酶法催化木糖固定一碳化合物的方法与流程

[0001]
本发明属于酶催化领域，主要涉及酶催化木糖和一碳化合物制备高附加值产品的方法。


背景技术：

[0002]
近年来，一碳化合物的高效利用受到广泛关注。甲醛、甲醇、甲酸和甲烷均是储量丰富，价格低廉的可选原料。微生物法固定一碳化合物主要通过核酮糖单磷酸途径(ribulose monophosphate pathway，rump)，具体为6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，hps)催化甲醛和核酮糖5-磷酸生成6-磷酸己酮糖，6-磷酸己酮糖在6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，phi)的作用下被异构成为果糖6-磷酸，随后果糖6-磷酸进入中心代谢途径参与各种代谢活动。目前研究较多的是利用天然的甲基营养型细菌，以甲醇或其他还原型一碳化合物作为唯一的碳源和能源生产化学品，但是其产率极低，且缺乏基因操作工具。还有人研究构建能够以甲醇为唯一碳源的大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、酿酒酵母等工程菌，但均没有获得能够完全以甲醇为唯一碳源进行生长和生产的高效菌株。
[0003]
生物质是一种可再生能源，分布广泛且储量丰富。目前，大量的秸秆被原位焚烧或作为燃料使用，不仅造成资源的浪费，而且会造成环境污染，所以如何高效地利用这些生物质成为研究热点。木糖是生物质的主要成分之一，约占其干重的20-30％。采用酸水解或气爆处理秸秆，通过控制处理条件，能够释放大量木糖，但这些木糖需要经过生物法或物理法脱毒后才能被微生物多利用。
[0004]
体外多酶反应催化平台具有产物得率高，反应速度快，反应过程简单，操作容易，能够耐受一定毒性等诸多优点，因此，亟需开发构建体外多酶催化反应体系，采用非粮食碳源木糖固定一碳化合物，以制备果糖6-磷酸，果糖1,6-二磷酸，肌醇，阿洛酮糖，甘露糖和塔格糖等高附加值产品。


技术实现要素：

[0005]
为解决上述问题，本发明提供了一种利用木糖固定一碳化合物的方法，所述方法包括如下步骤：
[0006]
(1)采用木糖异构酶催化，将木糖转化为木酮糖；和
[0007]
(2)采用木酮糖激酶和聚磷酸激酶催化，将木酮糖转化为木酮糖-5-磷酸；和
[0008]
(3)采用核酮糖磷酸3-差向异构酶催化，将木酮糖-5-磷酸转化为核酮糖5-磷酸；和
[0009]
(4)采用6-磷酸己酮糖合成酶催化，将核酮糖5-磷酸与甲醛转化为6-磷酸己酮糖；和
[0010]
(5)采用6-磷酸己酮糖异构酶催化，将6-磷酸己酮糖转化为果糖6-磷酸。
[0011]
进一步地，所述方法还包括将甲醇转化为甲醛的步骤，其中该转化步骤由甲醇脱
氢酶，nadh氧化酶进行催化或由醇氧化酶，过氧化氢酶进行催化。
[0012]
采用上述木糖固定一碳化合物的方法，本发明进而提供了一系列高附加值产品，包括果糖6-磷酸、果糖1,6-二磷酸、肌醇、阿洛酮糖、甘露糖和塔格糖的制备方法，制备方法如下所述：
[0013]
(1)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醛制备果糖6-磷酸的方法：
[0014]
以木糖和甲醛为底物，加入木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)建立多酶反应体系，进行酶催化反应。在反应体系中加入聚磷酸激酶，其目的是为了使用廉价的聚磷酸替代价格高昂的腺苷三磷酸(atp)，使生产成本大幅下降。
[0015]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醛转化为果糖6-磷酸的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醛的浓度分别为1-1000mm，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0016]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醛的浓度为60mm，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml。
[0017]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0018]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)。
[0019]
优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；
[0020]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0021]
(2)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醛制备果糖1,6-二磷酸的方法：
[0022]
以木糖和甲醛为底物，加入木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)和6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，ec 2.7.1.11)建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0023]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醛转化为果糖1,6-二磷酸的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醛的浓度分别为1-1000mm，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木
酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸果糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0024]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醛的浓度为60mm，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸果糖激酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml。
[0025]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0026]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)。
[0027]
优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；
[0028]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0029]
(3)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醛制备肌醇的方法：
[0030]
以木糖和甲醛为底物，加入木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase，ec 5.3.1.9)，肌醇1-磷酸合成酶(inositol-1-phophate synthase，ec 5.5.1.4)和肌醇单磷酸酶(inositol monophosphatase，ec 3.1.3.25)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec2.7.4.1)建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0031]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醛转化为肌醇的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醛的浓度分别为1-1000mm，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，肌醇1-磷酸合成酶的用量为0.1-10000u/ml，肌醇单磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0032]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醛的浓度为60mm，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，磷酸葡萄糖异构酶的用量为10u/ml，肌醇1-磷酸合成酶的用量为10u/ml，肌醇单磷酸酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml。
[0033]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0034]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)。
[0035]
优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；
[0036]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0037]
(4)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醛制备阿洛酮糖的方法：
[0038]
以木糖和甲醛为底物，加入木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(d-allulose 6-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.-)，磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0039]
上述所述多酶反应体系中，磷酸酶可以是植酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，阿洛酮糖6-磷酸专一性磷酸酶，优选为阿洛酮糖6-磷酸专一性磷酸酶。
[0040]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醛转化为阿洛酮糖的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醛的浓度分别为1-1000mm，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0041]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醛的浓度为60mm，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，磷酸酶的用量为10u/ml。
[0042]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0043]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)。
[0044]
优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；
[0045]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0046]
(5)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醛制备甘露糖的方法：
[0047]
以木糖和甲醛为底物，加入木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖
激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，甘露糖6-磷酸异构酶(mannose 6-phosphate isomerase，ec 5.3.1.8)，磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0048]
上述所述多酶反应体系中，磷酸酶可以是植酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，甘露糖6-磷酸专一性磷酸酶，优选为甘露糖6-磷酸专一性磷酸酶。
[0049]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醛转化为甘露糖的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醛的浓度分别为1-1000mm，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml，甘露糖6-磷酸异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0050]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醛的浓度为60mm，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml，甘露糖6-磷酸异构酶的用量为10u/ml，磷酸酶的用量为10u/ml。
[0051]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0052]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)。
[0053]
优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；
[0054]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0055]
(6)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醛制备塔格糖的方法：
[0056]
以木糖和甲醛为底物，加入木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶(tagatose 6-phosphate 4-epimerase，ec 5.1.3.40)，磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0057]
上述所述多酶反应体系中，磷酸酶可以是植酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，塔格糖6-磷酸专一性磷酸酶，优选为塔格糖6-磷酸专一性磷酸酶。
[0058]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醛转化为塔格糖的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醛的浓度分别为1-1000mm，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮
糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0059]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醛的浓度为60mm，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml，塔格糖6-磷酸差向异构酶的用量为10u/ml，磷酸酶的用量为10u/ml。
[0060]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0061]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)。
[0062]
优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；
[0063]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0064]
(7)提供另一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备果糖6-磷酸的方法：
[0065]
以木糖和甲醇为底物，加入甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，nadh氧化酶(nadh oxidase，ec 1.6.3.4)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec.3.1.5)，木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-osphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0066]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为果糖6-磷酸的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，甲醇脱氢酶的用量为0.1-10000u/ml，nadh氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0067]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，甲醇脱氢酶的用量为10u/ml，nadh氧化酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml。
[0068]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0069]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)，还原剂。优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓
度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)的浓度为0.01-500mm；还原剂为二硫苏糖醇(dtt)，浓度为0.001-100mm。
[0070]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0071]
(8)提供另一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备果糖1,6-二磷酸的方法：
[0072]
以木糖和甲醇为底物，加入甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，nadh氧化酶(nadh oxidase，ec 1.6.3.4)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)和6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，ec 2.7.1.11)建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0073]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为果糖1,6-二磷酸的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，加入醇脱氢酶的用量为0.1-10000u/ml，nadh氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸果糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0074]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇脱氢酶的用量为10u/ml，nadh氧化酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸果糖激酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml。
[0075]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0076]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)，还原剂。优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)的浓度为0.01-500mm；还原剂为二硫苏糖醇(dtt)，浓度为0.001-100mm。
[0077]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。(9)提供另一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备肌醇的方法：
[0078]
以木糖和甲醇为底物，加入甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，
nadh氧化酶(nadh oxidase，ec 1.6.3.4)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase，ec 5.3.1.9)，肌醇1-磷酸合成酶(inositol 1-phophate synthase，ec 5.5.1.4)和肌醇单磷酸酶(inositol monophosphatase，ec 3.1.3.25)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec2.7.4.1)建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0079]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为肌醇的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，醇脱氢酶的用量为0.1-10000u/ml，nadh氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，肌醇1-磷酸合成酶的用量为0.1-10000u/ml，肌醇单磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0080]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇脱氢酶的用量为10u/ml，nadh氧化酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，磷酸葡萄糖异构酶的用量为10u/ml，肌醇1-磷酸合成酶的用量为10u/ml，肌醇单磷酸酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml。
[0081]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0082]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)，还原剂。优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)的浓度为0.01-500mm；还原剂为二硫苏糖醇(dtt)，浓度为0.001-100mm。
[0083]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0084]
(10)提供另一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备阿洛酮糖的方法：
[0085]
以木糖和甲醇为底物，加入甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，nadh氧化酶(nadh oxidase，ec 1.6.3.4)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异
构酶(d-allulose 6-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.-)，磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0086]
上述所述多酶反应体系中，磷酸酶可以是植酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，阿洛酮糖6-磷酸专一性磷酸酶，优选为阿洛酮糖6-磷酸专一性磷酸酶。
[0087]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为阿洛酮糖的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，醇脱氢酶的用量为0.1-10000u/ml，nadh氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0088]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇脱氢酶的用量为10u/ml，nadh氧化酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，磷酸酶的用量为10u/ml。
[0089]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0090]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)，还原剂。优选地，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)的浓度为0.01-500mm；还原剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(dtt)，浓度为0.001-100mm。
[0091]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0092]
(11)提供另一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备甘露糖的方法：
[0093]
以木糖和甲醇为底物，加入甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，nadh氧化酶(nadh oxidase，ec 1.6.3.4)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，甘露糖6-磷酸异构酶(mannose 6-phosphate isomerase，ec 5.3.1.8)，磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0094]
上述所述多酶反应体系中，磷酸酶可以是植酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，甘露糖6-磷酸专一性磷酸酶，优选为甘露糖6-磷酸专一性磷酸酶。
[0095]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为甘露糖的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，醇脱氢酶的用量为0.1-10000u/ml，nadh氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml，甘露糖6-磷酸异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0096]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇脱氢酶的用量为10u/ml，nadh氧化酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml，甘露糖6-磷酸异构酶的用量为10u/ml，磷酸酶的用量为10u/ml。
[0097]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0098]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)，还原剂。优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)的浓度为0.01-500mm；还原剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(dtt)，浓度为0.001-100mm。
[0099]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0100]
(12)提供另一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备塔格糖的方法：
[0101]
以木糖和甲醇为底物，加入甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，nadh氧化酶(nadh oxidase，ec 1.6.3.4)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶(tagatose-6-phosphate epimerase，ec 5.1.3.40)，磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0102]
上述所述多酶反应体系中，磷酸酶可以是植酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，塔格糖6-磷酸专一性磷酸酶，优选为塔格糖6-磷酸专一性磷酸酶。
[0103]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为塔格糖的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醛的浓度分别为1-1000mm，醇脱氢酶的用量为0.1-10000u/ml，nadh氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用
量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0104]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇脱氢酶的用量为10u/ml，nadh氧化酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶的用量为10u/ml，磷酸酶的用量为10u/ml。
[0105]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0106]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)，还原剂。优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad
+
)的浓度为0.01-500mm；还原剂为β-巯基乙醇或二硫苏糖醇(dtt)，浓度为0.001-100mm。
[0107]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0108]
(13)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备果糖6-磷酸的方法：
[0109]
以木糖和甲醇为底物，加入醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-osphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0110]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为果糖6-磷酸的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，醇氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，过氧化氢酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0111]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇氧化酶的用量为10u/ml，过氧化氢酶的用量为10u/ml木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml。
[0112]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0113]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，
黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的浓度为0.00001-10mm。
[0114]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0115]
(14)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备果糖1,6-二磷酸的方法：
[0116]
以木糖和甲醇为底物，加入醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)和6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，ec 2.7.1.11)建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0117]
本发明体外多酶催化将木糖和甲醇转化为果糖1,6-二磷酸的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，醇氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，过氧化氢酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸果糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0118]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醛的浓度为60mm，醇氧化酶的用量为10u/ml，过氧化氢酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸果糖激酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml。
[0119]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0120]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。优选地，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的浓度为0.00001-10mm。
[0121]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0122]
(15)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备肌醇的方法：
[0123]
以木糖和甲醇为底物，加入醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase，ec 5.3.1.9)，肌醇1-磷酸合成酶(inositol 1-phophate synthase，ec 5.5.1.4)和肌醇单磷酸酶(inositol monophosphatase，ec 3.1.3.25)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0124]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为肌醇的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，醇氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，过氧化氢酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸葡萄糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，肌醇1-磷酸合成酶的用量为0.1-10000u/ml，肌醇单磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0125]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇氧化酶的用量为10u/ml，过氧化氢酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，磷酸葡萄糖异构酶的用量为10u/ml，肌醇1-磷酸合成酶的用量为10u/ml，肌醇单磷酸酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml。
[0126]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0127]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的浓度为0.00001-10mm。
[0128]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。(16)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备阿洛酮糖的方法：
[0129]
以木糖和甲醇为底物，加入醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(d-allulose 6-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.-)，磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0130]
上述所述多酶反应体系中，磷酸酶可以是植酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，阿洛酮糖6-磷酸专一性磷酸酶，优选为阿洛酮糖6-磷酸专一性磷酸酶。
[0131]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为阿洛酮糖的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，醇氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，过氧化氢酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0132]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇氧化酶的用量为10u/ml，过氧化氢酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，磷酸酶的用量为10u/ml。
[0133]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0134]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的浓度为0.00001-10mm。
[0135]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0136]
(17)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备甘露糖的方法：
[0137]
以木糖和甲醇为底物，加入醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，甘露糖6-磷酸异构酶(mannose 6-phosphate isomerase，ec 5.3.1.8)，磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0138]
上述所述多酶反应体系中，磷酸酶可以是植酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，甘露糖6-磷酸专一性磷酸酶，优选为甘露糖6-磷酸专一性磷酸酶。
[0139]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为甘露糖的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，醇氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，过氧化氢酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用
量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml，甘露糖6-磷酸异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0140]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇氧化酶的用量为10u/ml，过氧化氢酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml，甘露糖6-磷酸异构酶的用量为10u/ml，磷酸酶的用量为10u/ml。
[0141]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0142]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。优选的，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的浓度为0.00001-10mm。
[0143]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0144]
(18)提供一种体外多酶反应催化木糖和甲醇制备塔格糖的方法：
[0145]
以木糖和甲醇为底物，加入醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5),木酮糖激酶(xylulokinase，ec2.7.1.17)，核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶(tagatose 6-phosphate epimerase，ec 5.1.3.40)，磷酸酶建立多酶反应体系，进行酶催化反应。
[0146]
上述所述多酶反应体系中，磷酸酶可以是植酸酶，碱性磷酸酶，酸性磷酸酶，塔格糖6-磷酸专一性磷酸酶，优选为塔格糖6-磷酸专一性磷酸酶。
[0147]
本发明通过体外多酶催化将木糖和甲醇转化为塔格糖的实验中，在一个反应体系中，木糖和甲醇的浓度分别为1-1000mm，醇氧化酶的用量为0.1-10000u/ml，过氧化氢酶的用量为0.1-10000u/ml，木糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，木酮糖激酶的用量为0.1-10000u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为0.1-10000u/ml，6-磷酸己酮糖异构酶的用量为0.1-10000u/ml，聚磷酸激酶的用量为0.1-10000u/ml，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶的用量为0.1-10000u/ml，磷酸酶的用量为0.1-10000u/ml。
[0148]
优选的，木糖的浓度为50mm，甲醇的浓度为60mm，醇氧化酶的用量为10u/ml，过氧化氢酶的用量为10u/ml，木糖异构酶的用量为10u/ml，木酮糖激酶的用量为10u/ml，核酮糖磷酸3-差向异构酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖合成酶的用量为10u/ml，6-磷酸己酮糖
异构酶的用量为10u/ml，聚磷酸激酶的用量为10u/ml，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶的用量为10u/ml，磷酸酶的用量为10u/ml。
[0149]
所述酶催化反应体系在20-90℃下进行，反应时间为1-100小时。
[0150]
上述所述多酶反应体系中，还含有缓冲液，镁盐，锰盐，聚磷酸，腺苷二磷酸(adp)，黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)。优选地，缓冲液为tris-hcl缓冲液，缓冲液的ph为4.0-9.0，缓冲液的浓度为20-500mm；镁盐为硫酸镁，浓度为0.01-500mm；锰盐为硫酸锰，浓度为0.01-500mm；聚磷酸盐为聚磷酸钠，浓度为5-500mm；腺苷二磷酸(adp)的浓度为0.01-500mm；黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)的浓度为0.00001-10mm。
[0151]
本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如hepes缓冲液、tris-hcl缓冲液、mops缓冲液、柠檬酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液等；各种聚磷酸和聚磷酸盐均可用于本发明，例如六偏磷酸钠、多聚磷酸钠等；各种镁盐和锰盐均可用于本发明，例如氯化镁、硫酸镁、氯化锰、硫酸锰等。木糖的来源可以是纯木糖，也可是含有大量木糖的生物质水解液。
[0152]
综上，根据本发明的实施方案，本发明所述木糖异构酶可以为任意一种具有将木糖转化为木酮糖功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。例如，所述木糖异构酶的来源包括但不限于：thermus thermophilus hb8、thermoanaerobacter ethanolicus、thermoanaerobacterium saccharolyticum等。优选为来源于thermus thermophilus hb8的木糖异构酶。
[0153]
本发明所述木酮糖激酶可以为任意一种具有将木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。例如，所述木酮糖异构酶的来源包括但不限于：parageobacillus caldoxylosilyticus、thermotoga maritima msb8、thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum等。优选为来源于thermotoga maritima msb8的木糖异构酶。
[0154]
本发明所述核酮糖磷酸3-差向异构酶可以为任意一种具有将木酮糖5-磷酸转化为核酮糖5-磷酸功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。例如，所述核酮糖磷酸3-差向异构酶的来源包括但不限于：thermotoga maritima msb8、escherichia coli、thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum dsm 571等。优选为来源于thermotoga maritima msb8的核酮糖磷酸3-差向异构酶。
[0155]
本发明所述6-磷酸己酮糖合成酶可以为任意一种具有将核酮糖5-磷酸和甲醛缩合为6-磷酸己酮糖功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。例如，所述6-磷酸己酮糖合成酶的来源包括但不限于：bacillus methanolicus、mycobacterium gastri、thermococcus kodakarensis。优选为来源于bacillus methanolicus的6-磷酸己酮糖合成酶。
[0156]
本发明所述6-磷酸己酮糖异构酶可以为任意一种具有将6-磷酸己酮糖转化为果糖6-磷酸功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。例如，所述6-磷酸己酮糖异构酶的来源包括但不限于：bacillus methanolicus、mycobacterium gastri、thermococcus kodakarensis等。优选为来源于bacillus methanolicus的6-磷酸己酮糖异构酶。
[0157]
本发明所述聚磷酸激酶可以为任意一种具有将聚磷酸和adp转化为atp功能的酶
所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。例如，所述聚磷酸激酶的来源包括但不限于：rhodobacter sphaeroides、thermosynechococcus elongatus bp-1、mycobacterium tuberculosis等。优选为来源于rhodobacter sphaeroides的聚磷酸激酶。
[0158]
本发明所述磷酸葡萄糖异构酶可以为任意一种具有将果糖6-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。所述磷酸葡萄糖异构酶的来源包括但不限于thermus thermophilus、pyrococcus furiosus、clostridium thermocellum等。优选为来源于thermus thermophilus的磷酸葡萄糖异构酶。
[0159]
本发明所述肌醇1-磷酸合成酶可以为任意一种具有将葡萄糖6-磷酸转化为肌醇1-磷酸功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。所述肌醇1-磷酸合成酶的来源包括但不限于thermococcus kodakarensis、archaeoglobus fulgidus、saccharomyces cerevisiae等。优选为来源于archaeoglobus fulgidus的肌醇1-磷酸合成酶。
[0160]
本发明所述肌醇单磷酸酶可以为任意一种具有将肌醇1-磷酸去磷酸化生成肌醇功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。所述肌醇单磷酸酶的来源包括但不限于thermotoga maritima msb8、escherichia coli、mycobacterium smegmatis等。优选为来源于thermotoga maritima msb8的肌醇单磷酸酶。
[0161]
本发明所述6-磷酸果糖激酶可以为任意一种具有将果糖6-磷酸和atp生成果糖1,6-二磷酸和adp功能的酶所替换，也可以为通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。所述6-磷酸果糖激酶的来源包括但不限于thermus thermophilus、saccharomyces cerevisiae、escherichia coli等。优选为thermus thermophilus来源的6-磷酸果糖激酶。
[0162]
本发明所述阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶可以为任意一种具有将果糖6-磷酸转化为阿洛酮糖-6-磷酸功能的酶所替换，也可以通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。所述阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶的来源包括但不限于escherichia coli、thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum dsm 571等。优选为来源于thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum dsm 571的阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶。
[0163]
本发明所述甘露糖6-磷酸异构酶可以为任意一种具有将果糖6-磷酸转化为甘露糖6-磷酸功能的酶所替换，也可以通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。所述甘露糖6-磷酸异构酶的来源包括但不限于thermus thermophilus、thermotoga maritima msb8、archaeoglobus fulgidus等。优选为来源于thermus thermophilus的甘露糖6-磷酸异构酶。
[0164]
本发明所述塔格糖6-磷酸4-差向异构酶可以为任意一种具有将果糖6-磷酸转化为塔格糖6-磷酸功能的酶所替换，也可以通过蛋白质工程改造获得的具有同等功能的突变酶。所述塔格糖6-磷酸4-差向异构酶的来源包括但不限于agrobacterium tumefaciens c58、dictyoglomus thermophilum、thermoanaerobacter indiensis等。优选为来源于dictyoglomus thermophilum的塔格糖6-磷酸4-差向异构酶。
[0165]
本发明所述磷酸酶，可以是植酸酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和专一性磷酸酶。优
phosphate 4-epimerase)，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶；t6pp(agatose 6-phosphate phosphatase)，塔格糖6-磷酸磷酸酶；polyp
n
：聚磷酸；atp：腺苷三磷酸；adp：腺苷二磷酸；p
i
：无机磷。
[0171]
图2为依赖于甲醇脱氢酶的木糖和甲醇制备果糖6-磷酸，果糖1,6-二磷酸，肌醇，阿洛酮糖，甘露糖和塔格糖的体外多酶催化途径示意图。mdh(methonal dehydrogenase)：甲醇脱氢酶；nox(nadh oxidase)：nadh氧化酶。
[0172]
图3为依赖于醇氧化酶的木糖和甲醇制备果糖6-磷酸，果糖1,6-二磷酸，肌醇，阿洛酮糖，甘露糖和塔格糖的体外多酶催化途径示意图。mox(methonal oxidase)：甲醇氧化酶；cat(catalase)：过氧化氢酶。
[0173]
图4为木糖和甲醛制备果糖6-磷酸的反应过程曲线。
[0174]
图5为采用两种催化途径催化木糖和甲醇制备果糖6-磷酸的反应过程曲线。
[0175]
图6为木糖和甲醇制备果糖1,6-二磷酸反应过程曲线。
[0176]
图7为木糖和甲醇制备肌醇反应过程曲线。
[0177]
图8为玉米芯水解液和甲醇制备果糖1,6-二磷酸反应过程曲线。
具体实施方式
[0178]
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0179]
实施例1木糖和甲醛制备果糖6-磷酸
[0180]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醛转化为果糖6-磷酸的催化途径见图1。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(5)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(6)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0181]
在本实施例中，木糖异构酶来源于thermus thermophilus hb8，其基因编号为d90256(genebank)；木酮糖激酶和核酮糖磷酸3-差向异构酶来源于thermotoga maritima，其基因编号分别为tm0116(kegg)和tm1718(kegg)；6-磷酸己酮糖合成酶和6-磷酸己酮糖异构酶来源于bacillus methanolicus，其基因编号分别为bmmga3_06845(kegg)和bmmga3_06840(kegg)；聚磷酸激酶来源于rhodobacter sphaeroides，其基因编号为rsp_0766(kegg)。这些基因组dna都可从atcc的官方网站(www.atcc.org)上获得。基因组序列经密码子优化后，采用基因合成的方式获得。随后将把目标基因克隆至pet载体(novagen,madison,wi)中，获得相应的表达载体pet20b-ttcxi、pet20b-tmxk、pet20b-tmrpe、pet21a-bmhps、pet28a-bmphi、pet28a-rsppk。然后，将这些质粒分别转化至大肠杆菌bl21(de3)
(invitrogen,carlsbad,ca)中，进行蛋白质表达与纯化。
[0182]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醛，50mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶。在37℃进行催化反应，反应时间为7个小时。果糖6-磷酸的浓度通过酶法测定，方法如下：果糖6-磷酸在过量磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase,ec 5.3.1.9)的催化下被转化为葡萄糖6-磷酸，随后采用葡萄糖6-磷酸测定试剂盒(sigma-aldrich，货号mak014)进行测定。
[0183]
实验结果如图4所示，果糖6-磷酸的浓度随着时间逐渐增大，在7小时后达到38.5mm，果糖6-磷酸对木糖的摩尔转化率为77.0％。
[0184]
实施例2木糖和甲醛制备果糖1,6-二磷酸
[0185]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醛转化为果糖1,6-二磷酸的催化途径见图1。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(5)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(6)6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，ec 2.7.1.11)，催化果糖6-磷酸和atp生成果糖1,6-二磷酸和adp；(7)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0186]
在本实施例中，6-磷酸果糖激酶来源于thermus thermophilus hb8，基因编号为ttha1962(kegg)。该基因通过基因合成获得。克隆至载体pet28a上，获得相应表达质粒pet28a-ttcpfk。随后转入大肠杆菌bl21(de3)中进行蛋白质表达与纯化。其他酶的表达纯化同以上实施例。
[0187]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醛，50mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml 6-磷酸果糖激酶。在37℃进行催化反应，反应时间为7个小时。果糖1,6-二磷酸的浓度通过酶法测定(wang w,liu m,you c,li z,zhang yp.2017.atp-free biosynthesis of a high-energy phosphate metabolite fructose 1,6-diphosphate by in vitro metabolic engineering.metab eng 42:168-174.)。
[0188]
实验结果：果糖1,6-二磷酸的浓度随着时间逐渐增大，在7小时后达到40.1mm，果糖1,6-二磷酸对木糖的摩尔转化率为80.2％。
[0189]
实施例3木糖和甲醛制备肌醇
[0190]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醛转化为肌醇的催化途径见图1。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催
化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(5)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(6)磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase，ec 5.3.1.9)，催化果糖6-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸；(7)肌醇1-磷酸合成酶(inositol 1-phophate synthase，ec 5.5.1.4)，催化葡萄糖6-磷酸转化为肌醇1-磷酸；(8)肌醇单磷酸酶(inositol monophosphatase，ec 3.1.3.25)，催化肌醇1-磷酸脱磷生成肌醇；(9)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0191]
在本实施例中，磷酸葡萄糖异构酶来源于thermus thermophilus hb8，其基因编号为ttc1710(kegg)；肌醇-1-磷酸合成酶来源于archaeoglobus fulgidus，其基因编号为af_1794(kegg)；肌醇单磷酸酶来源于thermotoga maritima，其基因编号为tm1415(kegg)。这些基因通过基因合成获得，克隆至pet载体上，获得相应表达质粒pet28a-ttcpgi、pet20b-afips和pet20b-tmimp。随后转入大肠杆菌bl21(de3)中进行蛋白质表达与纯化。其他酶的表达纯化同以上实施例。
[0192]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醛，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml磷酸葡萄糖异构酶，2u/ml肌醇1-磷酸合成酶，2u/ml肌醇单磷酸酶。酶催化反应先在37℃反应8小时，随后将温度提高至70℃反应至30小时。肌醇的浓度通过hplc测定。hplc的条件为：hpx-87h色谱柱(bio-rad)、5mm硫酸溶液为流动相，流速0.6ml/min，柱温60℃，示差折光检测器。
[0193]
实验结果：反应30小时，肌醇的浓度达到36mm，肌醇对木糖的摩尔转化率为72％。
[0194]
实施例4木糖和甲醛制备阿洛酮糖
[0195]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醛转化为阿洛酮糖的催化途径见图1。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(5)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(6)阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(d-allulose 6-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.-)，催化果糖6-磷酸异构化为阿洛酮糖-6-磷酸；(7)磷酸酶，催化阿洛酮糖6-磷酸去磷酸基团，生成阿洛酮糖；(8)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0196]
在本实施例中，阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶来源于thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum dsm 571，其基因编号为tthe_1731(kegg)；磷酸酶来源于clostridium thermocellum，其基因编号为cthe_0261(kegg)。通过基因合成获得这些基因后，克隆至pet20b载体上，，获得相应表达质粒pet20b-ttape、pet20b-cta6pp。随后转入大肠杆菌bl21(de3)中进行蛋白质表达与纯化。其他酶的表达纯化同以上实施例。
phosphate synthase，ec4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(5)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(6)塔格糖6-磷酸差向异构酶(tagatose-6-phosphate epimerase)，催化果糖6-磷酸差向异构化为塔格糖6-磷酸；(7)磷酸酶，催化塔格糖6-磷酸去磷酸基团，生成塔格糖；(8)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0206]
在本实施例中，塔格糖6-磷酸4-差向异构酶来源于dictyoglomus thermophilum，基因编号为dicth_0118(kegg)；磷酸酶来源于archaeoglobus fulgidus，其基因编号为af_0444(kegg)。通过基因合成获得这些基因后，克隆至pet载体上，获得相应表达质粒pet20b-atutpe、pet21a-aft6pp。随后转入大肠杆菌bl21(de3)中进行蛋白质表达与纯化。其他酶的表达纯化同以上实施例。
[0207]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醛，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml塔格糖6-磷酸4-差向异构酶，2u/ml磷酸酶。酶催化反应在45℃进行。塔格糖的浓度通过hplc测定。hplc的条件为：hpx-87h色谱柱(bio-rad)，5mm硫酸溶液为流动相，流速0.6ml/min，柱温60℃，示差折光检测器。
[0208]
实验结果：反应48小时，塔格糖的浓度达到37.6mm，阿洛酮糖对木糖的摩尔转化率为75.2％。
[0209]
实施例7木糖和甲醇制备果糖6-磷酸
[0210]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为果糖6-磷酸的催化途径见图2。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，催化甲醇被还原为甲醛，同时伴随着nadh的生成；(5)nadh氧化酶(nadh oxidase，ec1.6.3.4)，催化nadh和氧气生成nad
+
和h2o；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0211]
本实施例中，醇脱氢酶来源于geobacillus stearothermophilus dsm2334，其基因编号为z25544.1(genebank)；nadh氧化酶来源于streptococcus mutans，其基因编号为smu_1117。上述基因通过基因合成获取，克隆至pet20b载体中，获得相应的表达载体pet20b-gsmdh和pet20b-smnox。然后将质粒转化至大肠杆菌表达菌bl21(de3)中，进行蛋白质表达与纯化。其他酶的表达纯化同以上实施例。
[0212]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，1mm dtt，5mm nad
+
，2u/ml醇脱氢酶，2u/ml nadh氧化酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml
核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶。在37℃进行催化反应，反应时间为7个小时。果糖6-磷酸的浓度测定同实施例1。
[0213]
实验结果如图5所示：37℃反应7小时，果糖6-磷酸的浓度达到14.9mm，果糖6-磷酸对木糖的转化率为29.9％。
[0214]
实施例8木糖和甲醇制备果糖1,6-二磷酸
[0215]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为果糖1,6-二磷酸的催化途径见图2。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec1.1.1.1)，催化甲醇被还原为甲醛，同时伴随着nadh的生成；(5)nadh氧化酶(nadh oxidase，ec 1.6.3.4)，催化nadh和氧气生成nad
+
和h2o；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，ec 2.7.1.11)，催化果糖6-磷酸和atp生成果糖1,6-二磷酸和adp；(9)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0216]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0217]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，1mm dtt，5mm nad
+
，2u/ml醇脱氢酶，2u/ml nadh氧化酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml 6-磷酸果糖激酶。在37℃进行催化反应，反应时间为7个小时。果糖-1,6-二磷酸的浓度测定同实施例2。
[0218]
实验结果：反应12小时，果糖1,6-二磷酸的浓度达到15.1mm，产物果糖1,6-二磷酸对木糖的摩尔转化率为30.2％。
[0219]
实施例9木糖和甲醇制备肌醇
[0220]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为肌醇的催化途径见图2。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，催化甲醇被还原为甲醛，同时伴随着nadh的生成；(5)nadh氧化酶(nadh oxidase，ec1.6.3.4)，催化nadh和氧气生成nad
+
和h2o；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase，ec 5.3.1.9)，催化果糖6-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸；(9)肌醇1-磷酸合成酶
(inositol 1-phophate synthase，ec5.5.1.4)，催化葡萄糖6-磷酸转化为肌醇1-磷酸；(10)肌醇单磷酸酶(inositol monophosphatase，ec 3.1.3.25)，催化肌醇1-磷酸脱磷生成肌醇；(11)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0221]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0222]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，1mm dtt，5mm nad
+
，2u/ml醇脱氢酶，2u/ml nadh氧化酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml磷酸葡萄糖异构酶，2u/ml肌醇-1-磷酸合成酶，2u/ml肌醇单磷酸酶。酶催化反应先在37℃反应8小时，随后将温度提高至70℃反应至30小时。肌醇的浓度测定同实施例3。
[0223]
实验结果：反应48小时，肌醇的浓度达到10.8mm，肌醇对木糖的摩尔转化率为21.6％。
[0224]
实施例10木糖和甲醇制备阿洛酮糖
[0225]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为阿洛酮糖的催化途径见图2。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，催化甲醇被还原为甲醛，同时伴随着nadh的生成；(5)nadh氧化酶(nadh oxidase，ec 1.6.3.4)，催化nadh和氧气生成nad
+
和h2o；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(d-allulose 6-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.-)，催化果糖6-磷酸异构化为阿洛酮糖6-磷酸；(9)磷酸酶，催化阿洛酮糖6-磷酸去磷酸基团，生成阿洛酮糖；(10)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0226]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0227]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，1mm dtt，5mm nad
+
，2u/ml醇脱氢酶，2u/ml nadh氧化酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，2u/ml磷酸酶。酶催化反应在37℃进行。阿洛酮糖的浓度测定同实施例4。
[0228]
实验结果：反应48小时，阿洛酮糖的浓度达到13.7mm，阿洛酮糖对木糖的摩尔转化率为27.4％。
[0229]
实施例11木糖和甲醇制备甘露糖
[0230]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为甘露糖的催化途径见图2。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮
糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，催化甲醇被还原为甲醛，同时伴随着nadh的生成；(5)nadh氧化酶(nadh oxidase，ec1.6.3.4)，催化nadh和氧气生成nad
+
和h2o；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)甘露糖6-磷酸异构酶(mannose 6-phosphate isomerase，ec 5.3.1.8)，催化果糖6-磷酸异构化为甘露糖6-磷酸；(9)磷酸酶，催化甘露糖6-磷酸去磷酸基团，生成甘露糖；(10)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0231]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0232]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，1mm dtt，5mm nad
+
，2u/ml醇脱氢酶，2u/ml nadh氧化酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml甘露糖6-磷酸异构酶，2u/ml磷酸酶。酶催化反应在37℃进行。甘露糖的浓度测定同实施例5。
[0233]
实验结果：反应48小时，甘露糖的浓度达到14.8mm，甘露糖对木糖的摩尔转化率为29.6％。
[0234]
实施例12木糖和甲醇制备塔格糖
[0235]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为塔格糖的催化途径见图2。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)甲醇脱氢酶(methanol dehydrogenase，ec 1.1.1.1)，催化甲醇被还原为甲醛，同时伴随着nadh的生成；(5)nadh氧化酶(nadh oxidase，ec1.6.3.4)，催化nadh和氧气生成nad
+
和h2o；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)塔格糖6-磷酸差向异构酶(tagatose 6-phosphate epimerase)，催化果糖6-磷酸差向异构化为塔格糖6-磷酸；(9)磷酸酶，催化塔格糖6-磷酸去磷酸基团，生成塔格糖；(10)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0236]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0237]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，1mm dtt，5mm nad
+
，2u/ml醇脱氢酶，2u/ml nadh氧化酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml
聚磷酸激酶，2u/ml塔格糖6-磷酸4-差向异构酶，2u/ml磷酸酶。酶催化反应在37℃进行。塔格糖的浓度测定同实施例6。
[0238]
实验结果：反应48小时，塔格糖的浓度达到14.5mm，甘露糖对木糖的摩尔转化率为29.0％。
[0239]
实施例13木糖和甲醇制备果糖6-磷酸
[0240]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为果糖6-磷酸的催化途径见图3。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，催化甲醇被还原为甲醛，同时消耗氧气生成过氧化氢；(5)过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，用于水解反应过程中生成的副产物过氧化氢；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0241]
本实施例中，醇氧化酶来源于pichia pastoris，购自sigma-aldrich，货号为a2404。过氧化氢酶来源于bacillus subtilis，其基因编号为bsu08820。该基因通过pcr获取，并通过simple cloning(you c,zhang xz,zhang y-hp.2012.simple cloning via direct transformation of pcr product(dna multimer)to escherichia coli and bacillus subtilis.appl.environ.microbiol.78(5):1593-5.)的方法克隆至pet20b载体中，获得相应的表达载体pet20b-bskata。然后，将这个质粒转化至大肠杆菌表达菌bl21(de3)中，进行蛋白质表达与纯化。其他酶的表达纯化同以上实施例。
[0242]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，2u/ml醇氧化酶，200u/ml过氧化氢酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶。在37℃进行催化反应，反应时间为7个小时。果糖6-磷酸的浓度通过酶法测定，果糖6-磷酸在磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase,ec 5.3.1.9)的催化下被转化为葡萄糖-6-磷酸，随后采用葡萄糖-6-磷酸测定试剂盒(sigma-aldrich，货号mak014)进行测定。
[0243]
实验结果如图5所示，果糖6-磷酸的浓度随着时间逐渐增大，在7小时后达到41.5mm，果糖6-磷酸对木糖的摩尔转化率为83.1％。
[0244]
实施例14木糖和甲醇制备果糖1,6-二磷酸
[0245]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为果糖1,6-二磷酸的催化途径见图3。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，催化甲醇被还原为甲醛，同时消耗氧气生成过氧化氢；(5)过氧化氢酶
(catalase，ec 1.11.1.6)，用于水解反应过程中生成的副产物过氧化氢；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)6-磷酸果糖激酶(6-phosphofructokinase，ec 2.7.1.11)，催化果糖6-磷酸和atp生成果糖1,6-二磷酸和adp；(9)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0246]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0247]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，2u/ml醇氧化酶，200u/ml过氧化氢酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml 6-磷酸果糖激酶。在37℃进行催化反应，反应时间为8个小时。果糖1,6-二磷酸的浓度测定同实施例2。
[0248]
实验结果如图6所示：果糖1,6-二磷酸的浓度随着时间逐渐增大，在7小时后达到42.9mm，果糖1,6-二磷酸对木糖的摩尔转化率为84.8％。
[0249]
实施例15木糖和甲醇制备肌醇
[0250]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为肌醇的催化途径见图3。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，催化甲醇被还原为甲醛，同时消耗氧气生成过氧化氢；(5)过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，用于水解反应过程中生成的副产物过氧化氢；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)磷酸葡萄糖异构酶(phosphoglucose isomerase，ec 5.3.1.9)，催化果糖6-磷酸转化为葡萄糖6-磷酸；(9)肌醇1-磷酸合成酶(inositol 1-phophate synthase，ec 5.5.1.4)，催化葡萄糖6-磷酸转化为肌醇1-磷酸；(10)肌醇单磷酸酶(inositol monophosphatase，ec3.1.3.25)，催化肌醇1-磷酸脱磷生成肌醇；(11)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0251]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0252]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，2u/ml醇氧化酶，200u/ml过氧化氢酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml磷酸葡萄糖异构酶，2u/ml肌醇1-磷酸合成酶，2u/ml肌醇单磷酸酶。酶催化反应先在37℃反应8小时，随后将温度提高至70℃反应至30小时。肌醇的浓度测定同实施例3。
[0253]
实验结果如图7所示：反应30小时，肌醇的浓度达到38.5mm，肌醇对木糖的摩尔转化率为77％。
[0254]
实施例16木糖和甲醇制备阿洛酮糖
[0255]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为阿洛酮糖的催化途径见图3。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，催化甲醇被还原为甲醛，同时消耗氧气生成过氧化氢；(5)过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，用于水解反应过程中生成的副产物过氧化氢；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶(d-allulose 6-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.-)，催化果糖6-磷酸异构化为阿洛酮糖6-磷酸；(9)磷酸酶，催化阿洛酮糖6-磷酸去磷酸基团，生成阿洛酮糖；(10)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0256]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0257]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，2u/ml醇氧化酶，200u/ml过氧化氢酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml阿洛酮糖6-磷酸3-差向异构酶，2u/ml磷酸酶。酶催化反应在37℃进行。阿洛酮糖的浓度测定同实施例4。
[0258]
实验结果：反应48小时，阿洛酮糖的浓度达到40.5mm，阿洛酮糖对木糖的摩尔转化率为81.0％。
[0259]
实施例17木糖和甲醇制备甘露糖
[0260]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为甘露糖的催化途径见图3。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；(4)醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，催化甲醇被还原为甲醛，同时消耗氧气生成过氧化氢；(5)过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，用于水解反应过程中生成的副产物过氧化氢；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)甘露糖6-磷酸异构酶(mannose 6-phosphate isomerase，ec 5.3.1.8)，催化果糖6-磷酸异构化为甘露糖6-磷酸；(9)磷酸酶，催化甘露糖6-磷酸去磷酸基团，生成甘露糖；(10)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0261]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0262]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液
(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，2u/ml醇氧化酶，200u/ml过氧化氢酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml甘露糖6-磷酸异构酶，2u/ml磷酸酶。酶催化反应在37℃进行。阿洛酮糖的浓度测定同实施例5。
[0263]
实验结果：反应48小时，甘露糖的浓度达到42.1mm，甘露糖对木糖的摩尔转化率为84.2％。
[0264]
实施例18木糖和甲醇制备塔格糖
[0265]
通过体外多酶催化体系将木糖和甲醇转化为塔格糖的催化途径见图3。该途径中涉及的关键酶有：(1)木糖异构酶(xylose isomerase，ec 5.3.1.5)，催化木糖转化为木酮糖；(2)木酮糖激酶(xylulokinase，ec 2.7.1.17)，催化木酮糖和atp转化为木酮糖5-磷酸和adp；(3)核酮糖磷酸3-差向异构酶(ribulose 5-phosphate 3-epimerase，ec 5.1.3.1)，催化木酮糖5-磷酸和核酮糖5-磷酸的异构化；4)醇氧化酶(alcohol oxidase，ec 1.1.3.13)，催化甲醇被还原为甲醛，同时消耗氧气生成过氧化氢；(5)过氧化氢酶(catalase，ec 1.11.1.6)，用于水解反应过程中生成的副产物过氧化氢；(6)6-磷酸己酮糖合成酶(3-hexulose 6-phosphate synthase，ec 4.1.2.43)，催化甲醛和核酮糖5-磷酸的缩合，产物为6-磷酸己酮糖；(7)6-磷酸己酮糖异构酶(6-phospho 3-hexuloisomerase，ec 5.3.1.27)，催化6-磷酸己酮糖异构为果糖6-磷酸；(8)塔格糖6-磷酸差向异构酶(tagatose 6-phosphate epimerase)，催化果糖6-磷酸差向异构化为塔格糖6-磷酸；(9)磷酸酶，催化塔格糖6-磷酸去磷酸基团，生成塔格糖。(10)聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，ec 2.7.4.1)，催化聚磷酸和adp再生atp。
[0266]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0267]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，2u/ml醇氧化酶，200u/ml过氧化氢酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml塔格糖6-磷酸4-差向异构酶，2u/ml磷酸酶。酶催化反应在37℃进行。塔格糖的浓度测定同实施例6。
[0268]
实验结果：反应48小时，塔格糖的浓度达到36.8mm，甘露糖对木糖的摩尔转化率为73.6％。
[0269]
实施例19由生物质预处理所得到的木糖溶液和甲醇制备果糖6-磷酸
[0270]
生物质酸处理水解液或气爆处理水解液中含有大量木糖，可以替代纯木糖用于本发明。
[0271]
本实施例中，玉米芯使用稀酸处理，处理条件为2％的硫酸，175摄氏度处理5分钟。后经过水提取，浓缩，脱色，ph中和获得含有高浓度木糖的生物质水解液。
[0272]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。
[0273]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖等量的生物质水解液，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，2u/ml醇氧化酶，200u/ml过氧化氢酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮
糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶。在37℃进行催化反应，反应时间为12个小时。果糖6-磷酸的浓度测定同实施例1。
[0274]
实验结果，反应结束后，果糖6-磷酸的浓度为39.5mm，产物对木糖的转化率为79.0％。
[0275]
实施例20由生物质预处理所得到的木糖溶液和甲醇制备果糖1,6-二磷酸
[0276]
在本实施例中，酶的表达纯化同以上实施例。生物质水解液的制备同以上实施例。
[0277]
在一个1.0ml的反应体系中含有50mm木糖等量的生物质水解液，60mm甲醇，50mm tris-hcl缓冲液(ph 8.0)，10mm的硫酸镁，0.5mm氯化锰，2mm adp，20mm六偏磷酸钠，0.01mm fad，2u/ml醇氧化酶，200u/ml过氧化氢酶，2u/ml木糖异构酶，2u/ml木酮糖激酶，2u/ml核酮糖磷酸3-差向异构酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖合成酶，2u/ml 6-磷酸己酮糖异构酶，2u/ml聚磷酸激酶，2u/ml 6-磷酸果糖激酶。在37℃进行催化反应，反应时间为12个小时。果糖1,6-二磷酸的浓度测定同实施例2。
[0278]
实验结果如图8所示，反应结束后，果糖1,6-二磷酸的浓度为40.1mm，产物对木糖的转化率为80.2％。
[0279]
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。