一种用于鉴别不同茭白类型的分子标记、引物对、试剂盒及方法与流程

本发明涉及分子鉴定
技术领域：
，特别是涉及一种用于鉴别不同茭白类型的分子标记、引物对、试剂盒及方法。
背景技术：
：茭白是多年水生宿根性草本植物，无性繁殖，由茭白黑粉菌(ustilagoesculenta)专化性寄生于菰草(zizanialatifoliaturcz.)，并与其互作形成的膨大结构，称为茭白。茭白的营养价值高，其中含有丰富的蛋白质，糖类，脂肪，微量的胡萝卜素，维生素b1，维生素b2，维生素e以及多种矿物质，易被我们的人体消化吸收。茭白还具有药用价值，具有清热解毒的功效。它已成为我国重要的特色水生蔬菜之一，栽培面积超过百万亩，有着大量的需求和广阔的市场。茭白黑粉菌具有独特的生活史，它以菌丝体形式长期存活在寄主中，是黑粉菌属中唯一侵染寄主根茎的黑粉菌，具有独特的生物学属性。茭白黑粉菌菌丝分布在根、茎和叶鞘等组织中，随着植物的生长，菌丝向上扩展，但达到茎顶端分生组织的细胞中，侵入分生组织导致寄主不能开花结果，可诱使茎上部产含有白色菌丝的生膨大结构，称为茭白。然而，一些膨大组织中的菌丝产生黑色冬孢子，称为灰茭。灰茭由于具有冬孢子，失去了商品价值。产生灰茭的植株如果用于苗的繁殖，仍然在下一季产生灰茭。在另外条件下，黑粉菌不能侵染寄主，或寄主逃脱了茭白黑粉菌的侵染，菰草种不含有真菌，植物生长明显高于茭白植物，这些植物称为雄茭。生产上，茭白在田间存在三种类型。但雄茭是在早期苗生长阶段就能辨认。由于雄茭没有被黑粉菌侵染，生长迅速，高于茭白和灰茭植株，在早期阶段从外观上可进行判断。然而，茭白和灰茭在早期阶段不能从外观上区分。茭白田中存在大量灰茭，直接影响茭白产量，急需早期诊断灰茭的技术手段。技术实现要素：本发明提供了一种用于鉴别不同茭白类型的分子标记，利用该分子标记设计了一对引物，能够通过pcr的方法进行早期鉴别灰茭植株的技术。一种用于鉴别不同茭白类型的分子标记，所述分子标记为茭白黑粉菌pra1基因的片段，核苷酸序列如seqidno.1所示。黑粉菌通过交配基因的融合进行有性繁殖，成功交配后形成双核菌丝，侵染寄主。双菌丝需在寄主体内大量营养繁殖后，才能形成有性冬孢子。茭白黑粉菌交配型基因由a位点和b位点控制：a位点的基因主要是编码信激素和信激素受体基因，控制细胞的融合；b位点涉及双核菌丝发育和侵染。当一个细胞含有a1(mfa1和pra1)，而另外一个细胞含有a2(mfa2和pra2)，它们才能交配。然后，我们最近研究发现，茭白黑粉菌a位点有3对等位基因，即a1(mfa1和pra1)、a2(mfa2和pra2)或者a3(mfa3和pra3)，pra1仅存在灰茭中(表1)。因此，可以得出，灰茭黑粉菌和正常茭白的茭白黑粉菌在pra1的基因型有很大差别，具体可见表1。表1本发明又提供了一种用于鉴别不同茭白类型的引物对，包括上游引物和下游引物，序列为：上游引物pra1-f：5’-ccacggcgaataaggctc-3’；下游引物pra1-r：5’-gcaaggttcaaagcccag-3’。本发明又提供了所述的引物对在鉴别茭白为灰茭或正常茭白中的应用。本发明又提供了一种用于鉴别不同茭白类型的试剂盒，包含所述引物对。优选的，所述的试剂盒，还包括dna提取试剂和pcr扩增用的试剂。本发明还提供了一种鉴别不同茭白类型的方法，包括以下步骤：(1)提取待检测茭白样品的dna；(2)以步骤(1)提取的dna作为模板，利用所述引物对进行pcr扩增；(3)电泳检测pcr扩增产物，如电泳检测结果出现475bp的dna条带，则待检测茭白样品为灰茭；否则为正常茭白。优选的，待鉴别的茭白处于幼苗期。由于幼苗期的茭白从外观上无法区分类型，所以对幼苗期待茭白鉴定具有较大价值，鉴定为正常茭白的，可以保留，否者一般需要去除，以免影响产量。更优选的，待检测茭白样品为茭白幼苗的节间菌丝。优选的，pcr扩增反应体系为：优选的，pcr扩增条件为：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。本发明通过研究，利用黑粉菌在不同类型茭白中寄生时的不同特性，开发出一种用于鉴别不同茭白类型的分子标记，所述分子标记为茭白黑粉菌pra1基因的片段，并设计出相应的引物对，利用该引物对通过pcr扩增方法能够鉴别出是灰茭还是茭白，鉴别结果稳定性好、特异性高，可在幼苗期就能够不同类型的茭白区分出来。附图说明图1为pcr扩增产物的电泳检测结果图，其中泳道m为标准分子量marker，泳道1为灰茭样品，泳道2为正常茭白样品。具体实施方式实施例11、引物设计根据ncbi下载的茭白黑粉菌pra1核酸序列设计引物，得到引物对。引物对，包括上游引物和下游引物，序列如下：上游引物为5’-ccacggcgaataaggctc-3’；下游引物为5’-gcaaggttcaaagcccag-3’。2、dna提取田间茭白幼苗基因组dna的提取(采用上海生工生物有限公司ezup柱式真菌基因组dna抽提试剂盒)a.dna的抽提1.取菌丝用液氮研磨成粉末，加入1.5ml离心管中。加入200μlbufferdigestion和2μlβ-巯基乙醇，再加入20μlproteinasek溶液，震荡混匀。56℃水浴1h至细胞完全裂解。b.加入100μlbufferpf，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。c.室温10000rpm离心5min，将上清转移到新的1.5ml离心管中。d.加入200μlbufferbd，充分颠倒混匀。e.加入200μl的无水乙醇，充分颠倒混匀。f.将吸附柱放入收集管中，用移液枪将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。g.将吸附柱放回收集管，加入500μlpwsolution，1000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。h.将吸附柱放回收集管中，加入500μlwashsolution，10000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。i.将吸附柱重新放回收集管中，于12000rpm室温离心2min，离去残留的washsolution。j.取出吸附柱，放入一个新的1.5ml离心管中，加入50μltebuffer静置3min，12000rpm室温离心2min，收集dna溶液。k.使用紫外分光光度计nanodrop检测dna纯度，od260/od280>1.8的dna样品用于后续pcr扩增，于-20℃冰箱贮藏备用。3、pcr扩增pcr反应液组成：2×taqmastermix(dyeplus)25μl，上下游引物对各2μl，300ng/μl模板dna10μl，ddh2o11μl。扩增反应在pcr仪(eppendorfag，德国)上进行。扩增条件：94℃预变性4min；94℃变性30s，63℃退火30s，72℃延伸20s，共30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。4、琼脂糖凝胶电泳跑胶检测取pcr扩增产物5μl，点样于1％的琼脂糖凝胶上样孔，使用dnamarkerd100～2000bp(上海生工生物有限公司)，于1×tae缓冲液，4v/cm电压下跑电泳30min。电泳结束后，用凝胶成像系统观察对应条带结果。按照上述方法，分别对表1中所示的样品进行检测鉴定，结果见图1。表2幼苗编号及名称。表2编号田间幼苗1灰茭幼苗2茭白幼苗如图1所示，灰茭幼苗的dna中扩增出了一条清晰明亮，分子量大小为475bp的特异性dna条带，而正常茭白的幼苗dna，未见有475bp的特殊dna条带产生，也未见有其他目的条带产生，几次重复实验结果相同，可见本发明开发出的分子特异性标记用于茭白的鉴别，其稳定性、特异性非常高。序列表<110>浙江大学<120>一种用于鉴别不同茭白类型的分子标记、引物对、试剂盒及方法<160>3<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>475<212>dna<213>茭白黑粉菌(ustilagoesculenta)<400>1ccacggcgaataaggctccaggcttttgcgaaataagtaagctcacaatttatgaatcac60tcctcatcggcatcctcgctcattatgatttactttgcgttgctattttacaggcatccg120attgcggcatgcgttgtttgtcgccatccctgcctccaaccttgtcatcgcacgaaaatt180agagagcatagcatcgaccagacaagttcgagccagcgcagcagaccgaaagaagtcggt240catcatcgatctactcatatcggttggcgtgccagtcatttatgtctcgcttatgattgt300aaatcaatctaatcgttacggtatcgtcgaggaggctggatgctggcccattcttgtacc360ttcttgggtctgggtcttgcttgtcgcggtaccagttgtcctcatatccctttgctcggc420cgtatacagtggtaagtgcagctgatcgccccatcccctgggctttgaaccttgc475<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ccacggcgaataaggctc18<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificial)<400>3gcaaggttcaaagcccag18当前第1页12