本发明涉及生物工程领域，尤其是涉及一种联产纤维二糖酶和几丁质的方法。
背景技术：
目前，世界各国都在积极研究利用非粮手段生产生物燃料，用以解决日益严重的能源危机、气候问题以及粮食短缺问题。木质纤维素作为地球上储量最丰富的多糖类物质，利用其生产燃料乙醇已成为各国研究的热点领域。
但由于木质纤维素结构致密复杂，大多数微生物并不能将其作为直接碳源来生产乙醇，只有将其水解成可发酵单糖类物质后，才能被微生物利用。酶解法由于其反应条件温和、效率高、能耗低、选择性强以及环保效果好等优点，尤其纤维二糖酶作为纤维素酶系中重要的水解酶，被广泛应用于纤维素水解过程中。
几丁质是广泛存在于自然界的一类多糖物质，在食品、轻工、医药、农业、环保等领域有广泛的用途。目前，对几丁质的基础研究已经取得很大进展，此后的研究开始集中于工业化生产和应用。目前工业生产的几丁质，原料主要是甲壳动物的外壳，但仍存在一些缺陷，与此同时，对以微生物为来源获取几丁质的方法也已经展开了研究。从各种微生物的几丁质含量来看，黑曲霉的几丁质含量较高，并且黑曲霉是工业生产中常用的真菌。
如果利用黑曲霉实现纤维二糖酶和几丁质的联产可以大大提高生物质原料的利用率，对节能减排以及生物质燃料的发展有着重要意义。
cn101705215b公开了利用黑曲霉菌株(aspergillusniger)cgmccno.3.3147制备木聚糖酶/纤维二糖酶复合酶及其制备方法。其可通过黑曲霉菌株高效联产木聚糖酶和纤维二糖酶，通过优选的发酵培养基，其中产酶木聚糖酶可达10000iu/g，纤维二糖酶可达900iu/g；制备的复合酶可直接与纤维素酶混合使用于秸秆发酵酒精、木糖醇、柠檬酸等生产中。可见黑曲霉在制备纤维二糖酶中具有较好的活性，但该技术方案仍不能实现纤维二糖酶与几丁质的联产。
中国专利cn104498408a公开了一种产拟除虫菊酯水解酶的地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)utm104菌株及其应用。该菌生物保藏编号为cgmccno.9509。utm104菌株可在下水污泥、生活垃圾、动物尸体、畜禽粪便、农作物秸秆等有机固体废物中进行好氧堆肥发酵，在有机物料中形成稳定的菌落生态系统，大量快速繁殖，有效地降解有机固体废弃物中的有机物，使其快速达到减量化、无害化。该菌株能够产生几丁质酶、β-葡聚糖内切酶、纤维二糖酶和拟除虫菊酯水解酶。但是该专利的菌株不能同时得到纤维二糖酶和几丁质。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了解决上述问题而提供一种联产纤维二糖酶和几丁质的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种联产纤维二糖酶和几丁质的方法，将黑曲霉接种于添加有柠檬酸钙的发酵培养基中进行发酵，所得发酵液中含有纤维二糖酶，发酵后黑曲霉菌体中含有几丁质。
所述黑曲霉为能够同时得到纤维二糖酶和几丁质的黑曲霉，不需要特殊菌株，优选为购自于中国普通微生物菌种管理保藏中心的保藏编号为cgmccno.3.11447的黑曲霉。
在本发明的一个实施方式中，所述柠檬酸钙在发酵培养基中的含量为0.5-1.5g/l。
本发明中，添加适量的柠檬酸钙可促进黑曲霉不仅能够生产纤维素二糖酶，还能促进生产几丁质的能力，主要原因在于：
首先，0.5～1.5g/l的柠檬酸钙在水中是可以溶解的，在发酵培养基中加入少量的柠檬酸钙，其电离出的柠檬酸根离子能够促进黑曲霉的三羧酸循环作用，从而有利于菌体生长，这为后续从菌体中提取几丁质奠定了基础，同时能够促进其产量，其次，柠檬酸钙电离出的钙离子是纤维二糖酶的有效激活促进剂，因此在发酵培养基中加入少量的柠檬酸钙，能够同时促进黑曲霉发酵生产几丁质和纤维二糖酶。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵培养基的成分为：葡萄糖10-20g/l，纤维素粉10-20g/l，蛋白胨10-15g/l，磷酸二氢钾0.5-1g/l，硫酸镁0.1-0.2g/l。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵培养基ph控制为4.5-5.5，在发酵罐中于温度121-126℃下灭菌20-60min。
在本发明的一个实施方式中，所述黑曲霉在发酵培养基中的接种量为5-10％(v/v)
在本发明的一个实施方式中，发酵完成后，通过微滤膜分离，实现发酵液与黑曲霉菌体的分离，透过液即为纤维二糖酶液，截留液为含有几丁质的菌体细胞，所述微滤膜优选规格为0.2μm的微滤膜。
在本发明的一个实施方式中，微滤膜过滤时，需要补充1-3倍的水，来稀释冲洗发酵液，使纤维二糖酶充分被提取。
其中，所得发酵液为纤维二糖酶液，可通过常规技术手段得到纤维二糖酶，例如可以使用旋转蒸发仪来得到纤维二糖酶。
在本发明的一个实施方式中，发酵完成后，从含有几丁质的黑曲霉菌体细胞中分离提取几丁质，具体方法为：采用电解法分离几丁质，电压10～50v，反应液为质量分数0.1～10％的naoh溶液，绝缘板上铺绝缘介质(普通滤纸)，用反应液滤湿，在绝缘介质上铺一层匀浆破碎的黑曲霉湿菌体，反应时间10～2000min，把电解后的物质洗涤并干燥，得到几丁质。
在本发明的一个实施方式中，进行发酵的条件为：温度25℃-34℃，发酵液ph控制为4.5-5.5(以5-25％氨水溶液、碳酸钠溶液或氢氧化钠溶液流加自控)，发酵罐内搅拌转速250r/min-550r/min，通气量2l/min-20l/min，罐压0.03mpa-0.06mpa。
在本发明的一个实施方式中，具体通过以下步骤来实现：
s1：配制发酵培养基，灭菌，控制发酵培养基的ph为4.5-5.5；
s2：向发酵培养基中添加柠檬酸钙，使得培养基中柠檬酸钙的浓度为0.5～1.5g/l，；
s3：向发酵培养基中接种黑曲霉，然后在发酵罐中进行发酵；
s4：将发酵后的液体通过微滤膜过滤，并经过多次加水稀释冲洗发酵液，得到透过液和截留液，透过液为纤维素二糖酶液；
s5：将s4中获得的截留液放入反应液中进行电解，得到几丁质。
本发明利用黑曲霉能够生产几丁质(又名甲壳素)，同时黑曲霉在合适的诱导物存在的条件下也会诱导合成纤维二糖酶(其属于次级代谢产物)的特性，利用黑曲霉联产纤维二糖酶和几丁质，实现纤维二糖酶和高附加值产品几丁质的联产。
相比于现有技术，本发明通过在培养基中添加适合产几丁质的生产促进因子(即柠檬酸钙)及有效的分离提取方法，在生产纤维二糖酶的同时，利用发酵产生的废弃菌体制备几丁质，实现了纤维二糖酶和高附加值产品几丁质的联产，不仅丰富了产品品种，使纤维二糖酶生产成本得到分摊，而且副产物菌体也得到利用，减轻了环保处理压力，为纤维二糖酶工业的发展提供了新的方向。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
配制基础培养基，葡萄糖10g/l，纤维素粉20g/l，蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.2g/l，ph5.0，在10l发酵罐中于121-126℃灭菌30min。
向基础培养基中添加不同浓度的柠檬酸钙，再以10％的接种量(v/v)接种黑曲霉，在发酵罐中进行发酵，发酵罐培养基装液量为7l，发酵条件为：温度30℃(自控)，ph5.0(以20％氨水溶液流加自控)，搅拌转速350r/min，通气量18l/min，罐压0.04mpa。
本实施例中，使用的黑曲霉为购自于中国普通微生物菌种管理保藏中心的保藏编号为cgmccno.3.11447的黑曲霉。
发酵完毕后，将发酵液通过0.2μm微滤膜，透过液即为纤维二糖酶液，将截留液经采用电解法分离几丁质，电压10v，反应液为质量分数1.5％的naoh溶液。绝缘板上铺绝缘介质(普通滤纸)，用反应液滤湿。在滤纸上铺一层匀浆破碎的黑曲霉湿菌体，反应时间200min，把电解后的物质洗涤并干燥。其中柠檬酸钙对联产纤维素酶和几丁质的促进作用见表1。
表1柠檬酸钙浓度对联产纤维二糖酶和几丁质的促进作用
表1反映了柠檬酸钙对黑曲霉联产纤维二糖酶和几丁质具有明显的促进作用，结果显示其能使几丁质生产得到促进，而且对产酶没有影响。
其中纤维二糖酶含量的测定方法：参考中华人民共和国能源行业标准nb/t13005—2016《用于生物燃料乙醇制备的纤维素酶酶活力测定方法》中规定的方法测定纤维二糖酶活力。
菌体中几丁质含量的测定方法：将利用电解法获得的几丁质进行称重，计算每100g菌体细胞中几丁质所占的质量分数(g/100g)。
实施例2
配制基础培养基，葡萄糖10g/l，纤维素粉20g/l，蛋白胨10g/l，磷酸二氢钾1g/l，硫酸镁0.2g/l，ph5.0，在10l发酵罐中于121-126℃灭菌30min。
向基础培养基中添加1.5％的柠檬酸钙，再以10％的接种量(v/v)接种黑曲霉，在发酵罐中进行发酵，发酵条件为：温度30℃(自控)，ph5.0(以20％氨水溶液流加自控)，搅拌转速350r/min，通气量18l/min，罐压0.04mpa。
本实施例中，使用的黑曲霉为购自于中国普通微生物菌种管理保藏中心的保藏编号为cgmccno.3.11447的黑曲霉。
发酵完毕后，将发酵液通过0.2μm微滤膜，透过液即为纤维二糖酶液，将截留液经采用电解法分离几丁质，电压10v，反应液为不同浓度的naoh溶液。绝缘板上铺绝缘介质(普通滤纸)，用反应液滤湿。在滤纸上铺一层匀浆破碎的黑曲霉湿菌体，反应时间200min，把电解后的物质洗涤并干燥。其中naoh浓度对联产纤维素酶和几丁质的促进作用见表2。
表2naoh浓度对联产纤维二糖酶和几丁质的促进作用
表2反映了不同naoh浓度下纤维二糖酶与几丁质联产情况数据分析，提高氢氧化钠浓度在一定程度上能促进几丁质的联产。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。