疟原虫基因诊断引物的制作方法

本发明涉及生物检测及鉴定领域，尤其涉及一种能够快速和准确地检测与鉴定疟原虫感染的引物组，包括了疟原虫属、恶性疟、间日疟和卵形疟感染诊断的引物组。
背景技术：
：在疟疾流行的国家，快速和准确地诊断疟疾是一项艰巨的挑战。不同的疟原虫引起的疟疾临床表现不一样，治疗方案不同，因此，疟疾诊断要求准确到虫种。在我国，许多输入性疟疾感染涉及两个或多个虫种，这些混合感染经常忽视或被低估。混合感染检测的失败导致疟疾治疗不充分，并可能导致疾病的加重及严重的并发症。因此，亟需开发一种可行的、简便、快速、高灵敏度和种属特异性强的疟疾诊断方法。目前，临床常用的疟疾的诊断方法是血涂片的显微镜检。如果寄生虫密度很高，这种镜检法具有相对较高的灵敏度和特异性并且能够确定疟原虫种及虫体的发育阶段。但该检测方法比较繁琐，工作量大，需要经过训练的专业人员操作，尤其是低原虫密度、经过治疗之后的疟疾诊断对技术熟练程度要求很高，出现误诊的几率大，尤其是在疟原虫密度通常较低的流行区，误诊常常导致治疗上的延误。在一些标准实验诊断无法开展的地区，为了提高疟疾诊断的速度和精确性，研究者们开发了基于免疫反应的疟疾快速诊断试验(rdt)。然而，产品间的灵敏度有波动，并且只有对恶性疟原虫的种特异性诊断的产品。因此，这种状况可导致假阴性的结果或不可靠的种诊断。后来，研究人员开发出用于疟疾诊断的基于dna扩增技术的分子生物学方法，如巢式pcr和实时定量pcr。与显微镜相比，这些方法被证明对于混合感染具有较高的灵敏度和较好的特异性。然而，这种诊断方法耗时长，价格昂贵，需要完善的实验检测设备及专业的技术人员，从而限制了该项技术在疟疾流行区、基层医疗卫生机构中的应用。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)是近年来新发展起来的一种恒温核酸扩增技术。lamp法的特征是针对目标dna链上的六个区段设计四个不同的引物，然后再利用链置换反应在一定温度下进行反应。反应只需要把基因模板、引物、链置换型dna合成酶、基质等共同置于一定温度下(60～65℃)、经一个步骤即可完成。扩增效率极高，可在15分钟至1小时内实现109-1010倍的扩增，达到能够监测的效果。因此，不需要昂贵的pcr仪器，只需简单的恒温设施比如水浴锅就可以完成。结果判读可以肉眼观察浑浊度或者在产物中加入荧光染料,通过颜色变化来观察结果，简单的紫外灯或者在自然光下观察即可,不需要额外增加步骤。其具有简单、快速、高度灵敏、特异性强，无需特殊设备、对模板要求不高的特点。这些独特的优势使其更能为广大医务工作者所接受，而被推广。与pcr相当，检出的原虫密度更低。该方法对于操作人员的要求低，无需特殊训练即可完成。目前，国内市场除了免疫学诊断方法，没有敏感性更高、能方便地在基层开展应用的临床快速诊断试剂盒。技术实现要素：为解决上述问题，亟需开发灵敏、特异、操作简单的符合我国流行特点的疟原虫感染诊断方法，该方法不同于镜检法、免疫学诊断法及pcr法等其他常用疟疾诊断方法。本发明的目的是提供灵敏、高效、操作简便的lamp诊断引物，用来确定人血标本中是否有疟原虫感染或确定是否为恶性疟、间日疟或卵形疟三个具体虫种中的任一种或多种感染，能够为中国疟疾流行区的诊断及治疗赢得宝贵时间，为实现疟疾的防控及消除提供帮助。为解决以上问题，本发明应用恒温核酸扩增技术——环介导等温扩增(lamp)技术实现高敏感性和特异性检测疟原虫感染的目的。在通过查找疟原虫属及恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫高度特异、保守的基因核苷酸序列，应用相关引物设计软件设计引物，并通过人工分析、实验确认，最终筛选出具有高度特异性及灵敏度的最佳引物组。应用发明人设计的疟原虫基因诊断引物组，能够快速、简易、准确地检测是否有疟原虫属寄生虫感染，并能确定是否为恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫中的某一种或多种寄生虫感染。即，本发明可提供下属的第1至6项描述的内容。1.疟原虫基因诊断引物用于同时或分别检测或鉴定疟原虫属和/或恶性疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫中的一种或多种疟原虫的感染；疟原虫基因诊断引物是含有seq1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtdna基因序列的特定区域；含有seq7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增恶性疟原虫actini基因序列的特定区域；含有seq13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增间日疟原虫18srrna基因序列的特定区域；含有seq19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增卵形疟原虫ssurrna基因序列的特定区域。2.根据第1项所述的用途，使用一个引物组来检测或鉴定疟原虫属的感染，该引物组包含含有seq1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtdna基因序列的特定区域。3.根据第1项所述的用途，使用一个引物组来检测或鉴定恶性疟原虫的感染，该引物组包含含有seq7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增恶性疟原虫actini基因序列的特定区域。4.根据第1项所述的用途，使用一个引物组来检测或鉴定间日疟原虫的感染，该引物组包含含有seq13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增间日疟原虫18srrna基因序列的特定区域。5.根据第1项所述的用途，使用一个引物来检测或鉴定卵形疟原虫的感染，该引物组包含含有seq19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增卵形疟原虫ssurrna基因序列的特定区域。6、疟原虫基因诊断引物，含有seq1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组；含有seq7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组；含有seq13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组；含有seq19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组。本发明的有益效果本发明允许使用lamp引物组，其中该引物组包含含有seq1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtdna基因序列的特定区域；含有seq7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增恶性疟原虫actini基因序列的特定区域；含有seq13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增间日疟原虫18srrna基因序列的特定区域；含有seq19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增卵形疟原虫ssurrna基因序列的特定区域。从而允许同时或分别检测或区分任何人疟原虫感染或三种疟原虫之一的有无。使用本发明的疟原虫属或三种疟原虫的检测/鉴定方法，能够检测疟疾感染患者使用疟疾治疗药物的治疗效果。附图说明图1显示了lamp靶标的位置，疟原虫属(a：mtdna)、恶性疟原虫(b:pfactini)、间日疟原虫(c:pv18srrna)、卵形疟原虫(d:possurrna)的引发位点以及疟原虫属mtdna基因、恶性疟原虫actin基因、间日疟原虫18srrna基因、卵形疟原虫ssurrna基因的核苷酸序列，引物组引发位点的位置均用箭头表示。其中，基因核苷酸参考序列如下：疟原虫属mtdna基因包括恶性疟原虫mtdna基因(genbank登记号m99416.1)、间日疟原虫mtdna基因(genbank登记号kf68441.1)、卵形疟原虫mtdna基因(genbank登记号hq712052.1，hq712053.1，)、三日疟原虫mtdna基因(genbank登记号ab489194.1)、诺氏疟原虫mtdna基因(genbank登记号ay722797.1),恶性疟原虫actini基因(genbank登记号xm_001350811.1)，间日疟原虫18srrna基因(genbank登记号dq162604.1)，卵形疟原虫ssurrna基因(genbank登记号jf894405.1，jf894406.1)。具体实施方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。实施例1通过在genebank中调取相关特异、保守基因的序列进行比对，选取200bp至500bp长度的保守基因片段，运用lampdesigner1.15(premierbiosoft)软件设计出多组引物，通过人工比对、试验筛选出最高效、敏感的引物组。序列特异性引物组包括含有seq1至6表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增疟原虫属mtdna基因序列的特定区域；含有seq7至12表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增恶性疟原虫actini基因序列的特定区域；含有seq13至18表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增间日疟原虫18srrna基因序列的特定区域；含有seq19至24表示的核酸序列的寡核苷酸组，用于扩增卵形疟原虫ssurrna基因序列的特定区域，详细见表1。表1序列表序号名称引物序列(5'to3')碱基数seq1mt-f3tgtcaactaccatgttacgac21seq2mt-b3aacggtcctaaggtagcaa19seq3mt-fiptacggcccgacggtaagatcgtaaccatgccaacac36seq4mt-bipaggagtctcacactagcgacaaaattccttgtcgggtaatctc43seq5mt-lpfctgagcaccttaacttccctaa22seq6mt-lpbtacaccgttcatgcaggac19seq7pfact1-f3ggagaagaagatgttcaagc20seq8pfact1-b3cccaattcgtaacaataccatg22seq9pfact1-fipaacggaacgaggtgcatcatttgttgacaacggatcagg39seq10pfact1-bipagtaggaagaccaaagaatccaggatgtgcttcatcaccaacaa44seq11pfact1-lpfctcctgcaactcctgctt18seq12pfact1-lpbgttggtatggaagagaaagatgc23seq13pv18s-f3ctaattagcggtaagtacgaca22seq14pv18s-b3agcctagttcatctaaggaca21seq15pv18s-fipaccaaacgcatcagctattcgtatgtcggattggatctgga41seq16pv18s-bipttacttggcttatcgtaccgttcagacctgttgttgcctt40seq17pv18s-lpfcaccgacacgaagtataattgc22seq18pv18s-lpbgcttcttagaggaacgatgtgt22seq19p0ssu-f3cgagtttctgacctatcagc20seq20p0ssu-b3gctggcaccagacttg16seq21p0ssu-fipgatgtggtagctatttctcaggctccctaacatggctatgacgg44seq22p0ssu-bipgcagcaggcgcgtaaattacaaccatgaaatggccttgt39seq23p0ssu-lpftctccggaatcgaactctaattc23seq24p0ssu-lpbtctaaagaagagaggtagtgacaag25实施例2lamp反应体系的建立1、材料和方法：2016年至2018年间，对466例疟疾疑似病例血液样本。标准株3d7、dd2，诺氏疟原虫strainh株dna(由mr4/atcc(manassas,va)提供)。弓形虫、日本血吸虫dna由昆明医科大学寄生虫教研室提供。2、dna模板制备使用rochehighpurepcrtemplatepreparationkit，取虫血进行dna模板制备。巢式pcr反应：引物及反应条件参考已经发表文献(孙凌聪,张华勋,裴速建,夏菁,吴冬妮,林文:湖北省首例输入性卵形疟原虫wallikeri亚种的病原学诊断分析.国际检验医学杂志2016,37:1956-1958.)3、lamp反应使用引物组包含含有seq1至6的引物组；seq7至12的引物组；seq13至18的引物组；seq19至24的引物组，使用lamp反应体系如表2所示。每个引物的位置和核苷酸序列显示在图1中。表2.使用lamp反应体系4、扩增反应将已配制好的12.5μl反应体系置于pcr仪或金属浴中，在63℃下恒温45min，再在80℃下5min使酶灭活以终止反应。5、检测扩增反应结束后，将反应管置于紫外线照射装置中观察。若与阳性对照一样发出绿色荧光，则判断为阳性(+)，若与阴性对照一样未发出荧光，则判断为阴性(-)。实施例3特异性试验对其他种寄生虫及不同疟原虫种进行试验，分析其特异性。使用seq1至6的引物组；seq7至12的引物组；seq13至18的引物组；seq19至24的引物组分别对日本血吸虫、弓形虫dna进行lamp反应，结果为阴性。使用seq1至6的引物组；seq7至12的引物组；seq13至18的引物组；seq19至24的引物组分别对五种疟原虫恶性疟原虫(pf),间日疟原虫(pv),卵形疟原虫包括plasmodiumovalecurtisi(poc)和plasmodiumovalewallikeri(pow)两个亚种,三日疟原虫(pm)，诺氏疟原虫(pk)的dna进行lamp反应，结果如下：疟原虫属mtdna基因包含含有seq1至6的引物组对弓形虫、日本血吸虫无法扩增，对间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫以及恶性疟原虫均有效。恶性疟原虫actini基因包含含有seq7至12的引物组对弓形虫、日本血吸虫、间日疟原虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫均无法扩增，只对恶性疟原虫有效。间日疟原虫18srrna基因包含含有seq13至18的引物组对弓形虫、日本血吸虫、卵形疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫以及恶性疟原虫均无法扩增，只对间日疟原虫有效。卵形疟原虫ssurrna基因包含含有seq19至24的引物组对弓形虫、日本血吸虫、间日疟原虫、三日疟原虫、诺氏疟原虫以及恶性疟原虫均无法扩增，只对卵形疟原虫有效。实施例4敏感性试验对临床样本进行原虫计数，dna提取及稀释，当原虫密度为3.8(2.0-7.0)parasites/μl时，使用seq1至6的引物组对五种疟原虫的lamp反应结果为阳性；使用seq7至12的引物组对恶性疟原虫的lamp反应结果为阳性；使用seq13至18的引物组对间日疟原虫的lamp反应结果为阳性；seq19至24的引物组对卵形疟原虫的lamp反应结果为阳性。构建质粒转化大肠杆菌，提取dna，按109-101倍比稀释，同时进行nested-pcr与lamp试验，比较两种方法的检测极限差异，分析其敏感性。结果如下：疟原虫属mtdna基因使用质粒进行试验，lamp的检测极限可以达到102copy/μl，而nested-pcr只能达到104copy/μl。恶性疟原虫actini基因使用质粒进行试验，lamp的检测极限可以达到102copy/μl，而nested-pcr只能达到103copy/μl。使用疟疾病人血样进行试验，nested-pcr与lamp反应的检测极限相近，lamp反应可达到2.9(95％ci1.4–6.0)疟原虫/μl血。间日疟原虫18srrna基因使用质粒进行试验，lamp的检测极限可以达到102copy/μl，而nested-pcr只能达到104copy/μl。卵形疟原虫ssurrna基因使用质粒进行试验，lamp的检测极限可以达到103copy/μl，而nested-pcr只能达到104copy/μl。上述结果证明，我们的引物组可以监测疟原虫感染的敏感性高于nested-pcr。临床样本对疟疾疑似病人样本进行dna提取，同时进行nested-pcr与lamp试验。与临床镜检结果及目前公认的实验室标准nested-pcr结果比较，分析引物lamp反应的敏感度、特异度等。病人样本试验结果如下：疟原虫属mtdna基因275例临床疟疾疑似病人样本，巢式pcr检出237例疟疾感染，该组引物的lamp反应检出也为237例，结果完全一致。恶性疟原虫actini基因466例临床疟疾疑似病人样本巢式pcr检出251例恶性疟原虫感染，该组引物的lamp反应检出253例恶性疟原虫感染，只有2例结果不一致。这2例病人，经过临床诊断性治疗，确诊疟疾。间日疟原虫18srrna基因273例临床疟疾疑似病人样本巢式pcr检出87例间日疟原虫感染，该组引物的lamp反应检出也为87例间日疟原虫感染，结果完全一致。卵形疟原虫ssurrna基因274例临床疟疾疑似病人样本巢式pcr检出58例卵形疟原虫感染，该组引物的lamp反应检出为57例卵形疟原虫感染，结果只有1例样本不一致。本发明的发明人研发的使用lamp检测/鉴定疟原虫属和三种疟原虫的引物较显微镜检具有更高的灵敏度和更高的特异性，且与pcr相比能够在较短时间内更容易地检测/鉴定病人血样中的疟原虫。实施例3中包含含有seq1至6的引物组，只对疟原虫属的有效；包含含有seq7至12的引物组只对恶性疟原虫有效；包含含有seq13至18的引物组只对间日疟原虫有效；包含含有seq19至24的引物组只对卵形疟原虫有效，证明了其特异性；当原虫密度较低时，本发明的引物组也可检出，并且使用质粒进行试验，lamp的检测极限高于nested-pcr。综上所述，根据本发明的用于检测疟原虫属和疟原虫种的引物组,和使用该引物组分别或同时检测或鉴定疟原虫属、恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫和卵形疟原虫的方法,特别是在疟疾流行区,可通过快速、简便和便宜的恒温水浴来进行dna扩增反应,使得能以低廉的价格处理大量样品。lamp疟原虫检测引物组达到临床疟疾的诊断要求，可以降低其诊断成本，为临床疟疾提供一个新的诊断方法。sequencelisting<110>昆明医科大学<120>疟原虫基因诊断引物<130>20190612<160>24<170>patentinversion3.5<210>1<211>21<212>dna<213>人工合成<400>1tgtcaactaccatgttacgac21<210>2<211>19<212>dna<213>人工合成<400>2aacggtcctaaggtagcaa19<210>3<211>36<212>dna<213>人工合成<400>3tacggcccgacggtaagatcgtaaccatgccaacac36<210>4<211>43<212>dna<213>人工合成<400>4aggagtctcacactagcgacaaaattccttgtcgggtaatctc43<210>5<211>22<212>dna<213>人工合成<400>5ctgagcaccttaacttccctaa22<210>6<211>19<212>dna<213>人工合成<400>6tacaccgttcatgcaggac19<210>7<211>20<212>dna<213>人工合成<400>7ggagaagaagatgttcaagc20<210>8<211>22<212>dna<213>人工合成<400>8cccaattcgtaacaataccatg22<210>9<211>39<212>dna<213>人工合成<400>9aacggaacgaggtgcatcatttgttgacaacggatcagg39<210>10<211>44<212>dna<213>人工合成<400>10agtaggaagaccaaagaatccaggatgtgcttcatcaccaacaa44<210>11<211>18<212>dna<213>人工合成<400>11ctcctgcaactcctgctt18<210>12<211>23<212>dna<213>人工合成<400>12gttggtatggaagagaaagatgc23<210>13<211>22<212>dna<213>人工合成<400>13ctaattagcggtaagtacgaca22<210>14<211>21<212>dna<213>人工合成<400>14agcctagttcatctaaggaca21<210>15<211>41<212>dna<213>人工合成<400>15accaaacgcatcagctattcgtatgtcggattggatctgga41<210>16<211>40<212>dna<213>人工合成<400>16ttacttggcttatcgtaccgttcagacctgttgttgcctt40<210>17<211>22<212>dna<213>人工合成<400>17caccgacacgaagtataattgc22<210>18<211>22<212>dna<213>人工合成<400>18gcttcttagaggaacgatgtgt22<210>19<211>20<212>dna<213>人工合成<400>19cgagtttctgacctatcagc20<210>20<211>16<212>dna<213>人工合成<400>20gctggcaccagacttg16<210>21<211>44<212>dna<213>人工合成<400>21gatgtggtagctatttctcaggctccctaacatggctatgacgg44<210>22<211>39<212>dna<213>人工合成<400>22gcagcaggcgcgtaaattacaaccatgaaatggccttgt39<210>23<211>23<212>dna<213>人工合成<400>23tctccggaatcgaactctaattc23<210>24<211>25<212>dna<213>人工合成<400>24tctaaagaagagaggtagtgacaag25当前第1页12