/l，20mg/l，30mg/l；并在温度为30℃、转速为150rpm条件下摇床培养5d降解四溴双酚a；每个实验组有三个平行样，同时做一组不加微生物的空白组(ck)；

四溴双酚a浓度的检测：

样品预处理：5天后，将样品溶液调至的ph值为9(四溴双酚a在碱性环境下溶解效果好)后，放在摇床里摇半个小时使其样品里的四溴双酚a完全溶解；用0.22um孔径的滤膜过滤样品至棕色进样瓶中；利用高效液相色谱(shimadzulc-20at，东京，日本)分析样品中四溴双酚a的浓度；色谱条件：流通相(使用前超声20min)是80％的甲醇(高效液相色谱分析度)和20％超纯水。柱温箱温度设为35℃，流速1ml/min，进样体积为10ul，290nm波长，色谱柱：c18反向色谱柱(4.6mm×250mm,5μm)；初始浓度为20mg/l的样品的四溴双酚a的高效液相色谱图见图3(e-3驯化培养液中的好氧降解菌株)，其峰面积代表四溴双酚a的浓度；

本实施例a-3驯化培养液、b-3驯化培养液、c-3驯化培养液、d-3驯化培养液、e-3驯化培养液中的好氧降解菌株在20mg/l的四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率见图1，其中ia为a-3驯化培养液、ib为b-3驯化培养液、ic为c-3驯化培养液、id为d-3驯化培养液、ie为e-3驯化培养液；从图1中可知，a-3驯化培养液强化的好氧降解菌株在20mg/l的四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率可达58.96％，b-3驯化培养液强化的好氧降解菌株在20mg/l的四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率可达63.92％、c-3驯化培养液强化的好氧降解菌株在20mg/l的四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率63.94％、d-3驯化培养液强化的好氧降解菌株在20mg/l的四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率可达43.68％、e-3驯化培养液强化的好氧降解菌株在20mg/l的四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率可达76.18％，降解率最高；

本实施例e-3驯化培养液强化的好氧降解菌株在不同浓度四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率见图2，从图2可知，好氧降解菌株对于10mg/l的四溴双酚a的降解率最高达到了91.36％，而对于15mg/l，20mg/l和30mg/l浓度的四溴双酚a的降解率分别为83.39％，81.57％和77.20％；这些实验组的降解结果都远远大于空白对照组，且好氧降解菌株对于高浓度(30mg/l)的四溴双酚a仍有较高的降解率；这说明了筛选的好氧降解菌株(香茅醇假单胞菌菌株)可以在以四溴双酚a为唯一碳源的环境里生长并降解，且该菌株对高浓度的四溴双酚a的毒性有一定的耐受性。

实施例3：将使用的培养基，锥形瓶及移液枪枪头等实验器材事先在121℃，100kpa的灭菌锅里灭菌20min后使用；

四溴双酚a的好氧降解菌株在降解四溴双酚a中的应用方法，具体步骤为：

(1)将保存在温度为4℃的营养琼脂的固体斜面培养基上的好氧降解菌株接种至灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉浸膏5g/l,鱼蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7.2)里，再将牛肉膏蛋白胨培养基置于温度为30℃、转速为150rpm条件下摇床培养24h得到培养液；其中四溴双酚a的好氧降解菌株为实施例1中e-3驯化培养液中的好氧降解菌株；

(2)将步骤(1)培养液离心处理去除上层清液，再加入灭菌水洗涤并离心处理，重复2次以上加灭菌水洗涤并离心处理得到菌液；

(3)将灭菌水加入至步骤(2)菌液中调整菌液使菌液的od600为1.0，即在紫外可见光分光的600nm的波长下数值为1.0；

(4)将步骤(3)的调整的菌液接种至四溴双酚a-无机盐培养基中，其中接种率为10％，四溴双酚a初始浓度分别为10mg/l，15mg/l，20mg/l，30mg/l；并在温度为30℃、转速为150rpm条件下摇床培养5d降解四溴双酚a；每个实验组有三个平行样，同时做一组不加微生物的空白组(ck)；

本实施例e-3驯化培养液强化的好氧降解菌株在不同浓度四溴双酚a的无机盐培养基中5天后对四溴双酚a的降解率可知，好氧降解菌株对于10mg/l的四溴双酚a的降解率最高达到了91.36％，而对于15mg/l，20mg/l和30mg/l浓度的四溴双酚a的降解率分别为93.39％，91.57％和77.21％；这些实验组的降解结果都远远大于空白对照组，且好氧降解菌株对于高浓度(30mg/l)的四溴双酚a仍有较高的降解率；这说明了筛选的好氧降解菌株(香茅醇假单胞菌菌株)可以在以四溴双酚a为唯一碳源的环境里生长并降解，且该菌株对高浓度的四溴双酚a的毒性有一定的耐受性。