一株植物乳杆菌及其应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BXM2，该菌株能应用于发酵生产百香果发酵果汁。

背景技术：

百香果又名西番莲，主要有紫色和黄色两种，含有人体所需 17 种氨基酸、多种维生素和类胡萝卜素等丰富的营养物质，已有研究表明百香果肉具有消炎、润肠、降血脂、提高免疫力等多重功效。基于百香果的以上特征，百香果已经成为最受欢迎的水果之一。

随着电商网络时代的普及，传统水果批发销售系统受到极大的挑战，单一输送往批发市场的水果销量逐年下滑。由于水果种植地基本处于山区偏远地区，交通运输成本极高，网络信号差，果农文化水平限制、等因素，大部分果农并不适合走电商的销售渠道，而服务体系不健全,贮藏、加工能力弱等综合因素最终导致很多果农的水果严重滞销腐烂、销售价格低下，对果农及地区经济产生严重影响。因此，急需对百香果产业的加工技术进行研发，提升产品的附加值，增加百香果消费渠道。

百香果发酵果汁是一种可提升百香果口感，又含有的益生菌并可以提升百香果附加值的一种技术含量高的百香果加工产品，而百香果发酵果汁的风味、营养价值及功能与其发酵的乳酸菌种类密切相关，因此获得优质的有特异功能的乳酸菌菌种是发酵调配出优质百香果发酵果汁最核心的技术。

为解决上述问题：本申请人致力于筛选出能以灭菌或未灭菌的百香果肉为原料发酵生产百香果发酵果汁，为百香果发酵果汁的生产及开发提供新的发酵菌源。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一株植物乳杆菌及其应用。利用植物乳杆菌以百香果为原料发酵百香果乳酸饮料，为百香果发酵果汁的生产及开发提供新的发酵菌源。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BXM2，于2018年9月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.16436。

一株植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BXM2的筛选方法：

从37℃恒温培养放置21天后的未灭菌的百香果果肉与蜂蜜混合液中吸取样品1mL，分别稀释10^-1,10^-2次方，各取原液和稀释液0.1ml涂布于含有MRS固体培养基的平板上，待稀释液被平板吸收后，42℃倒置培养24h，挑选出疑似乳酸菌的乳白色单菌落，在MRS固体平板上划线分离纯化培养3次，同时将单菌落于MRS液体培养基中37℃静置培养24h，取1ml静置培养后的菌液与1ml百香果肉与蜂蜜混合液混合，37℃发酵24h，以发酵液产生酸度和pH以及发酵液中的乳酸菌菌落数为指标，挑选出能以在该发酵原料中生长的，使发酵液明显产酸，菌落数明显增长的菌株。观察发酵液发酵成产酸所需的时间，同时感官评价发酵百香果汁的风味口感，最终挑选出1株能在37℃发酵24小时使百香果果蜂蜜混合液发酵成乳酸菌饮料、并且风味口感最佳的乳酸菌菌株，保存并命名为BXM2。通过对菌株进行形态学观察、API细菌鉴定系统及16S rDNA和rpoA基因序列测定及系统发育树同源性分析，最终鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。

进一步地，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BXM2，具有以下特征：

BXM2菌株的主要形态特征如下：菌落圆，在MRS培养基上呈乳白色、不透明，菌体杆状，宽：0.6-0.8μm,长：1.3-2.5μm。

该菌株对奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、宋内氏志贺细菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌、大肠杆菌及大肠杆菌DH5ɑ均有不同程度的抑菌作用，抑菌圈大小在10.8-16.3mm之间。

所述的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BXM2在制备发酵饮料中的应用。

该菌能以灭菌或未灭菌处理的百香果肉为原料，进行百香果发酵果汁的发酵。具体为：制备百香果肉含量为12.5%-50%，蜂蜜含量为 15%-25%的发酵原液，进行121℃高压灭菌25min处理，以不灭菌为对照，分别接种1wt% 植物乳杆菌BXM2母液，37℃静置发酵培养20h。发现植物乳杆菌BXM2均能对灭菌或未灭菌的发酵原液进行发酵后获得的百香果发酵果汁的酸甜适中，口感柔和浓郁，该菌能作为发酵菌种应用于百香果发酵果汁产品的发酵生产中。

植物乳杆菌BXM2母液的制备方法为：植物乳杆菌BXM2接种于100ml MRS液体培养基中，37℃发酵培养24h，制成菌种母液。

本发明的有益效果在于：提供植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）BXM2菌株，该菌对奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、宋内氏志贺细菌、大肠杆菌等有较好的抑菌作用，能以灭菌或未灭菌的百香果肉为原料发酵生产百香果发酵果汁，为百香果发酵果汁的生产及开发提供新的发酵菌源。

附图说明

图1 BXM2的菌落形态图。

图2 BXM2 透射电镜图。

图3BXM2菌16S rDNA 和rpoA基因PCR扩增片段图谱。

图4BXM2菌rpoA基因的系统发育树图谱。

具体实施方式

为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是下述的实例仅仅是本发明其中的例子而已，并不代表本发明所限定的权利保护范围，本发明的权利保护范围以权利要求书为准。

实施例1 菌的驯化筛选分离

从37℃恒温培养放置21天后的百香果果肉与蜂蜜混合液中吸取样品1mL，分别稀释10^-1,10^-2次方，各取原液和稀释液0.1ml涂布于含有MRS固体培养基的平板上，待稀释液被平板吸收后，42℃倒置培养24h，挑选出疑似乳酸菌的乳白色单菌落，在MRS固体平板上划线纯化培养3次，同时将单菌落于MRS液体培养基中37℃静置培养24h，取1ml发酵菌液与1ml百香果肉与蜂蜜混合液混合，37℃发酵24h，以发酵液产生酸度和PH以及发酵液中的乳酸菌菌落数为指标，挑选出能以在该发酵原料生长的，使发酵液明显产酸，菌落数明显增长的菌株。观察发酵液发酵成产酸所需的时间，同时感官评价发酵百香果汁的的风味口感，最终挑选出1株能在37℃发酵24小时使百香果果蜂蜜发酵液发酵成乳酸菌饮料、并且风味口感最佳的乳酸菌菌株，保存并命名为BXM2。

其中各培养基的配方如下：

（1）MRS培养基（1L）：蛋白胨 10.0g、牛肉粉 5.0 g、酵母粉 4.0g、 葡萄糖 20.0g、吐温 80 1.0mL、K2HPO4•3H2O 1.5g、无水乙酸钠 3.0g、柠檬酸三铵2.0g、MgSO4•7H2O 0.2g、MnSO4•H2O 0.04g。 (将上述成分加入蒸馏水中,定容到 1000 mL，加热溶解，调节pH6.2，分装后 121 ℃高压灭菌 20 min。（注：固体培养基在这基础上加琼脂粉 20.0g）

（2）百香果汁蜂蜜：市售百香果与蜂蜜，比例(M/M)=1：1混合，115℃高压灭菌 20 min。

实施例2 菌种的鉴定

2.1 菌的形态观察

对菌体BXM2进行菌落形态观察（图1）、透射电镜观察观察菌体形态（图2）。BXM2菌的主要形态特征如下：菌落圆，在MRS培养基上呈乳白色、不透明，菌体杆状，宽：0.6-0.8μm,长：1.3-2.5μm。

细菌鉴定系统对菌进行鉴定及生理生化检测分析

通过应用API50 CHL V5.1试剂盒分析菌BXM2的糖类利用及产酶情况进行分析，结果见表1和表2.

表1.菌BXM2对糖类利用情况

表2.菌BXM2的产酶情况分析

注：根据颜色深浅标记为0-5，阴性反应为无色或者浅黄色（未曝光，浅黄色为试剂颜色），标记为0。1在二者之间。3-5均为阳性反应，5为最强的阳性反应。

将检测通过软件与标准菌株进行比对分析，结果表明培养24和48H后，菌BXM2与Lactobacillus plantarum(植物乳杆菌)的鉴定百分比为99.9%，可信度T值为1.0，而与Lactobacillus pentosus的鉴定百分比只有0.1%，T值只有0.51。通过API细菌鉴定系统鉴定菌BXM2为植物乳杆菌。

菌的分子生物学鉴定

①细菌基因组DNA的提取:采用TIANGEN公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取。

②16S rDNA序列的PCR扩增：扩增16SrDNA基因序列，所用引物为F 9-27：5’-GAGTTT GAT CCT GGC TCA G-3’；R 1525-1542 ：5 ’–AGA AAG GAG GTG ATC CAG CC-3’ ；rpoA基因序列的PCR扩增：所用引物为 rpoA-21-F：5 ’-ATGATYGARTTTGAAAAACC-3 ’； rpoA-22-R：

5’-ACYTTVATCATNT CWGVYTC-3 ’。PCR反应体系：2*Mix 12.5 ul，引物及DNA各1.0 ul,

ddH20 9.5 ul。PCR扩增程序： 93℃预变性4min。然后94℃变性30s，55℃（16SrDNA）或 50℃（rpoA）退火60s，72℃延伸90s，共30个循环，最后72℃充分延伸10min，4 ℃保存。

③PCR产物检测及测序分析：取5ul的PCR产物，在加入EB的1.0%的琼脂糖中凝胶电泳分离检验，扩增得到16SrDNA目的片段长约 1500 bp左右,rpoA片段长为800 bp左右（图3）。将含有目标片段的产物委托铂尚生物测序公司完成测序，得到的实际有效核苷酸序列为16SrDNA其核苷酸序列见SEQ ID NO.1 ，大小为1464bp；rpoA SEQ ID NO.2，大小为847bp。

④系统发育分析：在NCBI数据中对各16S rRNA序列进行Blast比对分析，得到序列与Lactobacillus plantarum和Lactobacillus pentosus的序列同源性均大于99%，比对rpoA基因，得到序列与L. plantarum的同源性为99.76%和与L.pentosus的序列同源性为97%，故采用rpoA基因，进行 MEGA 4.1中的Maximum Parsimony方法发育树的构建分析（结果见图4）。

结合BXM2菌的形态观察，API细菌鉴定系统，以及DNA系统发育树中的同源性分析，确定BXM2菌为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）菌种。

实施例3 植物乳杆菌BXM2的抗菌特性

将植物乳杆菌BXM2接种于100ml MRS液体培养基中，37℃发酵培养24h，制成菌种母液。同时采用基础培养基分别接种培养大肠杆菌DH5ɑ、大肠杆菌、奇异变形杆菌、金黄色葡萄球菌、宋内氏志贺细菌、鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌制备细菌母液，采用PDA培养基分别接种培养红霉菌、緑霉菌和黑霉菌，制备真菌母液，取0.1mL涂布于基础培养基和PDA平板培养基中，采用直径为7mm的打孔器对涂布有各种菌的平板各打三个孔，在平板孔中加满 BXM2发酵母液，于37℃恒温培养48h，计算菌BXM2对其他菌的抑菌效果。结果见表3，从表中可知，菌BXM2发酵液对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、大肠杆菌DH5ɑ、宋内氏志贺细菌、奇异变形杆菌均有较好的抑菌效果，抑菌圈直径大于12mm，对鼠伤寒沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌的抑菌圈直径为11-12mm之间，对红霉菌、緑霉菌和黑霉菌没有抑菌圈出现。说明植物乳杆菌BXM2对大部分致病细菌有很好的抑制作用。

表3菌BXM2对各种菌的抑菌效果

注:中"-"表示无拮抗活性。

实施例4 植物乳杆菌BXM2的应用研究

制备百香果肉含量为12.5%-50%，蜂蜜含量为 15-25%，余量为纯净水的发酵原液，121℃高压灭菌25min处理，以不灭菌为对照，分别接种1wt% 植物乳杆菌BXM2母液，37℃静置发酵培养20h。发现植物乳杆菌BXM2均能对灭菌或未灭菌的含量范围为12.5%-50%百香果肉进行发酵。发酵所得百香果发酵果汁中植物乳杆菌的活菌数达2.35×10⁷cfu/mL，可溶性固形物为17.4，总糖含量为30.78g/100g，滴定酸为0.81 g/kg，产品pH值为3.0（表4）。味道酸甜适中，口感柔和浓郁，该菌能作为发酵菌种应用于百香果发酵果汁产品的发酵生产中。

表4百香果发酵果汁产品参数检测

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院农业工程技术研究所

<120> 一株植物乳杆菌及其应用

<130> 6

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1464

<212> DNA

<213> 16S rDNA

<400> 1

acttccccta atcatctgtc ccaccttagg cggctggttc ctaaaaggtt accccaccga 60

ctttgggtgt tacaaactct catggtgtga cgggcggtgt gtacaaggcc cgggaacgta 120

ttcaccgcgg catgctgatc cgcgattact agcgattccg acttcatgta ggcgagttgc 180

agcctacaat ccgaactgag aatggcttta agagattagc ttactctcgc gagttcgcaa 240

ctcgttgtac catccattgt agcacgtgtg tagcccaggt cataaggggc atgatgattt 300

gacgtcatcc ccaccttcct ccggtttgtc accggcagtc tcaccagagt gcccaactta 360

atgctggcaa ctgataataa gggttgcgct cgttgcggga cttaacccaa catctcacga 420

cacgagctga cgacaaccat gcaccacctg tatccatgtc cccgaaggga acgtctaatc 480

tcttagattt gcatagtatg tcaagacctg gtaaggttct tcgcgtagct tcgaattaaa 540

ccacatgctc caccgcttgt gcgggccccc gtcaattcct ttgagtttca gccttgcggc 600

cgtactcccc aggcggaatg cttaatgcgt tagctgcagc actgaagggc ggaaaccctc 660

caacacttag cattcatcgt ttacggtatg gactaccagg gtatctaatc ctgtttgcta 720

cccatacttt cgagcctcag cgtcagttac agaccagaca gccgccttcg ccactggtgt 780

tcttccatat atctacgcat ttcaccgcta cacatggagt tccactgtcc tcttctgcac 840

tcaagtttcc cagtttccga tgcacttctt cggttgagcc gaaggctttc acatcagact 900

taaaaaaccg cctgcgctcg ctttacgccc aataaatccg gacaacgctt gccacctacg 960

tattaccgcg gctgctggca cgtagttagc cgtggctttc tggttaaata ccgtcaatac 1020

ctgaacagtt actctcagat atgttcttct ttaacaacag agttttacga gccgaaaccc 1080

ttcttcactc acgcggcgtt gctccatcag actttcgtcc attgtggaag attccctact 1140

gctgcctccc gtaggagttt gggccgtgtc tcagtcccaa tgtggccgat taccctctca 1200

ggtcggctac gtatcattgc catggtgagc cgttacccca ccatctagct aatacgccgc 1260

gggaccatcc aaaagtgata gccgaagcca tctttcaaac tcggaccatg cggtccaagt 1320

tgttatgcgg tattagcatc tgtttccagg tgttatcccc cgcttctggg caggtttccc 1380

acgtgttact caccagttcg ccactcactc aaatgtaaat catgatgcaa gcaccaatca 1440

ataccagagt tcgttcgact tgca 1464

<210> 2

<211> 847

<212> DNA

<213> rpoA

<400> 2

tatgattgaa attgaaaaac ctaacattca tagaattgat gaaaacgaca actatggtaa 60

gtttgttgta gaaccgcttg aacgcggtta tggtacaact ttagggaatt cacttcgtcg 120

gattcttctt tcttctttac ctggcgctgc tgttactagt attcaaattg atggtgttct 180

tcatgaattt tcaacgattg agggcgtaac ggaagacgtt acagcaatta tcttgaatgt 240

taagaagatt gcacttaagt tggaatcaga cgaaaccaag acgttggaaa tcgacgttaa 300

gggtcctgct aacgttactg ccggtgatat cattggcgat gcggacgtag aagtcttgaa 360

tccagactta ccaatttgta ccgtagcaga cggggcacac ttccatatgc gtatgaccgc 420

aaatactggt cgtggttatg tttccgctga ggataacaaa catcgtgaag atgacatgcc 480

aattggcgtt ttagctgttg attcattgta ttctccaatc gaacgtgtca actatcaagt 540

tgaaaacacg cgggttggtc aacgtgatga tttcgataag ttaaccttag acgtttggac 600

aaatggttca atcactccaa gtgaagccat tagtctatca gccaaaatcc tgactgatca 660

cctttcaatc ttcgtaaatc tcaccgatga agctaaaaac actgacgtga tggtcgagaa 720

ggaagaaacg cataaggaaa agatgttaga aatgacgatt gaagagttag atctctccgt 780

ccgttcatac aattgcttga agcgtgctgg catcaacacg gtccaagaat taactaacaa 840

aactgaa 847

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> F 9-27

<400> 3

gagtttgatc ctggctcag 19

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> R 1525-1542

<400> 4

agaaaggagg tgatccagcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> rpoA-21-F

<400> 5

atgatygart ttgaaaaacc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> rpoA-22-R

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

acyttvatca tntcwgvytc 20