一株能够降解多种磺胺类抗生素的解藻酸弧菌及其应用的制作方法

本发明涉及一株弧菌及其应用，具体涉及一株能够降解多种磺胺类抗生素的解藻酸弧菌及其应用，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：磺胺类抗生素（sulfonamides）是一类具有对氨基苯磺酰胺结构的药物的总称，是一类人工合成的广谱抗菌药物，其能与细菌体内的对氨苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶，抑制二氢叶酸的合成，从而抑制细菌的生长的和繁殖。磺胺类抗生素由于具有抗菌谱较广、性质稳定、品种多、价格低等优势，所以在畜牧业、水产养殖业和医疗行业被广泛应用，但仅有少部分磺胺类抗生素会在人体和动物体内代谢，超过80%的磺胺类抗生素会通过排泄进入环境，最近几年其在环境中的检出频次越来越高，因而备受关注。目前，磺胺类抗生素的去除方法有：臭氧氧化法、厌氧处理法、电化学氧化法、芬顿氧化法、光-芬顿联合氧化法、氯化法、光解法、光催化法、吸附法、微生物降解法等，其中，微生物降解法是自然环境和废水中抗生素降解的主要方法，而其他方法处理成本相对较高，并且容易产生二次污染，最关键的是，这些方法对天然水体的磺胺类抗生素的去除效果不大。之前，针对磺胺类抗生素在生物代谢方面进行的研究，大多集中在微生物作用下的代谢产物和毒性作用，主要研究载体为活性污泥，而针对单一磺胺类抗生素降解/代谢菌株的研究相对较少。近年来，国内外研究人员通过富集培养、分离筛选等技术，从自然界土壤或海水中筛选出了很多能够降解各类抗生素的菌群，包括细菌、真菌、放线菌、藻类等微生物菌株，取得了很好的研究成果。目前，据报道，能够降解磺胺类抗生素的菌株包括：大肠杆菌、小细菌属、假单胞、粪产碱杆菌属、真菌和其他一些真菌。然而，关于弧菌对磺胺类抗生素的降解和代谢的报道目前还没有。技术实现要素：本发明的目的在于提供一株能够降解多种磺胺类抗生素的解藻酸弧菌。为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：一株解藻酸弧菌，分类命名为vibrioalginolyticus，其特征在于，该解藻酸弧菌是从烟台逛荡河入海口的河口水中筛选得到的，于2019年06月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：cgmccno.18031，其具有磺胺类抗生素降解能力，能够降解包括磺胺嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶在内的多种磺胺类抗生素。前述的解藻酸弧菌可用来处理含有高浓度磺胺类抗生素的污染水体（包括含有高浓度磺胺类抗生素的海水和淡水），工作浓度≥5×108cfu/ml。本发明的有益之处在于：（1）本发明筛选得到的解藻酸弧菌（保藏编号为cgmccno.18031），具有磺胺类抗生素降解能力，能够降解包括磺胺嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶在内的多种磺胺类抗生素，在含有高浓度磺胺类抗生素的污染水体的处理方面具有很大的应用前景；（2）使用本发明筛选得到的解藻酸弧菌（保藏编号为cgmccno.18031）处理含有高浓度磺胺类抗生素的废水时，操作简单、费用较低，很容易大规模推广；（3）本发明筛选得到的解藻酸弧菌（保藏编号为cgmccno.18031），无论是在淡水中还是在海水中，均能实现磺胺类抗生素的降解，也就是说，该菌株既可以处理含有高浓度磺胺类抗生素的淡水，也可以处理含有高浓度磺胺类抗生素的海水，使用范围非常广泛。附图说明图1是菌株l2-2在扫描电镜下的照片；图2是菌株l2-2对磺胺类抗生素的降解效果图。具体实施方式以下结合附图和具体实施例对本发明作具体的介绍。一、菌株筛选1、富集可能有磺胺类抗生素降解效果的菌株配制mm培养基：硝酸铵1g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钠1.5g，氯化钠1g，七水硫酸镁0.2g，蒸馏水1l，调ph至7.0-7.5，120℃高压灭菌15min。2018年05月26日，我们从烟台逛荡河入海口取了2l河口水（含沉积物2g），将河口水在无菌条件下过滤富集于0.44μm滤膜上，将富集后的滤膜和沉积物样品加入到200ml含有4mg磺胺甲恶唑的mm培养基中，于30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养5d，然后吸取2ml浑浊培养液，将其加入到200ml新的含有4mg磺胺甲恶唑的mm培养基中，相同条件下再培养5d，重复5次，富集可能有磺胺类抗生素降解效果的菌株，获得富集菌液。2、筛选出对磺胺甲恶唑具有降解能力的菌株配制lb固体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠10g，琼脂15g，蒸馏水1l，120℃高压灭菌15min。配制lb液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母浸膏5g，氯化钠10g，蒸馏水1l，120℃高压灭菌15min。配制2216e固体培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.1g，琼脂15g，陈海水1l，120℃高压灭菌15min。配制2216e液体培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，磷酸高铁0.1g，陈海水1l，120℃高压灭菌15min。将富集菌液稀释不同梯度（10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6），分别于lb固体培养基和2216e固体培养基上进行平板涂布，涂布后的lb固体培养基平板按稀释梯度分别记为l1-1、l1-2、l1-3、l1-4、l1-5、l1-6，涂布后的2216e固体培养基平板按稀释梯度分别记为e1-1、e1-2、e1-3、e1-4、e1-5、e1-6，将这些平板于30℃恒温培养箱中倒置培养1d，得到单菌落，选择单菌落数量较多但不重叠的平板进行下一步筛选，最终我们选定了标记为l1-4的平板（lb固体培养基，富集菌液稀释梯度为10-4）。将标记为l1-4的平板上的单菌落分别接种于lb液体培养基（4瓶）和2216e液体培养基（4瓶）中，接种后的lb液体培养基分别记为l2-1、l2-2、l2-3、l2-4，接种后的2216e液体培养基分别记为l2-5、l2-6、l2-7、l2-8，然后于30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养12h，之后10000rpm离心得到菌体，将菌体分别加入到100ml含有2mg磺胺甲恶唑的mm培养基（磺胺甲恶唑的浓度为20mg/l）中进行培养，不加菌体的100ml含有2mg磺胺甲恶唑的mm培养基（磺胺甲恶唑的浓度为20mg/l）作为对照，于30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养3d，然后10000rpm离心得到上清液，通过高效液相色谱（hplc）检测上清液中磺胺甲恶唑的浓度，具体的：液相色谱仪：agilent1260infinityiihplc液相色谱系统；色谱柱：agilentsb-c18反相色谱柱（4.6×150mm，5μm）；检测条件：二极管阵列检测器，280nm；流动相：t=0min，v(乙腈):v(0.4%乙酸水溶液)=20：80；t=7min，v(乙腈):v(0.4%乙酸水溶液)=20：80；t=8min，v(乙腈):v(0.4%乙酸水溶液)=43：57；t=11min，v(乙腈):v(0.4%乙酸水溶液)=20：80；进样量：10μl；温度：35℃。hplc检测结果如下：由上表可知，标号为l2-2的样品（对应的菌株的标号为l2-2）具有明显的降解磺胺甲恶唑的能力，而其他标号的样品几乎没有降解磺胺甲恶唑的能力。二、菌株l2-2鉴定我们对筛选得到的菌株l2-2进行了形态特征和分子生物学鉴定。菌株l2-2是革兰氏阴性菌，呈杆状，长5-8μm、宽1-2μm（在扫描电镜下的照片见图1），硝基苯哌喃半乳糖苷试验、精氨酸双水解试验、色氨基酸脱氨酶试验、尿素酶试验均为阴性，吲哚试验、赖氨酸脱羧酶试验、鸟氨酸脱羧酶、明胶液化试验、细胞色素氧化酶试验、过氧化氢酶试验、硝酸还原酶试验均为阳性。菌株l2-2在lb固体培养基上为饱满圆形菌落，半透明，边缘明显且光滑。菌株l2-2既可在淡水中生长，也可在海水中生长，最适生长温度为25-35℃，最适生长ph为7.0-8.0。经16srrna序列分析比对，菌株l2-2与解藻酸弧菌（vibrioalginolyticus）相似度最高，高达100%。三、菌株l2-2特性研究我们研究了菌株l2-2降解磺胺类抗生素的特性，选择了9种磺胺类抗生素：磺胺嘧啶sulfadiazine（sdx）、磺胺异恶唑sulfisoxazole（six）、磺胺甲恶唑sulfamethoxazole（smx）、磺胺二甲嘧啶sulfadimethoxine（sdmx）、磺胺间甲氧嘧啶sulfamonomethoxine（smt）、磺胺醋酰sulfacetamide（scm）、磺胺甲基嘧啶sulfamerazine（smz）、磺胺噻唑sulfathiazole（stz）、磺胺吡啶sulfapyridine（spd）。研究过程：从lb固体培养基（平板）上取一环菌株l2-2接入到200mllb液体培养基中，在30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养12h，将菌液离心收集菌体，按5×108cfu/ml的浓度将菌体接种于含有单一磺胺类抗生素的mm培养基中，各磺胺类抗生素的浓度均为20mg/l，在30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养，含有相同混合磺胺类抗生素但不接种菌株l2-2的mm培养基作为对照。在不同时间点（1d、2d、3d、4d、5d、6d）取1ml培养液，10000rpm离心1min，收集上清，通过0.44μm滤膜过滤，利用高效液相色谱（hplc）对样品进行检测，具体的，测定样品中上述9种磺胺类抗生素的相对浓度，然后计算得到菌株l2-2降解上述9种磺胺类抗生素的降解率（r），降解率（r）的计算公式为：其中，为磺胺类抗生素的降解率（%），为未加菌株l2-2的抗生素浓度（mg/l）；为加入菌株l2-2后的抗生素浓度（mg/l）。菌株l2-2降解上述9种磺胺类抗生素的降解率（r）的计算结果如下：为了更直观的看到菌株l2-2降解上述9种磺胺类抗生素的效果，我们将上表制成了图，见图2。由上表和图2可知：菌株l2-2能够降解包括磺胺嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶在内的多种磺胺类抗生素。四、菌株l2-2应用案例1：利用菌株l2-2对湖水中的磺胺类抗生素进行降解湖水样品：湖水采集自滨州医学院烟台校区人工湖，湖水中分别添加磺胺嘧啶（sdx）、磺胺异恶唑（six）、磺胺甲恶唑（smx）、磺胺二甲嘧啶（sdmx）、磺胺间甲氧嘧啶（smt）、磺胺醋酰（scm）、磺胺甲基嘧啶（smz）、磺胺噻唑（stz）、磺胺吡啶（spd）9种磺胺类抗生素，这9种磺胺类抗生素的最终浓度均为20mg/l。微生物菌株：菌株l2-2（解藻酸弧菌）。菌体培养与收集：从lb固体培养基（平板）上取一环菌株l2-2接入200mllb液体培养基中，在30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养12h，将菌液离心收集菌体。湖水样品磺胺类抗生素降解：将前面收集的菌体按5×108cfu/ml的浓度接种于含有磺胺类抗生素的湖水样品中，在30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养，含有相同混合磺胺类抗生素但不接种菌株l2-2的湖水作为对照。培养3d后，取1ml培养液，10000rpm离心1min，收集上清，通过0.44μm滤膜过滤，利用高效液相色谱（hplc）对样品进行检测，测定样品中上述9种磺胺类抗生素的相对浓度，然后计算得到菌株l2-2降解湖水中上述9种磺胺类抗生素的降解率（r），计算结果如下：抗生素降解率抗生素降解率sdx66.42%scm20.29%six34.28%smz19.06%smx38.02%stz26.19%sdmx25.33%spd10.36%smt18.46%案例2、利用菌株l2-2对海水中磺胺类抗生素进行降解海水样品：海水采集自山东省烟台市海边，海水中分别添加磺胺嘧啶（sdx）、磺胺异恶唑（six）、磺胺甲恶唑（smx）、磺胺二甲嘧啶（sdmx）、磺胺间甲氧嘧啶（smt）、磺胺醋酰（scm）、磺胺甲基嘧啶（smz）、磺胺噻唑（stz）、磺胺吡啶（spd）9种磺胺类抗生素，这9种磺胺类抗生素的最终浓度均为20mg/l。微生物菌株：菌株l2-2（解藻酸弧菌）。菌体培养与收集：从lb固体培养基（平板）上取一环菌株l2-2接入200mllb液体培养基中，在30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养12h，将菌液离心收集菌体。海水样品磺胺类抗生素降解：将前面收集的菌体按5×108cfu/ml的浓度接种于含有磺胺类抗生素的海水样品中，在30℃恒温培养箱中140rpm震荡培养，含有相同混合磺胺类抗生素但不接种菌株l2-2的海水作为对照。培养3d后，取1ml培养液，10000rpm离心1min，收集上清，通过0.44μm滤膜过滤，利用高效液相色谱（hplc）对样品进行检测，测定样品中上述9种磺胺类抗生素的相对浓度，然后计算得到菌株l2-2降解湖水中上述9种磺胺类抗生素的降解率（r），计算结果如下：抗生素降解率抗生素降解率sdx78.20%scm21.88%six31.57%smz16.83%smx37.96%stz20.47%sdmx21.06%spd9.08%smt17.14%可见，菌株l2-2确实可以降解污染水体中的多种磺胺类抗生素，污染水体既可以是淡水，也可以是海水。五、菌株保藏由前面的研究可知，菌株l2-2具有磺胺类抗生素降解能力，其能够降解磺胺嘧啶、磺胺异恶唑、磺胺甲恶唑、磺胺二甲嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺醋酰、磺胺甲基嘧啶、磺胺噻唑、磺胺吡啶九种磺胺类抗生素，所以我们对该菌株进行了保藏，保藏日期为：2019年06月26日，保藏单位为：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc），保藏编号为：cgmccno.18031。需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页12