一种分泌表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种分泌表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌及其应用，属于基因工程领域。

背景技术：

褐藻胶裂解酶多为诱导酶，即在发酵培养基中必须添加底物海藻酸钠才可诱导野生菌生产分泌到培养基中的胞外褐藻胶裂解酶，而海藻酸钠不易溶解且溶液粘度大，对工业化生产造成一定困难。

大肠杆菌表达系统具有操作简便、可大规模发酵培养等优点，常用于进行酶蛋白的高水平表达。目前所报道的褐藻胶裂解酶在e.coli中通常以胞内酶形式存在，可胞外分泌重组褐藻胶裂解酶的e.coli工程菌报道极少。如果酶能够分泌到细胞外(培养基中)，比定位于细胞质中有多个优点，如简化蛋白下游加工、促进蛋白折叠与稳定、提高蛋白可溶性与生物活性等。

技术实现要素：

本发明提供一株高产胞外重组褐藻胶裂解酶的大肠杆菌工程菌，是以大肠杆菌为宿主，表达来源于需钠弧菌sk42.001的编码褐藻胶裂解酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌是大肠杆菌e.colibl21。

在本发明的一种实施方式中，所述编码褐藻胶裂解酶的基因的序列如seqidno:1所示(其中1～78bp编码信号肽)。

在本发明的一种实施方式中，以pet-28a(+)为表达载体构建重组表达载体。

本发明还提供一种构建所述大肠杆菌工程菌的方法，是采用上游引物：cgcggatccatgaagcatattttcttcaaaagc(bamhⅰ)、下游引物：cctcgaggccttggtacttacca(xhoⅰ)，pcr扩增seqidno:1所示的编码褐藻胶裂解酶的基因，将编码褐藻胶裂解酶的基因片段连接载体pet-28a(+)，构建表达载体pet28a-aly，并转化e.colibl21感受态，构建产褐藻胶裂解酶的大肠杆菌工程菌e.colibl21-aly01。

本发明还提供一种应用所述大肠杆菌工程菌生产褐藻胶裂解酶的方法，是将种子液接至lb培养基中，培养一段时间后，加入iptg诱导褐藻胶裂解酶的表达。

在本发明的一种实施方式中，将种子液以2～5％接种量转接至lb培养基中，35～37℃、180～200rpm培养至od600在0.6～0.8，加入0.5～1mmiptg于15～18℃、180～200rpm下诱导培养45～48h。

在本发明的一种实施方式中，将发酵液离心除掉菌体得到重组褐藻胶裂解酶粗酶液，经镍柱亲和层析，透析后得到aly01纯酶液体，冷冻干燥得到酶粉。

在本发明的一种实施方式中，挑取大肠杆菌工程菌单菌落至含卡那霉素lb培养基中，培养得到种子液。

本发明所构建大肠杆菌工程菌e.colibl21-aly01中的表达载体pet28a-aly包含了来源于需钠弧菌vibrionatriegenssk42.001的胞外褐藻胶裂解酶的编码基因全长，包括信号肽、碳水化合物结合结构域和催化活性域三个部分。工程宿主菌大肠杆菌e.colibl21可识别v.natriegenssk42.001来源的信号肽，因而可发酵生产褐藻胶裂解酶，并将褐藻胶裂解酶分泌到胞外。现有技术中的褐藻胶裂解酶大肠杆菌工程菌大多产胞内重组酶，需切除信号肽部分或只构建含有催化活性域的表达载体。

本发明的有益效果：

本发明构建的工程菌在常规lb培养基中即可生产分泌到胞外的褐藻胶裂解酶，无需添加诱导底物海藻酸钠，并且简化了蛋白下游加工工艺，具有较大的工业化应用潜力。

附图说明

图1胞外重组褐藻胶裂解酶纯化后的sds-page分析图；m：分子量标准品；1：诱导前粗酶液；2：诱导后粗酶液；3：纯化酶液。

图2重组褐藻胶裂解酶降解海藻酸钠产物分析：dp2：聚甘露二糖醛酸；dp3：聚古罗三糖醛酸；1：aly01酶4h反应液；2：底物海藻酸钠溶液。

具体实施方式

酶活测定：1ml酶反应液(50mm、ph7.0的pb缓冲液)包含：5mg海藻酸钠，300mmnacl，0.84μg褐藻胶裂解酶或发酵上清液，35℃反应30min，取上清液用dns方法检测酶活。酶活定义：每分钟生产1μmol还原糖所需的酶量。

实施例1

(1)大肠杆菌工程菌e.colibl21-aly01构建

需钠弧菌sk42.001基因组中编码褐藻胶裂解酶的基因的序列如seqidno:1所示(其中1～78bp编码信号肽)，以需钠弧菌sk42.001基因组dna为模板，采用上游引物：cgcggatccatgaagcatattttcttcaaaagc(bamhⅰ)、下游引物：cctcgaggccttggtacttacca(xhoⅰ)，pcr扩增褐藻胶裂解酶编码基因，将编码褐藻胶裂解酶的基因片段连接载体pet-28a(+)，构建表达载体pet28a-aly，并转化e.colibl21感受态，构建产褐藻胶裂解酶的大肠杆菌工程菌e.colibl21-aly01。

(2)重组褐藻胶裂解酶的胞外生产方法

种子液培养：挑取大肠杆菌工程菌e.colibl21-aly01单菌落至含50μg/ml卡那霉素的5mllb培养基中，37℃、200rpm摇床过夜培养；

发酵诱导：取上述种子液以2％接种量转接至200mllb培养基中，37℃、200rpm摇床中培养至od600在0.6～0.8，加入1mmiptg于18℃、200rpm下诱导48h。离心收集发酵上清作为粗酶液。经测定，粗酶液的酶活为4.5u/ml。

将发酵液离心除掉菌体得到褐藻胶裂解酶粗酶液，经镍柱亲和层析纯化，于50mm、ph7.0的磷酸缓冲液过夜透析后得到aly01纯酶液体，冷冻干燥得到酶粉，纯化倍数为2.62-3.17倍，最终得率为65.3-75.9％。

所构建大肠杆菌工程菌e.colibl21-aly01中的表达载体pet28a-aly包含了来源于需钠弧菌vibrionatriegenssk42.001的胞外褐藻胶裂解酶的编码基因全长，包括信号肽、碳水化合物结合结构域和催化活性域三个部分。工程宿主菌大肠杆菌e.colibl21可识别v.natriegenssk42.001来源的信号肽，因而可发酵生产褐藻胶裂解酶，并将褐藻胶裂解酶分泌到胞外。现有技术中的褐藻胶裂解酶大肠杆菌工程菌大多产胞内重组酶，需切除信号肽部分或只构建含有催化活性域的表达载体。

实施例2

1ml酶反应体系：10mg海藻酸钠，nacl300mm，褐藻胶裂解酶粉0.84μg，50mm、ph7.0pb缓冲液定容，35℃反应12h。取反应液采用薄层色谱(tlc)进行检测，具体方法为：裁定一定尺寸的硅胶板，在底边一侧用铅笔画一条与底边平行的线，在线上等距用铅笔标记几个点；将二糖(dp2)、三糖(dp3)标样、海藻酸钠酶反应液、海藻酸钠底物分别取1μl点在标记点上，将硅胶板置于通风处完全晾干，然后放到含有展开剂的层析缸内开始层析至液体跑至硅胶板顶端；层析结束后将硅胶板去除，使用吹风机完全吹干，之后放入显色液中15s，晾干后于120℃烘箱中烘烤至显色。

产物分析：如图2所示，该酶降解底物海藻酸钠降解效率为100％，大分子海藻酸钠经酶反应几乎全部降解为终产物三糖。褐藻胶裂解酶降解的寡糖会生成不饱和双键，相比饱和的三糖标样，分子量差一个水的大小。类似此种可特异性生产某一聚合度褐藻寡糖的褐藻胶裂解酶未见报道。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>江南大学

<120>一种分泌表达褐藻胶裂解酶的大肠杆菌及其应用

<160>3

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>海洋弧菌sk42.001

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<213>人工序列

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