具有抗氧化能力的乳酸菌菌株的筛选方法及应用与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，尤其涉及功能性乳酸菌开发与应用领域，特别是一株具有抗氧化能力的乳酸菌及其应用。
背景技术：
：乳酸菌是一类利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸、无芽孢、革兰氏阳性的细菌总称，分布广泛，种类多样，包括乳酸菌属、乳球菌属、链球菌属、片球菌属等，是一类兼性厌氧微生物。研究表明，乳酸菌具有多种功能，不仅能够调节机体的免疫系统，维持肠道菌群平衡，还具有一定的抗氧化能力，通过清除自由基使机体保持在相对稳定的状态，因此具有抗氧化功能的乳酸菌可作为一种天然的抗氧化剂应用到食品、饲料加工等领域中。近年来，发酵饲料已成为饲料产业发展的新方向。饲料原料经微生物发酵后常含有丰富的益生菌，多种有益代谢产物，如有机酸和可溶性多肽等小分子物质，在生猪养殖方面具有重要作用。目前已经公开的相关专利方面，CN107058161A公开了一株具有抗氧化功能的高加索酸奶乳杆菌JMCC0101、其筛选方法及应用，用于制备益生菌菌粉或乳酸菌饮料；CN105062918B所公开的是一株具有潜在益生特性的优良乳酸菌新菌株，可以作为调节肠道菌群、改善肠道功能的益生菌，应用于食品、保健品和药品领域。但是这些专利没有涉及具有抗氧化特性乳酸菌在发酵饲料中应用，也并没有从发酵饲料角度出发，研究饲料经微生物发酵前后抗氧化水平的变化。因此，目前还需要开发一种具有抗氧化能力乳酸菌，以及含有它们的发酵饲料，用于提高育肥猪抗氧化水平，对维持人体健康具有重要的应用价值。本发明通过益生菌发酵玉米豆粕型复合饲料，提高发酵饲料抗氧化水平，用于提高育肥猪生长性能和抗氧化水平。技术实现要素：本发明目的在于提供一种具有高抗氧化能力的乳酸菌，以及其在饲料发酵中的应用。一株具有抗氧化能力的乳酸菌菌株的筛选方法，从传统腌菜中分离纯化得到多株乳酸菌菌株，通过过氧化氢耐受能力初筛，自由基清除能力复筛得到具有抗氧化能力的乳酸菌菌株；筛选步骤如下：1）分离纯化：从传统腌菜中分离乳酸菌，并纯化得到多株乳酸菌菌株；2）初筛：检测步骤1）中得到的乳酸菌菌株过氧化氢耐受能力，初步筛选得到过氧化氢耐受能力较高的乳酸菌菌株；3）复筛：检测步骤2）中得到的过氧化氢耐受能力较高的乳酸菌菌株的DPPH自由基、羟自由基以及超氧阴离子自由基清除能力，复筛得到具有抗氧化能力的乳酸菌菌株。所述的传统腌菜为东北酸菜，新鲜白菜经清理后放入容器中，加满凉开水以及适量盐，用重物压在最上面，防止白菜漂起，注意不要让白菜露出水面，防止腐烂，于10-20℃放置20天以上，即可食用。所述的分离纯化：将所述的传统腌菜倍比稀释，取10-3、10-4、10-5、10-6四个稀释梯度，涂布在MRS平板，每个稀释梯度至少3个平板，于37℃厌氧培养48h左右获得单菌落，用接种环挑取单菌落，接种在MRS液体培养基中，24h后，用接种环挑取菌液，在MRS平板上划线，48h后，MRS平板上单菌落即为所得到纯分离的乳酸菌菌株。所述的初筛：不耐受过氧化氢的细菌在高浓度过氧化氢溶液中无法生长，或者生长缓慢而被淘汰，因此可以通过检测菌株在不同浓度过氧化氢溶液中生长状况而筛选得到对过氧化氢耐受能力较强的菌株。具体步骤是，在MRS液体培养基中加入适量过氧化氢溶液，使得培养基中的过氧化氢起始浓度分别为0，0.4，0.7，1.0mmol/L，随后按照体积分数为1%的接种量接入分离所得的菌体浓度为1×108CFU/mL菌株培养液，置于37℃恒温培养箱中静置培养，每2h取1次菌液，用可见分光光度计测其OD值，检测菌株在不同起始过氧化氢浓度下的生长趋势，筛选具有较高过氧化氢耐受性的乳酸菌菌株。所述的复筛：采用所述初筛得到的较高抗氧化能力乳酸菌，制备乳酸菌无菌生理盐水菌悬液，以鼠李糖乳杆菌LGG作为参考菌株，以菌株DPPH自由基、羟自由基、及超氧阴离子自由基清除能力高于LGG为依据指标复筛得到高抗氧化能力乳酸菌菌株。所述的复筛得到具有抗氧化能力的乳酸菌菌株包括戊糖片球菌（Pediococcuspentosaceus）ZJUAF-4，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2018年11月21日，保藏编号为CGMCCNO：16767。所述的戊糖片球菌ZJUAF-4，具有产生抗氧化酶和抗氧化物质的能力。一种所述的戊糖片球菌ZJUAF-4的应用，用于发酵饲料。所述的发酵饲料的过程如下：1）发酵菌液制备在MRS液体培养基中接种权利要求6所述戊糖片球菌ZJUAF-4，静置培养24h，使菌液浓度达到1.0×109~1.0×1010CFU/mL，制备戊糖片球菌ZJUAF-4发酵菌液；2）发酵饲料制备称取发酵原料，包括玉米10g，豆粕10g，麸皮24g，大豆皮6g，随后加入步骤1）制备的发酵菌液，添加量为总体系的5%，随后添加并接入适量温水，使总水分含量占发酵体系总质量的35%～40%，搅拌混匀，得到发酵体系，静置发酵24～48h，得到发酵饲料；所述的饲料经发酵后抗氧化水平提高，主要体现发酵饲料中抗氧化酶T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性增加，同时含有抗氧化物质谷胱甘肽、肌肽、叶酸。一种所述的发酵饲料的应用，用于提高育肥猪生长性能和抗氧化水平。本发明的有益效果本发明提供的戊糖片球菌制备得到的发酵饲料，其特征在于，饲料经发酵后抗氧化水平酶活性提高，同时含有抗氧化物质谷胱甘肽、肌肽、叶酸。本发明提供的发酵饲料，用于提高育肥猪生长性能和抗氧化水平。附图说明图1是耐受过氧化氢菌株31-2生长曲线；图2是耐受过氧化氢菌株ZJU（ZJUAF-4）生长曲线；图3是耐受过氧化氢菌株EF生长曲线；图4是耐受过氧化氢菌株35-3生长曲线。具体实施方式以下结合实施例对本发明做进一步的阐述。实施例1：菌株筛选：（1）从传统腌菜中分离得到乳酸菌取东北地区传统腌菜1g，按1:10比例，用灭菌生理盐水稀释，75℃水浴15min，然后用无菌水10倍梯度稀释，选取10-3、10-4、10-5、10-6四个稀释梯度，分别吸取100μL菌悬液在MRS平板上涂布，每个稀释梯度至少3个平板，于37℃厌氧培养48h左右获得单菌落，划线分离纯化，得到纯分离的乳酸菌菌株若干。（2）初筛具过氧化氢耐受能力的乳酸菌在具塞试管中加入10mlMRS培养基，加入适量过氧化氢溶液，使得培养基中的过氧化氢起始浓度分别为0，0.4，0.7，1.0mmol/L，随后按照体积分数为1%的接种量接入分离所得的菌体浓度为1×108CFU/mL菌株培养液，置于37℃恒温培养箱中静置培养，每2h取1次菌液，用可见分光光度计测其OD值，观察每株菌在不同起始过氧化氢浓度下的生长趋势，筛选具有高过氧化氢耐受性的乳酸菌菌株4株。图1-4是耐受过氧化氢菌株生长曲线。（3）复筛：以菌株DPPH自由基、羟自由基、及超氧阴离子自由基清除能力为依据指标复筛高抗氧化能力乳酸菌菌株，具体过程如下：将初筛得到的4株高抗氧化能力乳酸菌全部用于复筛。鼠李糖乳杆菌LGG是公认的具有优良的抗氧化功能的益生菌株为参考进行筛选，可做为参考进行抗氧化菌株筛选。乳酸菌无菌生理盐水菌悬液制备：将上述初筛得到的乳酸菌落接种于MRS液体培养基，37℃下培养18-24h，以此培养液为接种液，按照2%的接种量接种于50mlMRS液体培养基，静置培养18h，获得菌株的培养液。4℃条件下10000rpm离心，10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤两次，用无菌生理盐水重悬菌体，调整菌体密度为1.0×108CFU/mL。乳酸菌分离物清除自由基（DPPH·）能力的测定，具体操作如下：取２ml待测乳酸菌分离物，加入２mlDPPH溶液（用无水乙醇溶解配制DPPH，终浓度为O.4mmol/L），混合均匀后，然后置于室温温度下遮光反应30min，然后在转速8000r/min下离心10min，取上清部分，测定样品在波长517nm处的吸光度，测3次平行值。空白组样品以等体积无水乙醇样品代替DPPH．无水乙醇溶液，对照组样品以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。清除率按公式计算：其中A对照为对照组吸光度，A样品为样品组吸光度。清除率%=（A对照-A样品）/A对照×100乳酸菌分离物清除羟自由基（·OH）的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。乳酸菌分离物清除超氧阴离子（O22-）自由基能力比较，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。表1菌株自由基清除能力测定菌株DPPH·清除率（%）·OH清除率（%）O22-清除率（%）31-273.2527.6065.00EF76.0528.2870.5635-375.0460.2556.43ZJUAF-482.2463.7273.04LGG52.1552.1553.08结果表明，4株乳酸菌分离物对DPPH自由基、羟自由基、及超氧阴离子自由基均具有一定清除能力，结合三种自由基清除率情况，选取菌株ZJUAF-4作为高抗氧化菌株，以下对其抗氧化酶活性、抗氧化物质含量以及生理生化特性进一步研究。ZJUAF-4分离物T-AOC的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。ZJUAF-4分离物SOD的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。ZJUAF-4分离物GSH-Px的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。ZJUAF-4分离物CAT的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。表2本发明菌株ZJUAF-4抗氧化能力测定菌株ZJUAF-4T-AOC,U/mL1.38SOD,U/mL236.34GSH-Px,U/mL50.29CAT,U/mL7.50结果表明，所述戊糖片球菌ZJUAF-4具有较强的抗氧化酶活性。ZJUAF-4分离物维生素E（VE）的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。ZJUAF-4分离物维生素C（VC）的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。ZJUAF-4分离物谷胱甘肽（GSH）的测定，具体检测方法按照试剂盒说明书进行。表3本发明菌株ZJUAF-4抗氧化物质含量测定菌株ZJUAF-4VE,μg/ml1.09VC,μg/ml21.94GSH,mg/L10.94所述戊糖片球菌ZJUAF-4具有一定产生抗氧化物质的能力能力。实施例2：戊糖片球菌ZJUAF-4生理生化特征与菌株筛选表4本发明菌株ZJUAF-4生理生化特征注：“+”表示阳性，“-”表示阴性本发明菌株ZJUAF-4菌株16SrDNA鉴定对本发明菌株ZJUAF-4的16SrDNA进行测序，通过Blast与NCBI数据库进行比对，结果显示ZJUAF-4与模式菌株PediococcuspentosaceusNWAFU5032同源性达到99%，与模式菌株PediococcuspentosaceusSD7013同源性为99%，与模式菌株PediococcuspentosaceusPEP1同源性为99%，故判定菌株为戊糖片球菌。菌株ZJUFA-4已于2018年11月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNO：16767。实施例3：应用戊糖片球菌ZJUAF-4制备发酵饲料1）发酵菌液制备在MRS液体培养基中接种ZJUAF-4，静置培养24h，使菌液浓度达到1.0×109~1.0×1010CFU/mL，制备ZJUAF-4发酵菌液；2）发酵饲料制备在发酵原料（包括玉米10g，豆粕10g，麸皮24g，大豆皮6g）中加入5%步骤1）制备的发酵菌液，随后添加并接入适量温水，使总水分含量占发酵体系总质量的35%～40%，搅拌混匀，得到发酵体系，静置发酵24～48h，得到发酵饲料。表5发酵饲料抗氧化酶检测指标未发酵饲料发酵饲料T-AOC,U/mg0.671.42SOD,U/mg52.4581.34GSH-Px,U/mg158.68179.12CAT,U/mg3.456.79MDA,nmol/mg3.080.46由表5可知，与未发酵饲料相比，发酵饲料抗氧化酶活性增加，提示饲发酵饲料具有一定抗氧化性。表6发酵饲料抗氧化物质检测指标未发酵饲料发酵饲料GABA,mg/g23.6424.88GSH,mg/g10.4817.90肌肽,µg/g0.0010.16叶酸,µg/g3.187.22由表6可知，与未发酵饲料相比，发酵后饲料抗氧化物质增加，提示发酵饲料具有一定抗氧化性。结论：本发明提供的戊糖片球菌ZJUFA-4具有高抗氧化能力，同时发酵饲料后可提高饲料抗氧化能力，用于提高育肥猪生长性能和抗氧化水平。当前第1页1 2 3