一种海洋蛭弧菌的长期保存方法与流程

本发明涉及菌种保存技术领域，具体涉及一种海洋蛭弧菌的长期保存方法。

背景技术：

蛭弧菌类生物，简称蛭弧菌，是一类能裂解其他细菌的小型细菌。蛭弧菌独特的捕食特性使其可作为“活的抗生素”使用，在替代抗生素控制有害细菌上具有显著的应用价值，在生产实践中已有一定应用。

海洋蛭弧菌能裂解多种革兰阴性菌，尤其对弧菌具有偏好性裂解，在控制弧菌及其引起的病害上具有较明显的优势。但包括海洋蛭弧菌在内的蛭弧菌因其通常专性寄生，难以对其进行简易有效的长期保存，尤其是在常温条件下很难维持较高的活菌含量，因而严重制约了蛭弧菌的应用；另一方面，现有蛭弧菌的保存研究多集中于陆生蛭弧菌，而且基本均采用低温保存的方法进行保存，常温保存效果不是很理想，保存成本高，而目前对海洋蛭弧菌的具体保存情况还鲜有报道。因此迫切需要研发一种针对海洋蛭弧菌的简便而有效的长期保存方法。

技术实现要素：

基于以上问题，本发明提供一种适于Halobacteriovorax属的菌种的常温保存、保存效果好、保存方法简单的海洋蛭弧菌的长期保存方法。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种海洋蛭弧菌的长期保存方法，包括以下步骤：

S1：制备宿主菌海水悬液

制备SWYE液体培养基，将用于保存海洋蛭弧菌的宿主菌接种于SWYE液体培养基中，振荡培养至对数末期后对含有宿主菌的SWYE液体培养基进行离心，并用无菌海水漂洗两次后得到宿主菌培养菌，随后将宿主菌培养菌悬于无菌海水中制备宿主菌海水悬液，并调整宿主菌海水悬液中的菌液浓度，菌液浓度为10⁶cfu/mL或10⁷cfu/mL；

S2：制备海洋蛭弧菌海水悬液

制备菌液浓度为5×10⁸cfu/mL的用于培养海洋蛭弧菌的宿主菌海水悬液，将海洋蛭弧菌接种于上述宿主菌海水悬液中，30℃振荡培养至宿主菌被裂解完全且含有大量攻击期海洋蛭弧菌时，取培养液于1000g条件下离心10min后取上清液，用0.45μm滤膜过滤两次后再于12000g条件下离心20min，弃掉上清液，用无菌海水漂洗离心后的沉淀物，随后再于12000g条件下离心20min，随后将海洋蛭弧菌培养菌悬于无菌海水中制备海洋蛭弧菌海水悬液，并调整海洋蛭弧菌海水悬液的菌液浓度，菌液浓度为10⁸pfu/mL或3.33×10⁷pfu/mL或10⁷pfu/mL；

S3：菌种保存

将步骤S2中制备的海洋蛭弧菌海水悬液与步骤S1中制备的宿主菌海水悬液等体积混合在一起，向5mL无菌螺帽管内装入4mL上述混合液，并将装有混合液的无菌螺帽管置于15-37℃条件下保存。

进一步的，步骤S1和步骤S2中的宿主菌均为溶藻弧菌。

进一步的，步骤S2中的海洋蛭弧菌为Halobacteriovorax属的菌种。

进一步的，步骤S1和步骤S2中的无菌海水的盐度均为25-35，pH均为7-9，并均经过过滤和灭菌处理。

进一步的，步骤S1和步骤S2中的无菌海水的盐度均为29.8-30.2，pH均为7.8-8.2，并均经过过滤和灭菌处理。

进一步的，步骤S3中的保存温度为20℃，选用的海洋蛭弧菌海水悬液的菌液浓度为3.33×10⁷pfu/mL，选用的宿主菌海水悬液的菌液浓度为10⁶cfu/mL。

进一步的，步骤S3中的保存温度为20-30℃，选用的海洋蛭弧菌海水悬液的菌液浓度为10⁷pfu/mL，选用的宿主菌海水悬液的菌液浓度为10⁷cfu/mL。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明打破了低温长期保存蛭弧菌的传统理念，实现了对蛭弧菌特别是Halobacteriovorax属的菌种的常温条件下的长期保存，保存方法简单，保存效果好，节约长期保存的成本。

附图说明

图1为本发明的保存方法的框架图；

图2为本发明的实施例1中的Halobacteriovorax属的菌种的数量变化结果图；

图3为本发明的实施例2中的Halobacteriovorax属的菌种的数量变化结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1：

本实施例选择Halobacteriovorax属的菌种为被保存海洋蛭弧菌种，Halobacteriovorax属的中文译名为嗜盐噬菌弧菌属，选择副溶血弧菌作为双层平板计数海洋蛭弧菌的宿主菌。

准备无菌海水，无菌海水的盐度为25-35，pH均为7-9，并均经过过滤和灭菌处理，本实施例中的无菌海水的盐度为29.8-30.2，pH为7.8-8.2。

配置SWYE培养基，配置过程如下：取NaCl 24g、MgCl·7H2O 7g、KCl 0.7g、MgCl·6H2O 5.3g、蒸馏水1L配置pH为7.4-7.8的四盐溶液，随后取蛋白胨10g和酵母提取物3g，用四盐溶液定容至1L，调节pH至7.2-7.4，于121℃高压灭菌20min后备用，用作本实施例宿主菌的培养。

配置海水双层琼脂培养基，海水双层琼脂培养基的底层含1.2％琼脂，上层含0.6％琼脂，分别用盐度为20的海水配制，并经121℃高压灭菌20min。使用时，海水双层琼脂培养基的上层融化并冷却至42℃左右时混入终含量为1×10¹⁰cfu/mL的副溶血弧菌宿主菌细胞，用于海洋蛭弧菌计数。

一种海洋蛭弧菌的长期保存方法，包括以下步骤：

S1：制备宿主菌海水悬液

制备SWYE液体培养基，将用于保存海洋蛭弧菌的宿主菌接种于SWYE液体培养基中，本实施例选择溶藻弧菌作为保存海洋蛭弧菌的宿主菌，振荡培养至对数末期后对含有溶藻弧菌的SWYE液体培养基进行离心，并用无菌海水漂洗两次后得到溶藻弧菌培养菌，随后将溶藻弧菌培养菌悬于无菌海水中制备溶藻弧菌海水悬液，并调整溶藻弧菌海水悬液中的菌液浓度，菌液浓度为10⁶cfu/mL或10⁷cfu/mL，本实施例中将10⁶cfu/mL的溶藻弧菌海水悬液标记为A2，将10⁷cfu/mL的溶藻弧菌海水悬液标记为A1；

S2：制备海洋蛭弧菌海水悬液

本实施例中的海洋蛭弧菌为Halobacteriovorax属的菌种，首先按照步骤S1中的制备方法制备菌液浓度为5×10⁸cfu/mL的用于培养Halobacteriovorax属的菌种的宿主菌海水悬液，本实施例选择溶藻弧菌作为培养海洋蛭弧菌的宿主菌，将Halobacteriovorax属的菌种接种于上述溶藻弧菌海水悬液中，30℃振荡培养至溶藻弧菌被裂解完全且含有大量攻击期Halobacteriovorax属的菌种时，取培养液于1000g条件下离心10min后取上清液，用0.45μm滤膜过滤两次后再于12000g条件下离心20min，弃掉上清液，用无菌海水漂洗离心后的沉淀物，随后再于12000g条件下离心20min，随后将Halobacteriovorax属的菌种培养菌悬于无菌海水中制备Halobacteriovorax属的菌种海水悬液，并调整Halobacteriovorax属的菌种海水悬液的菌液浓度，菌液浓度为10⁸pfu/mL或3.33×10⁷pfu/mL或10⁷pfu/mL，本实施例中将10⁸pfu/mL的Halobacteriovorax属的菌种海水悬液标记为W1，将3.33×10⁷pfu/mL的Halobacteriovorax属的菌种海水悬液标记为W2，将10⁷pfu/m的Halobacteriovorax属的菌种海水悬液标记为W3；

S3：菌种保存

将步骤S2中制备的Halobacteriovorax属的菌种海水悬液与步骤S1中制备的溶藻弧菌海水悬液等体积混合在一起，Halobacteriovorax属的菌种海水悬液和溶藻弧菌海水悬液的不同菌液浓度的组合保存体系如表1所示，向5mL无菌螺帽管内装入4mL上述混合液，并将装有混合液的无菌螺帽管置于15-37℃条件下保存，本实施例中的保存温度为20℃。

表1 Halobacteriovorax属的菌种保存体系

将Halobacteriovorax属的菌种放置于20℃条件下保存前，用海水双层琼脂培养基对其进行计数，随后将Halobacteriovorax属的菌种在20℃温度条件下分别保存1个月、3个月、6个月和12个月，并对保存了1个月、3个月、6个月和12个月的Halobacteriovorax属的菌种分别进行计数，Halobacteriovorax属的菌种海水悬液和溶藻弧菌海水悬液的不同菌液浓度的组合保存体系的Halobacteriovorax属的菌种的数量变化如附图2所示，从附图2中可看出，Halobacteriovorax属的菌种在20℃条件下保存时，特别是长时间保存后，Halobacteriovorax属的菌种的含量仍然相对较高且，所有保存组中的Halobacteriovorax属的菌种在6～12个月时的细菌含量均大于10⁵pfu/mL，其中A2W2组的长期保存效果最好，含量约为10⁶pfu/mL。

实施例2：

本实施例选择Halobacteriovorax属的菌种为被保存海洋蛭弧菌种，选择副溶血弧菌作为双层平板计数海洋蛭弧菌的宿主菌。

准备无菌海水，无菌海水的盐度为25-35，pH均为7-9，并均经过过滤和灭菌处理，本实施例中的无菌海水的盐度为29.8-30.2，pH为7.8-8.2。

配置SWYE培养基，配置过程如下：取NaCl 24g、MgCl·7H2O 7g、KCl 0.7g、MgCl·6H2O 5.3g、蒸馏水1L配置pH为7.4-7.8的四盐溶液，随后取蛋白胨10g和酵母提取物3g，用四盐溶液定容至1L，调节pH至7.2-7.4，于121℃高压灭菌20min后备用，用作本实施例宿主菌的培养。

配置海水双层琼脂培养基，海水双层琼脂培养基的底层含1.2％琼脂，上层含0.6％琼脂，分别用盐度为20的海水配制，并经121℃高压灭菌20min。使用时，海水双层琼脂培养基的上层融化并冷却至42℃左右时混入终含量为1×1010cfu/mL的副溶血弧菌宿主菌细胞，用于海洋蛭弧菌计数。

一种海洋蛭弧菌的长期保存方法，包括以下步骤：

S1：制备宿主菌海水悬液

制备SWYE液体培养基，将用于保存海洋蛭弧菌的宿主菌接种于SWYE液体培养基中，本实施例选择溶藻弧菌作为保存海洋蛭弧菌的宿主菌，振荡培养至对数末期后对含有溶藻弧菌的SWYE液体培养基进行离心，并用无菌海水漂洗两次后得到溶藻弧菌培养菌，随后将溶藻弧菌培养菌悬于无菌海水中制备溶藻弧菌海水悬液，并调整溶藻弧菌海水悬液中的菌液浓度，菌液浓度为10⁶cfu/mL或10⁷cfu/mL，本实施例中将10⁶cfu/mL的溶藻弧菌海水悬液标记为A2，将10⁷cfu/mL的溶藻弧菌海水悬液标记为A1；

S2：制备海洋蛭弧菌海水悬液

本实施例中的海洋蛭弧菌为Halobacteriovorax属的菌种，首先制备菌液浓度为5×10⁸cfu/mL的用于培养Halobacteriovorax属的菌种的宿主菌海水悬液，本实施例选择溶藻弧菌作为培养海洋蛭弧菌的宿主菌，将海洋蛭弧菌WBX接种于上述溶藻弧菌海水悬液中，30℃振荡培养至溶藻弧菌被裂解完全且含有大量攻击期Halobacteriovorax属的菌种时，取培养液于1000g条件下离心10min后取上清液，用0.45μm滤膜真空抽滤两次后再于12000g条件下离心20min，弃掉上清液，用无菌海水漂洗离心后的沉淀物，随后再于12000g条件下离心20min，随后将Halobacteriovorax属的菌种培养菌悬于无菌海水中制备Halobacteriovorax属的菌种海水悬液，并调整Halobacteriovorax属的菌种海水悬液的菌液浓度，菌液浓度为10⁸pfu/mL或3.33×10⁷pfu/mL或10⁷pfu/mL，本实施例中将10⁸pfu/mL的Halobacteriovorax属的菌种海水悬液标记为W1，将3.33×10⁷pfu/mL的Halobacteriovorax属的菌种海水悬液标记为W2，将10⁷pfu/m的Halobacteriovorax属的菌种海水悬液标记为W3；

S3：菌种保存

将步骤S2中制备的Halobacteriovorax属的菌种海水悬液与步骤S1中制备的溶藻弧菌海水悬液等体积混合在一起，Halobacteriovorax属的菌种海水悬液和溶藻弧菌海水悬液的不同菌液浓度的组合保存体系如表2所示，向5mL无菌螺帽管内装入4mL上述混合液，并将装有混合液的无菌螺帽管置于15-37℃条件下保存，本实施例中的保存温度为20-30℃。

表2 Halobacteriovorax属的菌种保存体系

将Halobacteriovorax属的菌种放置于20-30℃条件下保存前，用海水双层琼脂培养基对其进行计数，随后将Halobacteriovorax属的菌种在20-30℃温度条件下分别保存1个月、3个月、6个月和12个月，并对保存了1个月、3个月、6个月和12个月的Halobacteriovorax属的菌种分别进行计数，Halobacteriovorax属的菌种海水悬液和溶藻弧菌海水悬液的不同菌液浓度的组合保存体系的Halobacteriovorax属的菌种的数量变化如附图3所示。

从附图3中可见，Halobacteriovorax属的菌种在20-30℃条件下保存时，特别是长时间保存后，Halobacteriovorax属的菌种的细菌数量均维持在大于10⁵pfu/mL的较高水平，其中A1W2、A1W3和A2W1组的Halobacteriovorax属的菌种的细菌数量始终维持在10⁵pfu/mL以上，其中A1W3组12个月时的的长期保存效果相对最好。

如上即为本发明的实施例。上述实施例以及实施例中的具体参数仅是为了清楚表述发明验证过程，并非用以限制本发明的专利保护范围，本发明的专利保护范围仍然以其权利要求书为准，凡是运用本发明的说明书及附图内容所作的等同结构变化，同理均应包含在本发明的保护范围内。