一种降解小麦阿拉伯木聚糖的复合酶系及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种降解小麦阿拉伯木聚糖的复合酶系及其应用。
背景技术：
：木聚糖是半纤维素主要的组成成分，是组成植物细胞壁的第二大类多糖，主链都是由β-1,4,-糖苷键连接的吡喃木糖组成，不同的植物中其侧链取代基团的组成及其修饰频率十分复杂，其侧链结构包括葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、木糖、半乳糖等己糖和甲基、乙酰基、阿魏酸等基团。比如：葡萄糖醛酸木聚糖(o-glucuronoxylan,gx)主要存在于双子叶植物(桦木、山毛榉木等)的细胞壁中；阿拉伯木聚糖(o-arabinoxylan,ax)存在于淀粉类谷物(小麦、大麦、高粱等谷物)果实细胞壁中；葡萄糖醛酸阿拉伯糖木聚糖(o-glucuronoarabinoxylan,gax)存在于单子叶植物(玉米)的细胞壁中。由于木聚糖的异质性，木聚糖降解相关酶类分为木聚糖主链降解酶和木聚糖侧链降解酶。大多数木聚糖主链降解酶受到侧链取代基空间位阻的影响，其完全降解需要一系列相关酶的协同作用，比如主链降解酶和侧链降解酶之间，木聚糖酶和木糖苷酶这种主链降解酶之间，以及不同gh家族的木聚糖酶之间。木聚糖主链降解酶主要分布在gh5、8、10、11家族。gh11家族木聚糖酶通常只有一个催化结构域，为“专一性”的木聚糖降解酶。gh10家族木聚糖酶可水解带有阿拉伯呋喃糖苷和4-o-甲基葡萄糖醛酸取代基的木聚糖。有研究表明，gh10家族木聚糖酶可水解葡萄糖醛酸木聚糖和mlg产生寡糖片段，接着由gh11家族木聚糖酶进一步水解。由于侧链取代基和取代度的复杂性，木聚糖侧链降解酶主要包括α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶(ec3.2.1.55)、乙酰木聚糖酯酶(ec3.1.1.72)、α-d-葡糖醛酸糖苷酶(ec3.2.1.139)和阿魏酸酯酶。β-木糖苷酶(ec3.2.1.37)主要分布在gh3,39,43和52家族，水解由木聚糖酶作用产生的木二糖和短链木寡糖，从非还原端释放木糖，其对木寡糖的亲和力随着寡糖聚合程度的增加而降低。木聚糖酶在工业上有很广泛的应用，比如饲料、食品、纺织品、造纸业和医药领域。木聚糖酶在啤酒酿造中可降低啤酒的粘度并增加麦芽汁的过滤性；在烘焙业可降解面粉中的木聚糖，从而增加面包体积、增加口感及保鲜时间。在制浆造纸工业中，应用木聚糖酶进行纸浆漂白可明显降低氯漂白剂的用量，更加经济节约、环保。其降解产物因具有优良的生物活性而广泛应用于食品、保健品和医药行业。例如，阿魏酸木寡糖具有抗血栓、降血脂、抗动脉粥样硬化、抗突变防癌、抗菌消炎、抗氧化等功能特性。木聚糖内切酶和阿拉伯呋喃糖苷酶的水解产物阿拉伯木聚糖、阿拉伯木寡糖、木寡糖可以作为肠道微生物所需的益生元。目前，已有很多研究者通过酶法生产特定的寡糖。kankanjiang等人研究了玉米麸皮热水处理的时间与木聚糖降解酶的组合，测定玉米麸皮中单糖和阿魏酸的产量。helenarantanen等人利用aspergillusaculeatus的gh10的木聚糖酶生产阿拉伯木二糖，再利用tlc、hpaec-pad，maldi-tof-ms方法测定产物结构。由于酶对底物的专一性，而且木聚糖降解酶系的各类降解酶对底物侧链的容忍度不同，因此，酶法降解可以生产特定的寡糖产物，不会产生不需要的单糖，而且生产条件温和、耗时短、不需要特殊的设备，更不会给环境造成额外的负担，给工业分离带来极大的便利。技术实现要素：为了提高木聚糖酶的降解效果，本发明提供了一种复合酶系以及所述复合酶系的应用。在本发明中，申请人从不同的木聚糖降解相关的酶中，筛选到了可以高效降解小麦阿拉伯木聚糖的复合酶系。一方面，本发明提供了一种降解小麦阿拉伯木聚糖的复合酶系，所述复合酶系包括阿拉伯呋喃糖苷酶an_abfb和β-木糖苷酶an_xlnd。进一步的，所述复合酶系还包括β-内切木聚糖酶，所述β-内切木聚糖酶选自an_xyna、an_xynb、an_xync和an_xynd中的一种或任意几种。进一步的，所述复合酶系还包括阿拉伯呋喃糖苷酶an_axha。在一个实施方式中，所述an_abfb的氨基酸序列如seqidno.6所示，所述an_xlnd的氨基酸序列如seqidno.7所示，所述an_xyna的氨基酸序列如seqidno.1所示，所述an_xynb的氨基酸序列如seqidno.2所示，所述an_xync的氨基酸序列如seqidno.3所示，所述an_xynd的氨基酸序列如seqidno.4所示，所述an_axha的氨基酸序列如seqidno.5所示。另一方面，本发明还提供了降解小麦阿拉伯木聚糖的复合酶系在降解小麦阿拉伯木聚糖中的应用。另一方面，本发明还提供了一种降解小麦阿拉伯木聚糖的方法，所述方法包括利用上述复合酶系对小麦阿拉伯木聚糖进行降解的步骤。在一个实施方式中，本发明所述的降解小麦阿拉伯木聚糖的方法包括以下步骤：利用阿拉伯呋喃糖苷酶an_abfb对小麦阿拉伯木聚糖降解第一时间段后得到第一降解产物，之后，再加入an_xlnd继续降解。在其他的实施方式中，在得到第一降解产物加入an_xlnd之前，还包括加入β-内切木聚糖酶降解第二时间段的步骤，所述β-内切木聚糖酶选自an_xyna、an_xynb、an_xync和an_xynd中的一种或任意几种。在其他的实施方式中，在利用阿拉伯呋喃糖苷酶an_abfb对小麦阿拉伯木聚糖降解之前，还包括利用an_axha对小麦阿拉伯木聚糖降解第三时间段的步骤。在一个实施方式中，所述第一时间段、第二时间段和第三时间段分别为至少10分钟，优选的，为至少15分钟，至少20分钟，至少25分钟，至少30分钟。在一个实施方式中，所述复合酶系降解小麦阿拉伯木聚糖的温度为30-60℃，优选，45-55℃，更优选，50℃。在一个实施方式中，所述复合酶系降解小麦阿拉伯木聚糖的ph为3-7，优选，4-6，更优选，4-5。在一个实施方式中，本发明所述的酶可以为宿主表达得到的酶；比如：大肠杆菌、酵母、真菌、动物细胞等宿主。优选的，通过表达载体在宿主中进行表达；例如，在大肠杆菌中通过pet系列的表达载体对上述酶进行表达。优选的，在表达之后还包括纯化的步骤；更优选的，所述pet系列的表达载体可以为pet-28a或pet-32a。附图说明此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：图1为β-内切木聚糖酶an_xyna、β-内切木聚糖酶an_xynb、β-内切木聚糖酶an_xync、β-内切木聚糖酶an_xynd、阿拉伯呋喃糖苷酶an_axha、阿拉伯呋喃糖苷酶an_abfb、β-木糖苷酶an_xlnd、β-木糖苷酶an_xlnb表达及纯化过程优化后sds-page蛋白图谱；(a)pet-28a(+)-an_xyna(e.colibl21),(b)pet-28a(+)-an_xynb(e.colibl21),(c)pet-28a(+)-an_xync(e.colibl21),(d)pet-28a(+)-an_xynd(e.colibl21),(e)pet-28a(+)-an_xlnb(e.colibl21),(f)pet-28a(+)-an_xlnd(e.colibl21plyss),(g)pet-32a(+)-an_abfb(e.colirossettagami),(h)pet-32a(+)-an_axha(e.colirossettagami).图2为ph和温度对a.nigeran76不同木聚糖降解酶活性的影响；四种β-内切木聚糖酶最适ph(a)和最适温度(d)测定结果；两种β-木糖苷酶最适ph(b)和最适温度(e)测定；两种阿拉伯呋喃糖苷酶最适ph(c)和最适温度(f)测定。所有数据为三次测定的平均值，误差线为标准偏差(sd)。相对活性100％是指标准测定条件的酶活。图3为β-内切木聚糖酶an_xyna、an_xynb、an_xync、an_xynd与β-木糖苷酶an_xlnd协同水解小麦阿拉伯木聚糖结果图。图4为单独利用β-木糖苷酶an_xlnd或an_xlnb对wax进行降解结果图，a为an_xlnb的降解结果，b为an_xlnd的降解结果。图5为β-内切木聚糖酶an_xyna、an_xynb、an_xync、an_xynd，阿拉伯呋喃糖苷酶an_axha、an_abfb，与β-木糖苷酶an_xlnd协同降解小麦阿拉伯木聚糖结果图。具体实施方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。实施例一材料与方法1、rna的提取与反转录黑曲霉(aspergillusniger)an76的原始出发菌株是一株由济南市郊腐烂秸秆的土壤中筛选的高产木聚糖酶菌株黑曲霉c-2，后经甲基磺酸乙酯(ems)和紫外线照射交替诱变而来。其基因组中的木聚糖降解酶基因为28个，除gh10和gh11家族的木聚糖主链酶外，包含较多种类的侧链酶基因，有5个木聚糖内切酶基因，2个β-木糖苷酶基因，1个阿拉伯木聚糖阿拉伯呋喃糖苷酶基因，4个α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶基因，4个内切阿拉伯呋喃糖苷酶基因，1个葡萄糖醛酸酶基因，9个阿魏酸酯酶基因以及2个乙酰酯酶基因，具有高效降解木聚糖的能力。对不同碳源诱导a.nigeran76后产生的胞外、胞内木聚糖降解酶系通过lc-ms/ms方法进行了分析，主要诱导分泌的木聚糖降解酶为4个木聚糖主链降解酶(gh11_xyna,gh11_xynb,gh10_xync和gh11_xynd)、4个木聚糖侧链降解酶(gh54_abfb,gh62_axha,ce1_axea和gh67_agua)和2个木糖苷酶(gh3_xlnd,gh43_xlnb)，并且木聚糖主链降解酶先于侧链降解酶分泌，并且分泌量远大于侧链降解酶。rna的提取：a.nigeran76孢子在1％(wt/vol)甘油培养基中200rpm摇瓶培养12h以后，将菌丝转接到1％xos诱导培养基继续培养4h。纱布过滤菌丝，无菌水洗掉多糖及培养基，液氮研磨菌丝成粉。量取0.1g粉末于rnafree管中加入1mltrizol(生工，上海)，按trizol说明书进行实验。rna产物中去除基因组dna：在提取总rna时要去除基因组dna，若dna未取出会导致pcr过程中产生有内含子的pcr产物。在rna样品中加入1/10体积的dnaseⅰ及其缓冲液，同时加入rnase抑制剂防止rna降解，37℃反应30min，70-80℃3min，于-80℃保存。cdna第一链的合成：上述获得的总rna稀释至1μg/μl加入2μl，anchoredoligo(dt)18primer1μl，2×tsreationmix10μl，transscriptrt/r1enzymemix1μl，gdnaremover1μl，rnase-freewater5μl，总体积为20μl。42℃反应30min，85℃5sec使酶失活。2、pcr扩增及质粒构建以cdna为模板扩增目的片段，pcr程序为98℃2min预变性之后进行30个循环分别为98℃15sec，tm10sec，72℃30sec/kb，最后72℃2min彻底延伸。pcr产物经电泳后切胶回收后连接载体，将载体质粒转化至e.colidh5α，加入900μllb震荡30min，离心收集菌体留100μl菌液涂布。菌落pcr检测阳性克隆：50μl反应体系配制如下：pcr酶25μl，模板为单菌落，引物为t7/t7ter分别加入2μl。pcr反应程序按说明书进行。琼脂糖凝胶电泳检测菌落pcr产物，阳性克隆送样测序。表1克隆引物设计3、目的蛋白在大肠杆菌中表达和纯化将重组质粒转入各类感受态细胞中，在37℃培养箱培养过夜，分别挑取10个单菌落接入含有相应抗生素抗性的5mllb培养液中，摇床37℃200r/min培养12h；接菌液至400ml含抗性的lb培养液中，继续扩增至od600为0.6-0.8，添加iptg使终浓度为0.5-2mmol/ml，并继续在20℃振荡培养16至20小时后，8000rpm10min，收集菌体细胞。制备粗酶液：收集的菌体以亲和柱平衡缓冲液(ph7.4，20mmtris-hcl)重悬，重悬比例为菌体量：重悬液＝1:20(vol/vol)，在冰上经超声细胞破碎仪破碎细胞(9s，9s，99次)后，细胞碎片以11000rpm4℃离心20min2次，上清用0.22μm微孔滤膜过滤后即为粗酶液。金属螯合剂cocl2·6h2o的his-tag亲和层析：粗酶液注入亲和层析柱，然后用ph7.420mmtris-hcl及1m咪唑母液配制洗脱液开始梯度洗脱(具体咪唑洗脱浓度及体积：tris-hclbuffer20ml，5mm咪唑40ml，10mm咪唑20ml，20mm咪唑20ml，40mm咪唑20ml，60mm咪唑10ml，150mm咪唑30ml)。收集洗脱液以sds-page电泳检测蛋白质纯度。收集纯蛋白，用截留分子量为3/10kda的超滤膜进行浓缩。亲和层析柱再生步骤：在金属离子亲和层析之前对talonhis-tag纯化钴离子树脂(takara，jpn)进行再生，以5-10v(v:柱体积)0.2medta(ph7.0)洗脱柱子，蒸馏水洗脱10v，50mmcocl2缓慢洗脱10v后以蒸馏水洗脱，以300mmnacl洗脱柱子有助于co2+的结合，再次用蒸馏水洗脱，最后以70％c2h5oh洗脱，20％c2h5oh保存亲和层析柱。4、最适反应条件测定木聚糖酶的酶活采用dns定糖法测定，550nm处测定最终反应的光密度值，计算酶从底物山毛榉木聚糖(xylanfrombeechwood)释放还原糖的量。反应体系为20μl底物中加入80μl稀释后的酶液，于最适温度反应10min后，立刻加入80μldns试剂于100℃煮沸10min后测定其分光光度值。一个酶单位(iu)定义为在该反应条件下，1min内催化产生1mmol木糖所需要的酶量。每个反应重复三次。用木糖作标准曲线。阿拉伯呋喃糖苷酶的酶活的检测同样采用dns比色法进行测定，测定该酶从底物pnpaf释放对硝基苯酚(pnp)的量。反应体系为200μl,其中有50μl2mmol/l底物pnpaf、100μl离子浓度50mmph5.0的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液、50μl酶液，于最适温度反应10min后，立刻加入50μl的1m碳酸钠溶液终止反应并显色，在420nm处测量其分光光度值。一个酶单位(iu)定义为在该反应条件下，1min催化产生1μmolpnp所需的酶量。每个反应重复三次。用对硝基苯酚作标准曲线。其它pnp底物的底物特异性测定均以上述体系添加。以不同ph值缓冲液(50mmna2hpo4-citricacid，ph2.0-10.0)配制底物(1％bewx,2mmpnpaf)，在50℃下测定不同ph值对酶活力的影响，相对酶活力以最高活力为100％，作ph活性曲线。以最适ph值缓冲液配制底物，在25-70℃之间每5℃分别测定酶活，相对酶活力以最高活力为100％，作温度活性曲线。ph稳定性的测定为以不同ph值缓冲液稀释酶液并在50℃孵育30min，以最适条件测定残余酶活，以在0℃下保温30min的酶液酶活为100％。测定酶活的温度稳定性是将酶液在40、50、60、70℃下保温10min至2h，间隔一定时间后取出置于冰浴10min，以最适反应条件测定酶活，以未处理的样品酶液酶活为100％计算相对酶活值。5、荧光辅助糖电泳技术表征酶解产物谱荧光辅助糖电泳(fluorescence-assistedcarbohydrateelectrophoresis,face)可以表征寡糖谱。制样步骤：5μl样品(或marker)加入5μl以15％醋酸配制的0.2m7-氨基-1,3-萘二磺酸单钾盐一水合物(7-amino-1,3-naphthalene-disulfonicacidmonopotassiumsaltmonohydrate,ands)于暗处反应1h，此时糖醛基与ands形成不稳定的希弗碱结构，加入5μl二甲基亚砜配制的1mnacnbh3混合后于42℃反应3h以上，使得希弗碱还原成稳定的仲胺结构，最后加入等体积的50％蔗糖。face电泳浓缩胶胶浓度为35％，制备的样品上样体积为7μl/孔。用凝胶成像仪进行荧光成像。实施例二利用不同的酶系对小麦阿拉伯木聚糖进行降解采用实施例1的材料和方法，申请人从黑曲霉(aspergillusniger)an76中克隆并重组表达了8种木聚糖降解相关的酶，获得了纯化的蛋白。其中，重组质粒构建方式如下表所示：目的基因载体酶切位点表达菌株an_axhapet-32abamhi/hindiiirosettagami(de3)an_abfbpet-32abamhi/hindiiirosettagami(de3)an_xynapet-28andei/ecoribl21(de3)an_xynbpet-28a无,caccbl21(de3)an_xyndpet-28a无,caccbl21(de3)an_xlnbpet-28a无,caccbl21(de3)an_xlndpet-28a无,caccbl21plyssan_xyncpet-28a无,caccbl21(de3)8种木聚糖降解相关的酶分别为：β-内切木聚糖酶an_xyna、β-内切木聚糖酶an_xynb、β-内切木聚糖酶an_xync、β-内切木聚糖酶an_xynd、阿拉伯呋喃糖苷酶an_axha、阿拉伯呋喃糖苷酶an_abfb、β-木糖苷酶an_xlnd、β-木糖苷酶an_xlnb，其氨基酸序列分别如seqidno.1-8所示，图1示出了各重组酶的纯化电泳图谱。对各木聚糖降解酶的酶活性质进行测定，如图2所示，除an_xlnd的最适ph为4.0外，其余重组酶的最适ph都是5.0，最适温度都在50℃左右。利用上述酶系对小麦阿拉伯木聚糖(wax,购自megazyme)进行降解，结果显示：当使用β-内切木聚糖酶不同的同工酶(an_xyna、an_xynb、an_xync、an_xynd)在50℃分别水解wax30min后，向反应体系中再加入β-木糖苷酶an_xlnd继续水解，对产物谱进行展示分析，结果如图3所示。结果显示大量寡糖不能被完全水解，an_xlnd只水解了an_xyna、an_xynb和an_xync产物谱中x2位置的寡糖，相反，an_xynd产物谱显示x4以下的寡糖都被水解。对an_xlnb和an_xlnd单独处理wax的效果进行检验，结果如图4所示：除主要产物单糖外，an_xlnb产生更多种类带侧链的寡糖，而an_xlnd主要产生单糖和一种带侧链寡糖。这表明an_xlnd对木聚糖的侧链具有更大的容忍性，an_xlnd对wax的水解效率高于an_xlnb。进一步利用阿拉伯呋喃糖苷酶对wax进行处理，如图5a所示，在反应体系中先加入阿拉伯呋喃糖苷酶an_abfb在50℃下水解wax30min，再添加an_xlnd组分同样条件反应30min，则可以使木聚糖底物完全水解；加入an_abfb在50℃下水解wax30min后，再加入β-内切木聚糖酶不同的同工酶(an_xyna、an_xynb、an_xync或an_xynd)同样条件反应30min，之后再添加an_xlnd同样条件反应30min，也可以使wax水解较为完全。相反的，如果先添加阿拉伯呋喃糖苷酶an_axha在50℃下水解wax30min后添加β-内切木聚糖酶不同的同工酶(an_xyna、an_xynb、an_xync或an_xynd)同样条件反应30min，或者之后再添加an_xlnd的水解体系中，50℃反应30min后，wax水解并不完全(图5b)。反之，如果将an_axha在50℃处理wax30min后的水解产物中加入an_abfb，相同条件反应30min，再依次加入an_xynb和an_xlnd分别水解30min且保持底物浓度不变，发现终产物基本只有单糖存在，水解效率明显比只加入单一的an_axha的效果好(图5c)。以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。序列表<120>一种降解小麦阿拉伯木聚糖的复合酶系及其应用<160>8<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>195<212>prt<213>黑曲霉(aspergillusniger)<400>1alaproalaproglyprovalleuvalserargseralaglyileasn151015tyrvalglnasntyrasnglyasnleuglyaspphethrtyraspglu202530seralaglythrphesermettyrtrpgluaspglyvalserserasp354045phevalvalglyleuglytrpthrthrglyserserasnproilethr505560tyrseralaasptyrseralaserglysersersertyrleualaval65707580tyrglytrpvalasntyrproglnalaglutyrtyrilevalgluasp859095tyrglyasptyrasnprocysserseralathrserleuglythrval100105110tyrseraspglyserthrtyrglnvalcysthraspthrargthrasn115120125gluproserilethrglythrserthrphethrglntyrpheserval130135140arggluserthrargthrserglythrvalthrvalalaasnhisphe145150155160asnphetrpalaglnhisglypheglyasnserasppheasntyrgln165170175valvalalavalglualatrpserglyalaglyseralaservalthr180185190ileserser195<210>2<211>207<212>prt<213>黑曲霉(aspergillusniger)<400>2valprohisaspservalvalgluargseraspalaleuhislysleu151015sergluargserthrproserserthrglygluasnasnglyphetyr202530tyrserphetrpthraspglyglyglyaspvalthrtyrthrasngly354045aspalaglysertyrthrvalglutrpserasnvalglyasnpheval505560glyglylysglytrpasnproglyseralaglnaspilethrtyrser65707580glythrphethrproserglyasnglytyrleuservaltyrglytrp859095thrthraspproleuileglutyrtyrilevalglusertyrglyasp100105110tyrasnproglyserglyglythrtyrlysglythrvalthrserasp115120125glyservaltyraspiletyrthralathrargthrasnalaalaser130135140ileglnglythralathrphethrglntyrtrpservalargglnasn145150155160lysargvalglyglythrvalthrthrserasnhispheasnalatrp165170175alalysleuglymetasnleuglythrhisasntyrglnilev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