高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育方法。
背景技术：
：碱性蛋白酶(Alkalineprotease)是指在碱性条件下能水解蛋白质肽键的酶类，其最适pH为9-11，活性中心为ser，属于丝氨酸蛋白酶，不但能水解肽键，还具有水解酯键、酰胺键和转酯及转肽的功能，广泛存在于动、植物及微生物体中，是一类非常重要的工业用酶。碱性蛋白酶应用很广泛，在加酶洗涤剂、丝绸、饲料、制革、食品、医药、环保等领域广泛应用，在全世界范围内占工业酶制剂市场的65％以上，具有很重要的工业和经济价值。微生物由于生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广等特点，使之成为蛋白酶的重要来源。微生物蛋白酶均为胞外酶，其从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。目前碱性蛋白酶的高产菌株仍旧集中在枯草杆菌属，来源较为单一，导致目前的蛋白酶结构也较为单一。碱性蛋白酶除了存在品种单一的问题，还有如酶的活性不高、价格昂贵等问题不能满足工业发展的要求，大规模工业用碱性蛋白酶主要还依赖于进口，因此优质产酶菌株的筛选和选育有着十分重要的应用价值。目前海洋来源的蛋白酶逐渐成为研究热点，由于海洋微生物与陆生微生物相比其生存环境更加恶劣，如高渗、低温、高压、低营养等，也造就其独特的代谢途径，因此海洋微生物可能生产出具有更加独特的酶学性质与结构的蛋白酶，如海洋酶具有宽作用pH范围、最适pH和作用温度适中、酶活性随反应温度的降低而下降缓慢等特点，因而产碱性蛋白酶的海洋微生物具有研究和应用价值。希瓦氏菌属于兼性厌氧菌，广泛分布于海洋和淡水环境中，菌株大多数属于γ-变形菌门，呈革兰氏阴性，一般长度为2-3μm，直径0.4-0.7μm的棒状杆菌，运动由单极性鞭毛驱动。在自然环境下，希瓦氏菌能以其他种类微生物发酵代谢有机物的产物，如甲酸、乳酸、氨基酸等作为碳源维持自身代谢。它还能够以环境中产氢微生物代谢过程中产生的氢气为电子供体。在厌氧条件下，希瓦氏菌具有耦合有机底物的氧化与胞外不溶性金属还原的异化金属还原的能力，这种特点使其在不同生态环境中具有较强的生存能力，对其代谢产物如碱性蛋白酶的酶学性质与结构产生影响，因而对碱性蛋白酶及希瓦氏菌的研究具有潜在的应用价值。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种产酶量大、酶活性高，能降低修饰性氨基酸交联致密程度以避免菌体表面吸附容量减小而阻止渗透的现象，减小环境对蛋白酶合成的遏制和抑制作用，降低代谢产物对菌体生长繁殖的抑制以增加菌体密度，提高菌株代谢碱性蛋白酶的生产量和生产效率，能利用应激效应增强蛋白酶适应低温强碱高盐度的能力，提升酶低温活性和热稳定性的高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育方法，所产碱性蛋白酶属于耐低温耐强碱类蛋白酶。本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育方法，包括，获得氨基酸组装修饰的希瓦氏菌菌株；和，使菌株进行间歇式低碳低氮发酵的深化培育；上述间歇式低碳低氮发酵通过在深化培育周期内，在至少一个预定时间向培育预定量时间的培育体系中添加补充剂，同时附加低温强碱环境而实现。该方法先用氨基酸对细菌进行表面组装修饰，改变其细胞膜的完整性或渗透性，然后通过间歇式低碳低氮发酵和补充剂的添加，提高蛋白酶的生产量和酶活力，并利用菌体生长的应激效应使得蛋白酶的低温强碱高盐度的适应能力增强，希瓦氏菌经培育后产酶量大、酶活力高，所得蛋白酶的pH、温度和盐度适用范围有所扩展，具有良好的低温活性和热稳定性，可降低生产成本，获得良好的经济效益。在本发明的实施方案中，碱性氨基酸组装修饰的希瓦氏菌菌株的制备步骤为：将氨基酸均匀分散于pH为8-9的电解质溶液中，然后以10-20g/L的比例添加希瓦氏菌菌株，再向其中添加交联剂，然后以150-300r/min的转速进行摇床震荡反应1-2h即得。将体系中带正电和氨基官能团的氨基酸与带负电的希瓦氏菌进行组装，能提高希瓦氏菌表面氨基官能团数量，既能增加菌株表面的吸附容量，同时也改变了菌株细胞膜表面的渗透性，有利于将培养基中物质吸附并方便地向菌株内部传输，又能从外源环境提供蛋白酶合成的碱性氨基酸，以此对蛋白酶生物合成进行类似物诱导，改变和促进菌株中蛋白酶相关的代谢途径，使菌株向产蛋白酶的方向进行，以此提高蛋白酶的生产量和酶活力。在本发明更具体的实施方案中，氨基酸为碱性氨基酸赖氨酸或精氨酸；氨基酸在混合体系中的浓度为2-5wt％。更优选的，氨基酸为精氨酸。精氨酸和赖氨酸等电点较大，属于碱性氨基酸，组装在菌株上更有利于促进菌株中碱性蛋白酶相关的酶原向酶的转变，使菌株向碱性蛋白酶的方向代谢。在本发明更具体的实施方案中，交联剂添加量为菌株重量的0.5-1.5％；交联剂包括1,2-乙二胺、5-氯戊酸和磷酸羟胺，其中1,2-乙二胺、5-氯戊酸和磷酸羟胺的重量比为2:0.3-0.8:0.1-0.5。交联剂间协同能使与细菌表面完成组装的氨基酸之间相互交联，然后在细菌表面形成黏膜以进行包囊化，包囊化后的菌体便于收集、保持和再使用，且有利于菌体在外界环境突变时保持稳定性，黏膜对金属离子有缓释作用，降低其对细菌或分泌所得蛋白酶的抑制和损伤作用，其中5-氯戊酸和磷酸羟胺能在氨基酸交联时利用不同的空间构型，降低氨基酸结构间的致密程度，避免氨基酸交联结构因在培养基中内外渗透压的不同而引起吸附容量减小进而阻止培养基向细菌内渗透的现象，同时两者能与胞内蛋白质间形成氢键，利用氢键取代二硫键，从而维持细菌分泌的酶的结构稳定性，既能增加蛋白酶的酶活，又能增加酶在低温下的稳定性。在本发明的实施方案中，深化培育操作为：培育周期为7-10d，其中每隔20-24h向培育体系中添加补充剂，同时将培育环境由pH为6.5-8、温度为25-40℃调节为低温强碱环境，继续培育3-6h后，将培育环境调节为正常培育环境继续培育，每次添加补充剂时伴随培育环境的调节，直至培育周期结束。菌株生长期间会分泌包括蛋白酶等各种代谢产物，原始培养基属于低碳低氮型，可以优先利用表面修饰的碱性氨基酸，同时避免末端产物和富氮环境对蛋白酶合成的反馈遏制，低碳可以避免葡萄糖代谢产物对蛋白酶合成的抑制作用。在短暂的低温强碱环境的损伤效应下，能激发菌株应激保护和刺激效应的综合作用，提升菌体在低温强碱环境的存活率，并利用应激效应，增强菌体所产蛋白酶在低温强碱环境下的适应性。在本发明的实施方案中，低温强碱环境操作条件为：温度为15-25℃，pH为9-12。在菌株深化培育期间采用低温强碱环境，能使得细菌在生长期产生应激反应以对抗外界不良环境，尤其是能减缓应激伤害的可溶性蛋白质含量显著上升，进而使得细菌对蛋白酶的分泌量增加，且蛋白酶能适应低温强碱的环境，有利于扩大蛋白酶使用范围，增加其应用价值。在本发明的实施方案中，补充剂的单次使用量为培养液重量的0.4-1％；补充剂中含有蔗糖、干酪素和氯化铵，其重量比为1:0.5-1:0.2-0.5。低碳低氮型培养基不利于菌体繁殖生长，因此间歇性补充糖源和氮源，使得菌株能快速发育和繁殖，增加菌体密度，待繁殖消耗掉部分碳源和氮源后，遏制作用减小，菌体加速合成分泌代谢产物，能有效增加碱性蛋白酶的生产量，提高蛋白酶的生产效率。在本发明的实施方案中，培育方法还包括稳定化培育；稳定化培育的步骤为：将深化培育后的菌体收集，并接入2216E海水培养基中，于温度20-45℃、pH为8-12的条件下稳定化培育2-3d后，离心并分别收集培育所得菌体和液体。对菌体进行稳定化培育，可以使得部分菌体完成自溶，释放出胞内酶，同时筛选出适应碱性环境的菌体，可以进行二次培育或保存，有利于扩大菌的适用范围，且能提高菌株产碱性蛋白酶的能力，使用海水培养基能增加菌株的耐盐度，所得希瓦氏菌菌株酶活性高、产酶量大，且具有良好的pH稳定性和热稳定性。本发明还提供了上述方法培育所得的希瓦氏菌在碱性蛋白酶生产中的用途。本发明提供的希瓦氏菌生产碱性蛋白酶的培育方法，所产蛋白酶活力高，酶的pH、温度和盐度适用范围有所扩展，可降低生产成本，获得良好的经济效益。在本发明的实施方案中，碱性蛋白酶的适用pH为8-14，适用温度为15-50℃，属于耐低温耐强碱类蛋白酶。该碱性蛋白酶的最适作用温度为40℃，最适作用pH为13，500mL摇瓶发酵酶活高达2370-2800U/ml；在pH8-14、40℃条件下保温1h，残余酶活在88％以上，在15-50℃、pH13条件下保温1h，残余酶活在75％以上，增加了酶的使用范围。本发明的有益效果为：1)本发明中先用氨基酸对细菌进行表面组装修饰，改变其细胞膜的完整性或渗透性，然后通过间歇式低碳低氮发酵和补充剂的添加，提高蛋白酶的生产量和酶活力，且能减小末端产物和富氮环境对蛋白酶合成的反馈遏制，以及葡萄糖代谢产物对蛋白酶合成的抑制作用；2)本发明使用碱性氨基酸组装修饰细菌能提高希瓦氏菌表面氨基官能团数量，既能增加菌株表面吸附容量，降低氨基酸结构间的致密程度以避免菌体表面吸附容量减小而阻止培养基向细菌内渗透的现象，又能利用氢键取代二硫键，改变和促进菌株中蛋白酶相关的代谢途径，提高菌株代谢碱性蛋白酶的生产量和酶活力，同时增加酶在低温下的稳定性；3)本发明间歇式添加补充剂和附加低温强碱环境的培育方式，既能增加菌体表面的通透性，方便菌体获取能量，减小不良遏制作用，又能降低代谢产物对菌体生长繁殖的抑制以增加菌体繁殖密度，提高蛋白酶的产量和得率，并通过外界环境的应激效应，使得细菌中能减缓应激伤害的可溶性蛋白质含量显著上升，致使蛋白酶的分泌量增加，提高了蛋白酶的生产效率，且使得蛋白酶低温强碱适应力增强；4)本发明提供的培育方法所得碱性蛋白酶的低温强碱高盐度适应能力增强，蛋白酶的低温活性和热稳定性得到提升，且菌体产酶量大、酶活性高，酶的pH、温度和盐度适用范围有所扩展，可降低生产成本。本发明采用了上述技术方案提供高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育方法，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。附图说明图1为不同培育方法对希瓦氏菌菌体密度的影响示意图；图2为碱性蛋白酶最适反应温度测试结果示意图；图3为碱性蛋白酶的热稳定性变化示意图；图4为碱性蛋白酶在低温环境下的酶活变化曲线图；图5为碱性蛋白酶最适pH测试结果示意图；图6为碱性蛋白酶的pH稳定性变化示意图。具体实施方式以下结合具体实施方式和附图对本发明的技术方案作进一步详细描述：本发明具体的实施方案中，深化培育所用低碳低氮培养基为可溶性淀粉培养基，其中包括可溶性淀粉25g，酵母膏5g，牛肉膏10g，蛋白胨15g，葡萄糖1g，氯化钠5g，二水合氯化钙0.2g，磷酸氢钾3.5g，磷酸二氢钠0.3g，碳酸钠0.56g，陈海水1000mL。本发明具体的实施方案中，稳定化培育所用培养基为2216E海水培养基，该培养基中包括蛋白胨5g、酵母膏1g、磷酸高铁0.1g、琼脂20g、陈海水1000mL。实施例1：高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育方法，包括，获得氨基酸组装修饰的希瓦氏菌菌株；和，使菌株进行间歇式低碳低氮发酵的深化培育；上述间歇式低碳低氮发酵通过在深化培育周期内，在至少一个预定时间向培育预定量时间的培育体系中添加补充剂，同时附加低温强碱环境而实现。该方法先用氨基酸对细菌进行表面组装修饰，改变其细胞膜的完整性或渗透性，然后通过间歇式低碳低氮发酵和补充剂的添加，提高蛋白酶的生产量和酶活力，并利用菌体生长的应激效应使得蛋白酶的低温强碱高盐度的适应能力增强，希瓦氏菌经培育后产酶量大、酶活力高，所得蛋白酶的pH、温度和盐度适用范围有所扩展，具有良好的低温活性和热稳定性，可降低生产成本，获得良好的经济效益。上述碱性氨基酸组装修饰的希瓦氏菌菌株的制备步骤为：将氨基酸均匀分散于pH为8的电解质溶液中，然后以15g/L的比例添加希瓦氏菌菌株，再向其中添加交联剂，然后以250r/min的转速进行摇床震荡反应1h即得。将体系中带正电和氨基官能团的氨基酸与带负电的希瓦氏菌进行组装，能提高希瓦氏菌表面氨基官能团数量，既能增加菌株表面的吸附容量，同时也改变了菌株细胞膜表面的渗透性，有利于将培养基中物质吸附并方便地向菌株内部传输，又能从外源环境提供蛋白酶合成的碱性氨基酸，以此对蛋白酶生物合成进行类似物诱导，改变和促进菌株中蛋白酶相关的代谢途径，使菌株向产蛋白酶的方向进行，以此提高蛋白酶的生产量和酶活力。上述氨基酸为碱性氨基酸赖氨酸或精氨酸；氨基酸在混合体系中的浓度为2.5wt％。本实施例中氨基酸为精氨酸。精氨酸和赖氨酸等电点较大，属于碱性氨基酸，组装在菌株上更有利于促进菌株中碱性蛋白酶相关的酶原向酶的转变，使菌株向碱性蛋白酶的方向代谢。上述交联剂添加量为菌株重量的1.1％；交联剂包括1,2-乙二胺、5-氯戊酸和磷酸羟胺，其中1,2-乙二胺、5-氯戊酸和磷酸羟胺的重量比为2:0.5:0.4。交联剂间协同能使与细菌表面完成组装的氨基酸之间相互交联，然后在细菌表面形成黏膜以进行包囊化，包囊化后的菌体便于收集、保持和再使用，且有利于菌体在外界环境突变时保持稳定性，黏膜对金属离子有缓释作用，降低其对细菌或分泌所得蛋白酶的抑制和损伤作用，其中5-氯戊酸和磷酸羟胺能在氨基酸交联时利用不同的空间构型，降低氨基酸结构间的致密程度，避免氨基酸交联结构因在培养基中内外渗透压的不同而引起吸附容量减小进而阻止培养基向细菌内渗透的现象，同时两者能与胞内蛋白质间形成氢键，利用氢键取代二硫键，从而维持细菌分泌的酶的结构稳定性，既能增加蛋白酶的酶活，又能增加酶在低温下的稳定性。上述深化培育操作为：培育周期为7d，其中每隔20h向培育体系中添加补充剂，同时将培育环境由pH为7、温度为30℃调节为低温强碱环境，继续培育4h后，将培育环境调节为正常培育环境继续培育，每次添加补充剂时伴随培育环境的调节，直至培育周期结束。菌株生长期间会分泌包括蛋白酶等各种代谢产物，原始培养基属于低碳低氮型，可以优先利用表面修饰的碱性氨基酸，同时避免末端产物和富氮环境对蛋白酶合成的反馈遏制，低碳可以避免葡萄糖代谢产物对蛋白酶合成的抑制作用。在短暂的低温强碱环境的损伤效应下，能激发菌株应激保护和刺激效应的综合作用，提升菌体在低温强碱环境的存活率，并利用应激效应，增强菌体所产蛋白酶在低温强碱环境下的适应性。上述低温强碱环境操作条件为：温度为22℃，pH为10.5。在菌株深化培育期间采用低温强碱环境，能使得细菌在生长期产生应激反应以对抗外界不良环境，尤其是能减缓应激伤害的可溶性蛋白质含量显著上升，进而使得细菌对蛋白酶的分泌量增加，且蛋白酶能适应低温强碱的环境，有利于扩大蛋白酶使用范围，增加其应用价值。上述补充剂的单次使用量为培养液重量的0.8％；补充剂中含有蔗糖、干酪素和氯化铵，其重量比为1:0.6:0.3。低碳低氮型培养基不利于菌体繁殖生长，因此间歇性补充糖源和氮源，使得菌株能快速发育和繁殖，增加菌体密度，待繁殖消耗掉部分碳源和氮源后，遏制作用减小，菌体加速合成分泌代谢产物，能有效增加碱性蛋白酶的生产量，提高蛋白酶的生产效率。上述培育方法还包括稳定化培育；稳定化培育的步骤为：将深化培育后的菌体收集，并接入2216E海水培养基中，于温度35℃、pH为10.5的条件下稳定化培育2d后，离心并分别收集培育所得菌体和液体。对菌体进行稳定化培育，可以使得部分菌体完成自溶，释放出胞内酶，同时筛选出适应碱性环境的菌体，可以进行二次培育或保存，有利于扩大菌的适用范围，且能提高菌株产碱性蛋白酶的能力，使用海水培养基能增加菌株的耐盐度，所得希瓦氏菌菌株酶活性高、产酶量大，且具有良好的pH稳定性和热稳定性。上述方法培育所得的希瓦氏菌在碱性蛋白酶生产中的用途。本发明提供的希瓦氏菌生产碱性蛋白酶的培育方法，所产蛋白酶活力高，酶的pH、温度和盐度适用范围有所扩展，可降低生产成本，获得良好的经济效益。上述碱性蛋白酶的适用pH为8-14，适用温度为15-50℃，属于耐低温耐强碱类蛋白酶。该碱性蛋白酶的最适作用温度为40℃，最适作用pH为13，500mL摇瓶发酵酶活高达2370-2800U/ml；在pH8-14、40℃条件下保温1h，残余酶活在88％以上，在15-50℃、pH13条件下保温1h，残余酶活在75％以上，增加了酶的使用范围。实施例2：高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育方法，具体步骤如下：(1)将精氨酸均匀分散于pH为8.5的电解质溶液中，配制成浓度为3.5wt％的混合体系，然后以15g/L的比例添加处于对数生长期的希瓦氏菌菌株，再添加占菌株重量0.8％的交联剂，然后以200r/min的转速进行摇床震荡反应1.5h，即得氨基酸组装修饰的希瓦氏菌菌株，上述交联剂包括的1,2-乙二胺、5-氯戊酸和磷酸羟胺的重量比为2:0.3:0.2；(2)将氨基酸组装修饰的菌株接入可溶性淀粉培养基中，并调整菌株接入量为OD600＝0.5，然后在pH为7.5、温度为35℃的条件下开始周期为10d的深化培育，每隔24h向培育体系中添加占培养液重量0.5％的补充剂，同时将培育环境调节为温度为20℃、pH为11，继续培育4.5h后，将培育环境调节为pH为7.5、温度为35℃，每次添加补充剂时伴随培育环境的调节，直至培育周期结束，将培养液离心，收集液体即为粗酶液，补充剂中含有蔗糖、干酪素和氯化铵，其重量比为1:0.7:0.2；(3)将离心收集到的菌体接入2216E海水培养基中，于温度40℃、pH为12的条件下稳定化培育3d，离心，收集菌体保存或进入下一循环的培养，离心所得液体为复合液；(4)将粗酶液与复合液混合形成复酶液，然后将复酶液通过超滤设备进行浓缩，再将浓缩液冷冻真空干燥，即得碱性蛋白酶，视为希瓦氏菌产碱性蛋白酶的培育周期结束。实施例3：本实施例在实施例2的基础上进行了优化，具体优化措施如下：步骤(2)所用补充剂中还包括0.1wt％的二乙二醇和0.05wt％的二甲基亚砜，随着培育时间的增加，菌体生长过程中会分泌大量粘性物质聚集在菌体表面，不利于菌体生长和与培养液进行能量交换，补充剂中的二乙二醇和二甲基亚砜能快速穿过粘性物质，并利用亲水性将粘性物质分散于培养液中，降低代谢产物对菌体生长繁殖的抑制，增加菌体表面的通透性，方便菌体获取能量，提高蛋白酶的产量和得率，另一方面两者能协同细菌表面的氨基酸对蛋白酶蛋白质构象产生影响，使得蛋白质结构柔性降低而刚性增强，使得蛋白酶的冷适应能力增强，提升了蛋白酶的低温活性和热稳定性；其他步骤与实施例2中一致，完成高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育。实施例4：本实施例与实施例2的不同之处在于：将对数生长期的希瓦氏菌菌株直接接入深化培育用低碳低氮培养基中进行培育，而不做氨基酸组装修饰；其他步骤与实施例2中一致，完成高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育。实施例5：本实施例与实施例2的不同之处在于：步骤(1)中所用交联剂为1,2-乙二胺，未添加5-氯戊酸和磷酸羟胺；其他步骤与实施例2中一致，完成高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育。实施例6：本实施例与实施例2的不同之处在于：步骤(2)中菌株添加补充剂后，未附加低温强碱环境；其他步骤与实施例2中一致，完成高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育。实施例7：本实施例与实施例2的不同之处在于：步骤(2)具体步骤如下：将氨基酸组装修饰的菌株接入可溶性淀粉培养基中，并调整菌株接入量为OD600＝0.5，然后在pH为8.5、温度为35℃的条件下开始周期为10d的深化培育，然后将培养液离心，收集液体即为粗酶液；其他步骤与实施例2中一致，完成高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育。实施例8：本实施例与实施例2的不同之处在于：步骤(2)具体步骤如下：将氨基酸组装修饰的菌株接入可溶性淀粉培养基中，并调整菌株接入量为OD600＝0.5，然后在pH为8.5、温度为35℃的条件下开始周期为10d的深化培育，然后将培养液离心，收集液体即为粗酶液，上述培养基中含有重量占比为4.5％的补充剂，补充剂中含有蔗糖、干酪素和氯化铵，其重量比为1:0.7:0.2；其他步骤与实施例2中一致，完成高产碱性蛋白酶的希瓦氏菌的培育。试验例1：碱性蛋白酶活力测定及生产试验(1)碱性蛋白酶活力测定：试验样品为实施例1、2、3、4、5、7和8培育所得希瓦氏菌的复酶液，每组5个平行，以实施例8作为对照组。测定方法：Folin试剂显色法：1mL酶液在40℃、pH11，每分钟水解产生1μg酪氨酸所需要的酶量为1个酶活力单位(U/mL)。步骤如下：将样品复酶液进行5000r/min离心去除菌体后，取上清液以硼砂－氢氧化钠缓冲溶液稀释至适当浓度，作为待测酶液，试管中加入1mL酶液，40℃温浴2min，加入酪蛋白溶液1mL，摇匀后40℃温浴10min，加入2mL三氯乙酸溶液，摇匀(空白组先加入三氯乙酸，再加入酪蛋白溶液)。取出静止10min，慢速定性滤纸过滤。取1mL滤液，加碳酸钠溶液5mL，加福林试剂使用溶液1mL，40℃显色20min，于680nm波长，用10mm比色皿测定吸光度。计算方法：U＝A×K×4/(10×n)，其中U表示酶活，A表示吸光值，K为标准曲线的系数，4表示反应总体积，10表示反应时间，n为稀释倍数。另统计各实施例所得碱性蛋白酶的产量，结果及统计分析如下表1所示。表1碱性蛋白酶活力测定及产量统计结果平均酶活力U/mL较对照组提高百分比％产量mg实施例12715.722.5329.3实施例22729.323.2321.7实施例42415.29.0278.5实施例52517.613.6292.4实施例72283.73.1227.9实施例82215.6——246.5由上表可知，实施例1和2间酶活力差异不大，且酶活力提高了20％以上，实施例4和5相较而言，酶活力增长值较差，说明实施例4和5的培育方法虽然简化了步骤，但培育得菌株所产蛋白酶酶活力远远不及实施例1和2，实施例7和实施例8的酶活力相差不大，实施例1和2的培育方法更能对菌株所产蛋白酶的酶活力产生有益效果；实施例1和2酶产量差异较小，且显著高于其他组，是由于实施例4中未组装氨基酸，未对碱性蛋白酶合成起到诱导作用，实施例5中交联剂的差异使得氨基酸交联结构影响了菌体的生长繁殖，进而影响了酶产量，实施例7虽然低碳低氮环境有利于蛋白酶合成，但不利于菌体生长繁殖，故而产量较低，实施例8则由于碳氮充足环境下利于菌体繁殖，但对蛋白酶合成起到了遏制作用，故而产量较低。(2)菌体密度测定：实施例2、3、4、5、7和8的深化培育周期内。密度测定：用721型分光光度计在600nm波长处测定A600值，光密度值与菌体干重呈线性关系，一个单位的A600以干菌0.4g/L计，每24h测定一次。结果及统计分析如附图1所示。图1为不同培育方法对希瓦氏菌菌体密度的影响示意图。由图可知，随着培育时间增长，菌体密度总体呈增长趋势，但实施例2由于前期环境改变造成部分菌体生长衰亡，菌体密度增加较缓，中期菌体适应后增长较快，后期趋于平稳；实施例3的趋势同实施例2基本一致，但较实施例2增长趋势更明显，是由于补充剂中成分的改变降低代谢产物对菌体生长繁殖的抑制，增加了菌体繁殖速率；实施例4的菌体密度增长缓慢是由于未组装氨基酸使得菌体在外界环境突变时稳定性被打破，衰亡量较大；实施例5较实施例2波动大，是由于交联剂改变导致氨基酸交联结构对菌体吸收能量的阻止作用；实施例7由于一直处于低碳低氮环境下，菌体生长繁殖缓慢；实施例8则是在前期高碳氮环境下迅猛生长繁殖，在碳氮含量降低后菌体繁殖趋于平稳。因此，为了获得高产酶量、高酶活力，实施例2的培育方法更值得推广。试验例2：希瓦氏菌所得碱性蛋白酶的最适反应温度及热稳定性测试(1)最适反应温度：将实施例2所得碱性蛋白酶分别置于30、35、40、45、50、55、60、65℃下，测定其酶活力。取最高酶活为基准，其他温度下的酶活相对最高酶活计算相对酶活，并分析做图，结果如图2所示。图2为碱性蛋白酶最适反应温度测试结果示意图。由图可知，该碱性蛋白酶在30-50℃时均有较高的酶活力，而在40℃时酶活力最高。(2)热稳定性测试：将实施例2、3、5、6所得碱性蛋白酶置于pH为13的硼砂-NaOH缓冲液体系中，分别在15、20、25、30、35、40、45、50、55、60℃下保温1h，按照酶活力测定方法测定剩余酶活力，以4℃保存新鲜酶液为对照，计算残余酶活，并分析做图，结果如图3、4所示。图3为碱性蛋白酶的热稳定性变化示意图。由图可知，实施例2和3在15-50℃下保温1h，残余酶活在75％以上，说明蛋白酶在低温15-25℃间仍能保持较高的酶活性，扩展了酶的温度使用范围。图4为碱性蛋白酶在低温环境下的酶活变化曲线图。由图可知，实施例2和3在15℃下保温1h，残余酶活仍在75％以上，说明蛋白酶在15℃仍能保持较高的酶活性，而实施例5和6的残余酶活显著降低，说明实施例5和6的培育方法所得蛋白酶在低温环境下适应能力较差，而实施例2和3的培育方法能使得碱性蛋白酶在低温环境下保持较高酶活，具有更显著的有益效果。试验例3：希瓦氏菌所得碱性蛋白酶的最适pH及pH稳定性测试(1)最适pH：将实施例2所得碱性蛋白酶分别置于pH为6-14的含有酪蛋白溶液的缓冲液中，测定不同pH值下的酶活力。取最高酶活为基准，其他pH下的酶活相对最高酶活计算相对酶活，并分析做图，结果如图5所示。图5为碱性蛋白酶最适pH测试结果示意图。由图可知，该碱性蛋白酶在pH为8-14时均有较高的酶活力，而在13时酶活力最高。(2)pH稳定性测试：将实施例2、6所得碱性蛋白酶置于温度为40℃的缓冲液体系中，分别在pH为8-14下保温1h，按照酶活力测定方法测定剩余酶活力，以4℃保存新鲜酶液为对照，计算残余酶活，并分析做图，结果如图6所示。图6为碱性蛋白酶的pH稳定性变化示意图。由图可知，实施例2的碱性蛋白酶在pH为8-14的环境下保温1h时，残余酶活在88％以上，而实施例6所得蛋白酶在pH高于12的环境下，酶活显著降低，说明实施例2中培育方法能使得碱性蛋白酶在强碱环境下保持较高酶活，扩展了酶的pH使用范围，具有更显著的有益效果。上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。当前第1页1 2 3