一种沸石咪唑酯骨架化合物制备固定化酶的方法与流程

本发明涉及固定化酶技术，适用于粮食食品安全等工业领域，具体涉及一种沸石咪唑酯骨架化合物制备固定化酶的方法。

背景技术：

酶的固定化有物理吸附法、偶联合、截留法、包埋法、交联法等。金属有机骨架化合物可以作为酶固定的载体材料。将酶吸附进预先合成的金属有机骨架化合物的孔内，虽然这种固定化酶可以通过简单的操作步骤实现，但是由于大多数金属有机骨架化合物的孔隙尺寸远小于酶的尺寸，因此通过物理吸附形成复合酶的方法具有一定的局限性，即便金属有机骨架化合物的孔径与酶的尺寸相近或更大，如果它们之间结合相对较弱，那么酶也很可能被冲洗掉，而且现有吸附法的负载率为19％左右。偶联合是通过载体与酶之间化学交联，酶与载体结合力强，但酶分子的结构容易受到影响。包埋法是将酶包在高分子凝胶或半透膜微胶囊中，但该方法容易发生化学聚合反应，导致酶活性降低。

羧肽酶是一种能有效降解ota的生物降解酶，目前人们认识清楚的只有cpa和cpb的三维晶体结构，其中羧肽酶a(carboxypeptidasea，cpa)存在于哺乳动物胰脏中，相对分子质量为34.6kda，每个酶分子含有一个zn²⁺作为辅基，酶蛋白为单一的多肽链，约有300个氨基酸残基，其分子的尺寸为5*4.2*3.8。已有相关研究证明了羧肽酶a能将赭曲酶毒素a降解为赭曲酶毒素α和l-β-苯丙氨酸。然而游离的羧肽酶a在使用过程中同时存在稳定性较差，比如热稳定性、ph值耐受范围以及对有机试剂耐受性等，而且游离的羧肽酶a降解底物后分离纯化困难，不利于回收循环利用，在实际生产应用中受到很大限制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种沸石咪唑酯骨架化合物制备固定化酶的方法。

为达到上述目的，本发明具体技术方案如下：

一种沸石咪唑酯骨架化合物制备固定化酶的方法，包括以下步骤：

(1)将2-甲基咪唑加入蒸馏水或超纯水中配置成浓度为10～210g/l的2-甲基咪唑溶液，将乙酸锌加入蒸馏水或超纯水配置成浓度为65～95g/l的乙酸锌水溶液，并配置浓度为10～20g/l的聚乙二醇水溶液；

(2)将浓度为24～28g/l的酶原液离心3～7分钟后去除上清液，然后加入步骤(1)所述聚乙二醇水溶液，超声10～20分钟，得到聚乙二醇/羧肽酶a复合物溶液；

(3)将步骤(2)所述聚乙二醇/羧肽酶a复合物溶液超滤20～40分钟，用步骤(1)中配置好的2-甲基咪唑水溶液将聚乙二醇/羧肽酶a复合物转移至2-甲基咪唑水溶液中，形成混合溶液；随后立即将步骤(1)所述乙酸锌水溶液加入到所述混合溶液中，磁力搅拌3-10分钟后静置老化5-24小时，离心收集固体产物并水洗1～3次后干燥，即可得到所述沸石咪唑酯骨架化合物制备的固定化酶。

优选地，步骤(2)所述酶原液为牛胰羧肽酶a酶原液(相应得到的固定化酶为沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a)。

优选地，步骤(1)所述2-甲基咪唑水溶液的浓度为13～198g/l，所述乙酸锌水溶液的浓度为70～88g/l。

优选地，所述2-甲基咪唑、乙酸锌、酶原液和聚乙二醇的质量比为106～4:9～30:1～2:1。

优选地，步骤(3)所述干燥为-30～-50℃冷冻干燥40～60小时，或室温下自然干燥20～30小时。

优选地，所述离心的转速为8000～12000r/min。

本发明的工作原理：氨基酸具有与ca²⁺和zn²⁺等有机阳离子相互作用的能力，从而导致生物矿化。在晶体生长过程中，羧肽酶a的酰胺键与zn²⁺相互作用，调节沸石咪唑酯骨架化合物与酶的嵌入方式。分子间的氢键和疏水键相互作用，其中生物大分子(酶)对有机分子(咪唑)的亲和力起着至关重要的作用。此外，合成条件也影响酶周围形成的多孔骨架化合物的形态。

本发明的有益效果：

生物仿生矿化法制备的固定化酶可以最大程度上保证酶的稳定性，防止酶的浸出，最大限度地保证酶的重复使用性，有助于降低工艺成本。另一个显著的优势是对酶的大小没有限制，即使是对于尺寸大于金属有机骨架化合物孔径的酶，也可以通过这种方法将酶固定在载体材料上。

酶固定化后，酶的储存时间增加。游离羧肽酶a储存两个月后的剩余活性为4％，沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物储存两个月后的剩余活性为52.43％。50％的乙醇/磷酸盐缓冲液中，沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物的剩余活性为93.11％，而游离酶仅有12.42％。沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物循环使用7次后的活性仍能保持97％，而游离羧肽酶a在循环使用7次后的剩余活性只有62.47％。

本发明操作简单，经济高效，固定后酶的性质稳定，重复利用性高，并且本发明沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a的负载率达到了70％。

附图说明

图1中a、c和e分别是对照例1-3合成的沸石咪唑酯骨架化合物电镜图，图b、d和f是实施例1-3合成的沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物；

图2a为对照例1和实施例1合成的化合物和复合物的傅里叶红外光谱图，图2b为对照例2和实施例2合成的化合物和复合物的xrd图，图2c为实施例3合成的复合物的tga图；

图3的a、b、c分别为实施例1-3的游离羧肽酶a和沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物催化底物分解生成产物图；

图4中图a为储存天数对对照例1的游离羧肽酶a和实施例1的沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物的影响图；图b为不同比例的乙醇含量对对照例1的游离羧肽酶a和实施例1的沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物的影响图；

图5为温度对对照例2的游离羧肽酶a和实施例2的沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物的影响图；

图6为实施例3的沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物和对照例3的游离羧肽酶a循环使用次数的图。

具体实施方式

本发明结合具体实施例作进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方案通常可按常规条件，或按照试剂盒生产商所建议的条件进行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。

以下所述复合物均指实施例所得沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物，所述化合物为沸石咪唑酯骨架化合物。

实施例1沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物合成

(1)称取0.0657g的2-甲基咪唑加入5毫升超纯水中配置成2-甲基咪唑水溶液，取0.439g的乙酸锌加入5毫升超纯水配置成乙酸锌水溶液，配置1ml浓度为15mg/ml的聚乙二醇水溶液；

(2)用移液枪取960微升(0.025g)的酶原液放于1.5ml的离心管中离心5分钟后去除上清液，将步骤(1)配好的1ml体积的聚乙二醇水溶液加入到离心管内，超声15分钟形成聚乙二醇包裹羧肽酶a的聚乙二醇/羧肽酶a复合物溶液；

(3)将聚乙二醇/羧肽酶a复合物溶液放入超滤离心管中超滤30分钟倒掉超滤管套中的滤液，并且用步骤(1)中配置好的2-甲基咪唑水溶液冲洗超滤离心管的内衬管，直至将内衬管内的聚乙二醇/羧肽酶a复合物完全转移至2-甲基咪唑水溶液中，形成混合溶液；随后立即将步骤(1)中的乙酸锌水溶液加入到该混合溶液中，放于20毫升的小瓶中反应，并且在小瓶中放入磁转子均匀搅拌5分钟静置老化5小时后，以10000r/min离心收集固体产物和上清液待测，水洗一次后再次离心收集固体产物和水洗一次后上清液，产物冷冻干燥(-40℃，48小时)。

对照例1沸石咪唑酯骨架化合物合成

首先称取0.0657g的2-甲基咪唑加入5毫升超纯水中配制成溶液，然后再取0.439g的乙酸锌加入到5毫升水中配成水溶液。将上述配制好的两种溶液混合放于20毫升的小瓶中反应，并且在小瓶中放入磁转子均匀搅拌5分钟静置老化5小时后，以10000r/min离心收集产物，产物冷冻干燥(-40℃，48小时)。得到沸石咪唑酯骨架化合物。

实施例2沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物合成

(1)称取1.0526g的2-甲基咪唑加入8毫升超纯水中配置成2-甲基咪唑水溶液，取0.1407g的乙酸锌加入2毫升超纯水配置成乙酸锌水溶液，配置1ml浓度为15mg/ml的聚乙二醇水溶液；

(2)用移液枪取960微升(0.025g)的酶原液放于1.5ml的离心管中离心(10000r/min)5分钟后去除上清液，将步骤(1)配好的1ml体积的聚乙二醇水溶液加入到该离心管内，超声15分钟形成聚乙二醇包裹羧肽酶a的聚乙二醇/羧肽酶a复合物溶液；

(3)将聚乙二醇/羧肽酶a复合物溶液放入超滤离心管中超滤30分钟倒掉超滤管套中的滤液，并且用步骤(1)中配置好的2-甲基咪唑水溶液冲洗超滤离心管的内衬管，直至将内衬管内的聚乙二醇/羧肽酶a复合物完全转移至2-甲基咪唑水溶液中，形成混合溶液；随后立即将步骤(1)中的乙酸锌水溶液加入到该混合溶液中，放于20毫升的小瓶中反应，并且在小瓶中放入磁转子均匀搅拌5分钟静置老化24小时后，以10000r/min离心收集固体产物和上清液待测，水洗一次后再次离心收集固体产物和水洗一次后上清液，产物室温下自然干燥24小时。

对照例2沸石咪唑酯骨架化合物合成

首先称取1.0526g的2-甲基咪唑加入8毫升超纯水中配制成溶液，然后再取0.1407g的乙酸锌加入到2毫升水中配成水溶液。将上述配制好的两种溶液混合放于20毫升的小瓶中反应，并且在小瓶中放入磁转子均匀搅拌5分钟静置老化24小时后，以10000r/min离心收集产物，产物室温下自然干燥24小时。得到沸石咪唑酯骨架化合物。

实施例3沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物合成

(1)称取1.5787g的2-甲基咪唑加入8毫升超纯水中配置成2-甲基咪唑水溶液，取0.1407g的乙酸锌加入2毫升超纯水配置成乙酸锌水溶液，配置1ml浓度为15mg/ml的聚乙二醇水溶液；

(2)用移液枪取960微升(0.025g)的酶原液放于1.5ml的离心管中离心(10000r/min)5分钟后去除上清液，将步骤(1)配好的1ml体积的聚乙二醇水溶液加入到该离心管内，超声15分钟形成聚乙二醇包裹羧肽酶a的聚乙二醇/羧肽酶a复合物溶液；

(3)将聚乙二醇/羧肽酶a复合物溶液放入超滤离心管中超滤30分钟倒掉超滤管套中的滤液，并且用步骤(1)中配置好的2-甲基咪唑水溶液冲洗超滤离心管的内衬管，直至将内衬管内的聚乙二醇/羧肽酶a复合物完全转移至2-甲基咪唑水溶液中，形成混合溶液；随后立即将步骤(1)中的乙酸锌水溶液加入到该混合溶液中，放于20毫升的小瓶中反应，并且在小瓶中放入磁转子均匀搅拌5分钟静置老化10小时后，以10000r/min离心收集固体产物和上清液待测，水洗一次后再次离心收集固体产物和水洗一次后上清液，产物室温下自然干燥24小时。

对照例3沸石咪唑酯骨架化合物合成

首先称取1.5787g的2-甲基咪唑加入8毫升超纯水中配制成溶液，然后再取0.1407g的乙酸锌加入到2毫升超纯水中配成水溶液，将上述配制好的两种溶液混合放于20毫升的小瓶中反应，并且在小瓶中放入磁转子均匀搅拌5分钟静置老化10小时后，以10000r/min离心收集产物，产物室温下自然干燥24小时。得到沸石咪唑酯骨架化合物。

检测方法

1、电镜表征沸石咪唑酯骨架化合物和沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物

2、沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物和化合物表征：(1)傅里叶红外光谱(对照例1、实施例1)、(2)xrd(对照例2、实施例2)、(3)热重(实施例3、实施例3)

3、沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物和沸石咪唑酯骨架化合物活性鉴定

(1)复合物降解马尿酸-l-苯丙氨酸生成马尿酸和l-苯丙氨酸(实施例1)

实施例1合成的复合物活性鉴定，分别用游离羧肽酶a和沸石咪唑酯化合物负载羧肽酶a复合物，在25℃下催化分解马尿酸-l-苯丙氨酸相同时间，生成马尿酸和l-苯丙氨酸。并且利用高效液相色谱仪对生成的物质进行检测。检测条件：c18柱子；紫外检测器；流动相a：20mm的kh2po4，ph＝2.45；流动相b：乙腈，梯度洗脱；柱温30℃，流速1ml/min，波长210nm、进样量10ul。

(2)复合物降解赭曲酶毒素a生成赭曲酶毒素α和l-β-苯丙氨酸(实施例2)

实施例2合成的复合物活性鉴定，母液是1mg/ml的甲醇溶解的ota，用水稀释成20ppm的ota毒素溶液，羧肽酶a降解赭曲酶毒素a生成产物otα和l-β-苯丙氨酸。用沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物24h后取样100微升并且加入400微升的色谱纯甲醇充分混匀后过10kd的超滤膜收集滤液待测。检测条件：荧光检测器，(λex＝333nm，λem＝460nm)流动相为乙腈/水/乙酸(体积比＝99:99:2)，流速0.8ml/min。

(3)复合物降解z-phe-leu生成z-phe和l-亮氨酸(实施例3)

实施例3合成的复合物活性鉴定，用镉-茚三酮法测定复合物的活性。并且酶学的稳定性都用该方法测定。

磷酸钾缓冲液的配制：取0.1361g的kh2po4加入10ml的蒸馏水记为a液，取0.1742g的k2hpo4加入10ml的蒸馏水配制成b液，取4ml的a液和6ml的b液混合后加水稀释至100ml，用naoh调节ph至7.5。

反应式：z-phe-leu+h2o→z-phe+leu

将z-phe-leu底物溶于0.1mol/l，ph＝7.5的磷酸钾缓冲液中，最终浓度为8mmol/l。取1.8ml的底物溶液并加入0.2ml的稀释后的酶液，35℃的恒温水浴锅中反应，反应10min后取50μl的酶-底物的反应液，加水稀释到1ml。再加入2ml的镉-茚三酮试剂混合后用涡旋震荡仪混匀，在84℃下水浴加热5min,冷却到室温后测量507nm处的吸光值。

4、复合物和化合物的稳定性

(1)储存时间对复合物和游离羧肽酶a的影响(对照例1、实施例1)

将等量蛋白含量的复合酶和游离酶在4℃的0.1m磷酸盐缓冲溶液中(ph7.5)分别储存2、7、14、30、65天后，各自取出孵育10min后测定残余活性。固定化羧肽酶a活性与其初始活性的比率定义为残余活性。

(2)不同比例的乙醇含量对复合物和游离羧肽酶a的影响(对照例1、实施例1)

按照15％、20％、30％、40％、50％的比例配制乙醇/pbs溶液，分别用配好的溶液溶解底物z-phe-leu配成8mm的底物溶液并调节ph值至7.5，分别加入等量蛋白含量的复合酶和游离酶孵育10分钟后测定残余活性。

(3)温度对复合物和游离羧肽酶a的影响(对照例2、实施例2)

取0.066g的z-phe-leu底物加入ph为7.5的磷酸钾缓冲液20ml，取10份底物溶液每份1.8ml分别放入5只10ml的离心管中，设置以下的孵育温度25℃、35℃、45℃、55℃和65℃，各自加入游离酶和复合酶分别反应10min后，取样进行显色反应测量生成的l-亮氨酸的含量。

(4)复合物和游离羧肽酶a循环使用次数的对比(对照例3、实施例3)

将底物溶液放在超滤离心管中并加入游离酶，35℃孵育10min后，离心机转速5000r/min离心30min后取出滤液待测，然后再次加入底物溶液，孵育超滤取样，如此循环7次。将复合酶加入到底物溶液中，35℃孵育10min后离心取上清待测，取完待测样品后再次加入底物溶液进行下一次循环。

检测结果

1、电镜结果

由图1可以看出，沸石咪唑酯骨架化合物的形状受合成条件的影响，不同比例的锌离子和咪唑合成的形貌不同，实施例1中化合物的形状为片状，表面粗糙有不规则的孔洞；实施例2中合成的材料为规则的十二面体形状；实施例3中合成的材料十二面体形状没有前者规整，有些接近球形。

2、复合物和化合物表征

(1)傅里叶红外光谱

如图2a所示，曲线a、b、c分别是对照例1沸石咪唑酯骨架化合物、实施例1沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物、羧肽酶a红外光谱图。如c所示，羧肽酶a在1649cm^-1和1541cm^-1位置处对应于c＝o伸缩振动，蛋白的特征峰在1640–1660cm^-1范围内，对应于酰胺ⅰ带振动；如a所示的zif-8的红外光谱中，693cm^-1位置处的谱带对应于2-甲基咪唑环的平面外共混，在836.3cm^-1至1307.9cm^-1的范围内出现的特定峰是由于2-甲基咪唑的面内弯曲。如b是zif-8/cpa的红外光谱，它在1660cm^-1位置处有酰胺ⅰ带的特定峰出现，这是由于羧肽酶a的n-h弯曲和c-n伸缩，表明蛋白质与金属氧化物之间存在相互作用，同时将蛋白质的羰基与zif-8的zn²⁺离子配位。在晶体生长过程中，羧肽酶a的酰胺键与zn²⁺相互作用，调节zif-8与酶的嵌入方式。分子间的氢键和疏水键相互作用，其中生物大分子(酶)对有机分子(咪唑)的亲和力起着至关重要的作用。此外，酶周围形成的多孔骨架的形态也受合成条件的影响。

(2)如图2b所示，曲线e为实施例2沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物，f为对照例2沸石咪唑酯骨架化合物。从图谱中可以看出出峰位置没有发生较大变化，说明负载羧肽酶a前后，化合物的性质没有发生改变。

(3)如图2c所示，曲线是实施例3沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物的热重曲线，第一阶段温度在100℃范围内水分蒸发失重9.192％，第二阶段温度从150度至250度范围内失重8.484％，这部分失重归因于蛋白质的分解，说明羧肽酶a成功负载在沸石咪唑酯骨架化合物上。

3、复合物和化合物活性鉴定

(1)如图3a所示，马尿酸标准品的停留时间为7.2min，l-苯丙氨酸标准品的停留时间为3.3min，马尿酸-l-苯丙氨酸的停留时间为17.5min。分别用游离羧肽酶a和复合酶催化分解马尿酸-l-苯丙氨酸相同的时间，在3.3min和7.2min处均有产物峰出现。说明实施例1沸石咪唑酯骨架负载羧肽酶a复合物是有活性的。

(2)如图3b所示otα停留时间1.68min，ota停留时间4.5min。因此，实施例2沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物是有活性的。

(3)如图3c所示管a为不加复合物时取底物溶液进行显色反应后颜色为浅黄色，说明底物没有被分解，管b为加入复合物降解1小时后取样进行显色反应后颜色为粉红色，说明加入复合物，底物被降解生成了l-亮氨酸。因此，实施例3沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物是有活性的。

4、沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a的酶学性质

(1)储存时间对复合物和游离羧肽酶a的影响(对照例1、实施例1)

如图4a所示游离羧肽酶a在保存两个月后活性降低为4％，然而沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物保存了原有活性的一半，残余活性达到52.43％。当复合酶和游离羧肽酶a同时在磷酸钾缓冲液中贮存7天后，复合酶活性下降至89.75％，游离羧肽酶a活性比复合酶活性多降低了14.93％。继续储存14天后复合酶的活性基本保持稳定，但游离羧肽酶a的活性却大幅度降低，剩余活性仅有37.86％。说明复合物具有一层保护性外壳能有效保护羧肽酶a的活性。

(2)不同比例的乙醇含量对复合物和游离羧肽酶a的影响(对照例1、实施例1)

在粮食贮存过程中各方面因素的影响，粮食会发酵产生酒精。如图4b所示不同比例的乙醇溶液对复合酶和游离羧肽酶a的影响是不同的。游离羧肽酶a对有机溶剂有一定的耐受度，当乙醇含量低于20％时游离羧肽酶a的活性保持在97.01％左右，一旦乙醇含量高于20％时，游离羧肽酶a的活性开始大幅度下降，沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物的优势就得到体现。当乙醇含量达到30％的时候游离羧肽酶a的活性比原来初始活性降低了21.4％。继续增加乙醇含量达到40％时，游离羧肽酶a活性降低至36.55％，此时复合酶的活性仍然保持有90.73％。15％-50％范围内的乙醇/pbs溶液对复合酶的活性基本没有影响，相对的游离羧肽酶a对有机溶剂的耐受程度很差，在50％的乙醇/pbs溶液中，游离羧肽酶a的活性仅剩余12.42％，而沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物的剩余活性为93.11％。

(3)温度对复合物和游离羧肽酶a的影响(对照例2、实施例2)

从图5可以看出，游离羧肽酶a的最适温度为25℃，当温度高于25℃后酶的活性稍微降低，温度在35℃至45℃这个区间范围内，游离羧肽酶a的活性基本保持稳定。当温度大于45℃后游离羧肽酶a的活性开始逐渐下降，温度高于55℃后，游离羧肽酶a的活性呈现大幅下降的趋势。然而，当温度范围在25℃至35℃范围内，固定化酶的活性不断升高，35℃时达到固定化酶的最适温度。继续升高温度至45℃时，固定化酶的活性从峰值开始稍微降低。当温度逐渐从45℃升高至65℃的过程中，固定化酶的活性基本保持稳定，温度稳定性提高了20℃。与游离羧肽酶a相比固定化酶对于温度的耐受范围扩大了，只要不是处于极端的温度条件下，固定化酶都能使底物分解生成l-亮氨酸，它的活性高于游离羧肽酶a，这说明在高温条件下由于mof壳的保护作用可以减少羧肽酶a三维结构的变形。同时阻碍了传热从而延迟了变性的过程。所以沸石咪唑酯骨架化合物对羧肽酶a起到了保护作用。

(4)复合物和游离羧肽酶a循环使用次数的对比(对照例3、实施例3)

如图6所示，沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物在7次循环使用后仍能保持97％的剩余活性，但是游离羧肽酶a在7次循环使用后剩余活性为62.47％，游离羧肽酶a在进行循环使用的实验时需要在10kd的超滤离心管中进行，每次超滤至少耗时30min，并且超滤离心管价格昂贵，每次循环使用后游离羧肽酶a的活性都会降低，回收极其不方便，不利于大规模应用。然而沸石咪唑酯骨架化合物负载羧肽酶a复合物完成一次循环后只需要通过高速离心5min即可直接回收复合酶，操作简单方便。

以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。