本发明公开了一种分泌抗新城疫病毒np蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞4f6株，属于生物技术领域。
背景技术：
新城疫(newcastledisease，nd)是由新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)强毒株感染家禽引起的急性、烈性、高度接触性传染病，是我国《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020年)》中优先防治的一类动物疫病之一。
近年来该病呈现出新的流行特点，如非典型性新城疫、ndv新基因(亚)型出现、宿主范围扩大和毒力增强等，使新城疫防控复杂化。目前，在生产实践中典型性的新城疫已得到较好控制，但局部地区病毒污染比较严重，疫情呈持续性地方流行。近年来该病呈现出新的流行特点，如非典型性新城疫、ndv新基因(亚)型出现、宿主范围扩大和毒力增强等，使新城疫防控复杂化。分子流行病学研究结果表明，我国目前流行的ndv以基因vii型(鸡、鸭、鹅群)为主(潘群兴,等.新城疫不同宿主源分离株的生物学特性[j].江苏农业学报,2011,27(6):1325-1329.)。因此，对禽群进行基础性、长期性的新城疫抗原/抗体监测预警是十分必要的。
现有nd监测手段对科学评估nd发生风险和疫苗免疫效果存在一定的局限性。nd血凝和血凝抑制试验常受到多种因素影响，容易造成偏差；rt-pcr法虽特异性、灵敏性好，但操作繁琐、需要特殊仪器。免疫学检测技术(如elisa和免疫胶体金试纸条)具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点，适用于大规模样品的检测。其中，筛选到高质量(特异性强、灵敏度高、稳定性好)的单克隆抗体是研制nd免疫学检测试剂盒的必要组成。
ndv为副黏病毒科副黏病毒属的禽副黏病毒i型，基因组为不分节段的单股负链rna，基因组结构模式为3’-np-p-m-f-hn-l-5’，依次编码六种结构蛋白：核衣壳蛋白(nucleocapsidprotein，np)、磷蛋白(phosphorprotein，p)、基质蛋白(matrixprotein，m)、融合蛋白(fusionprotein，f)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(heamagglutinin-neuraminidaseprotein，hn)和大分子蛋白(largeprotein，l)。np蛋白是ndv粒子中最丰富的蛋白，他与基因组的rna组成核心螺旋的核衣壳结构，保护rna免受核酸酶活性的降解。同时，np也是唯一一种不能从核衣壳中去除的病毒多肽，表明np蛋白对于ndv的组装十分重要。
目前，有关分泌ndv单克隆抗体的杂交瘤细胞株已有报道，虽然部分细胞株分泌的单克隆抗体是针对np蛋白的。例如，詹媛等用纯化后的np重组蛋白(来源于classi的duck/js/10弱毒株)免疫小鼠，经过融合、筛选及亚克隆，最终获得2株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别将其命名为1h3和3f5。将这2株杂交瘤细胞分别接种小鼠腹腔制备腹水。经elisa测定，这2株单抗腹水的效价分别为1:3.5×107和1:6.8×105(詹媛，等.classⅰ新城疫病毒duck/js/10弱毒株np重组蛋白的表达及广谱性ndv单克隆抗体的制备[j].中国兽医科学,2014(6):611-616.)。刘文丽等利用ndvf48e9株pet32a-np重组蛋白免疫balb/c小鼠，采用杂交瘤细胞技术，间接elisa筛选，获得了2株稳定分泌抗np重组蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为1g3、4b12。经间接elisa测定，腹水抗体效价分别为1:2.56×105、1:5.12×105(刘文丽,等.新城疫病毒f48e9株重组np蛋白单克隆抗体制备及鉴定[j].东北农业大学学报,2011,42(9):131-135.)。程彦丽等获得了2株能稳定分泌抗重组蛋白mab的杂交瘤细胞株a1和b2，经elisa检测a1株和b2株细胞上清效价均为212，诱生的腹水的效价分别为107和106(程彦丽,等.鸭源新城疫病毒核衣壳蛋白单克隆抗体的制备[j].中国预防兽医学报,2013(08):666-668.)。从已有的文献而言，上述的免疫原均为重组表达的np蛋白，而该蛋白的来源毒株(如classⅰ新城疫病毒duck/js/10弱毒株何ndvf48e9株)并非当前流行的vii型毒株；另外，针对np蛋白的单克隆抗体效价不一，对不同ndv毒株的反应效价也报道不全。
单克隆抗体是由单一b细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位(即识别的抗原表位)的抗体(毛开云,等.单克隆抗体技术相关专利分析[j].生物产业技术,2012(6):78-86.)。单克隆抗体的抗原表位(即抗体结合抗原的氨基酸序列)具有特异性。例如，刘培欣制备的新城疫病毒np蛋白单抗18c6识别的抗原表位位于np蛋白第473-481位氨基酸之间，其多肽序列为473ppptpgasq481；单抗24f9识别的抗原表位位于np蛋白第470-478位氨基酸之间，其多肽序列为470hpeppptpg478。因此，解析单克隆抗体识别的抗原表位对后续新城疫病毒蛋白功能研究以及诊断检测等方面具有重要意义。
技术实现要素：
技术问题
本发明的目的是提供一种分泌抗新城疫病毒np蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株，用其制备的小鼠腹水单克隆抗体的反应效价高，抗ndv毒株范围广。
技术方案、
为达到以上目的，是通过以下技术方案实现的：
一种分泌抗新城疫病毒np蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞4f6株，该杂交瘤细胞4f6株于2019年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏中心保藏号cctccno：c2019102，分类命名：分泌抗新城疫病毒np蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株4f6。该杂交瘤细胞4f6株制备的新城疫病毒np蛋白单克隆抗体识别的抗原表位在新城疫病毒np蛋白第140～148位氨基酸，其多肽序列为sngtpfvta。
所述分泌抗新城疫病毒np蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞4f6株可以在制备新城疫病毒np蛋白单克隆抗体诊断检测试剂中的应用。
用所述杂交瘤细胞4f6株可以制备新城疫病毒np蛋白单克隆抗体。用所述新城疫病毒np蛋白单克隆抗体可以制备新城疫病毒np蛋白单克隆抗体诊断检测试剂。
有益效果
本发明用纯化的vii型新城疫病毒抗原免疫balb/c小鼠，制备免疫脾细胞，与sp2/0骨髓瘤细胞系融合，以原核表达的np蛋白和纯化的新城疫病毒进行双重筛选，获得一株既能与原核表达的np蛋白反应又能与新城疫病毒反应的单克隆抗体杂交瘤细胞株，命名为4f6，该细胞株生物学性能十分优良，用其制备的小鼠腹水单克隆抗体对ndv的反应效价高达109、对np蛋白的反应效价高达1010(其效价显著高于现有资料报道的参数值)，并且对基因ii、iii、iv、vi、vii、ix等多个ndv亚型毒株以及鸡、鸭、鹅、鸽源ndv毒株的反应性强，抗ndv毒株范围广，具有良好的应用前景。另外，通过肽扫描的方法筛选出4f6单克隆抗体识别的抗原表位在新城疫病毒np蛋白第140～148位氨基酸，其多肽序列为sngtpfvta，该表位尚未报道。
本发明的特点和优点如下：
1.本发明使用的balb/c小鼠免疫原使用的是ndv当前流行的基因vii强毒株制备的。已有报道显示，筛选的np蛋白单克隆抗体的免疫原均为重组表达的np蛋白，而该蛋白的来源毒株(如classⅰ新城疫病毒duck/js/10弱毒株何ndvf48e9株)并非当前流行的vii型毒株，其免疫抗原存在差异。
2.本发明从建立的78株分泌抗ndv单克隆抗体的杂交瘤细胞库中筛选出一株杂交瘤细胞4f6株，生物学性能十分优良，用其诱生的balb/c小鼠腹水单克隆抗体对ndv的反应效价高达109、对np蛋白的反应效价高达1010，并且对基因ii、iii、iv、vi、vii、ix等多个ndv亚型毒株以及鸡、鸭、鹅、鸽源ndv毒株的反应性强，抗ndv毒株范围广。
3.新城疫病毒np蛋白单克隆抗体(4f6)识别的抗原表位在新城疫病毒np蛋白第140～148位氨基酸，其多肽序列为sngtpfvta，该表位尚未报道。
生物保藏
该杂交瘤细胞4f6株于2019年5月9日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏中心保藏号cctccno：c2019102，分类命名：分泌抗新城疫病毒np蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株4f6。
具体实施方式
(一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立
1.ndv抗原的制备
将当前流行vii型ndv强毒株(购自南京天邦生物科技有限公司)接种9日龄spf鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，48h后收集尿囊液，8000r/min离心30min，取上清，采用peg沉淀和不连续蔗糖密度梯度方法进行纯化，采用bca蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)确定病毒浓度，-70℃保存备用。
2.动物免疫
用纯化的ndv免疫抗原经腹腔注射免疫8周龄雌性balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，50μg/只。首免用等体积弗氏完全佐剂(sigma公司产品)乳化抗原，之后每隔14天用弗氏不完全佐剂(sigma公司产品)如花抗原，再免疫2次。第3次免疫后的第6d断尾采血，用间接elisa方法测定血清抗体效价，选取其抗体效价＞106的小鼠，在融合前3d用纯化的ndv抗原再次加强免疫。
3.细胞融合
采用peg细胞融合方法，取生长状态良好的sp2/0骨髓瘤细胞(购自atcc细胞库)与免疫的balb/c小鼠脾细胞按1:5的比例，充分混匀，1000r/min离心10min，弃上清，用手掌轻击管底，使细胞松散均匀，置于40℃水浴预热，用1ml吸管在45s内加完预热至40℃的50％peg4000(sigma公司产品)1ml，边加边轻轻震荡，然后在90s内加入15ml预热至37℃的无胎牛血清的rpmi-1640培养基，室温静置10min，1000r/min离心10min，弃上清，加入含10％胎牛血清(fcs)(赛默飞世尔科技公司产品)和hat(sigma公司产品)的rpmi-1640培养基重悬，分装到已有饲养细胞的96孔板上，于5％co2培养箱培养。3d后补加含hat(sigma公司产品)和10％fcs(赛默飞世尔科技公司产品)的rpmi-1640培养基，5d后改用含ht(sigma公司产品)和10％fcs(赛默飞世尔科技公司产品)的rpmi-1640培养基，10d后换成含10％fcs(赛默飞世尔科技公司产品)的rpmi-1640培养基培养，当融合的细胞生长至96孔板孔底面积的1/5时，取上清进行抗体检测。
4.杂交瘤细胞株的筛选
按方阵法确定纯化ndv抗原的包被浓度，用包被液为0.05mol/lph9.6碳酸盐缓冲液对纯化的ndv抗原进行倍比稀释，用稀释至800倍的ndv抗原量包被elisa板，100μl/孔，置4℃包被过夜，pbst洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以含10％小牛血清的pbst封闭每孔，200μl/孔，37℃放置2h，pbst洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将融合后12d的细胞上清、1:1000稀释的免疫小鼠阳性血清和1:1000稀释的小鼠阴性血清，加入相应孔内，100μl/孔，37℃作用1h，pbst洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg(上海碧云天生物技术有限公司产品)，100μl/孔，37℃放置1h，pbst洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入tmb底物，100μl/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μl2mol/l硫酸终止反应。经酶标仪测定od450nm值，以空白对照调零，p为各检测孔的值，n为阴性参考血清的od450nm值，当阴性参考血清的od450nm值≤0.1，阳性参考血清的od450nm值与阴性参考血清的od450nm值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，p/n≧2.1的检测孔判为阳性，隔2～3d后再检一次，对两次检测结果均为阳性的杂交瘤细胞进行克隆化。
5.杂交瘤细胞的克隆化
首先将阳性孔活细胞用台盼兰进行染色和计数，用含10％fcs(赛默飞世尔科技公司产品)的rpmi-1640培养基稀释成100个细胞/15ml培养基，将稀释的细胞悬液加入96孔细胞培养板，每孔0.15ml，37℃，5％co2培养箱中培养，4～5d后，显微镜下可观察到克隆细胞的形成，记录下只有单个克隆生长孔，8～9d时取细胞上清，及时进行elisa检测。选择阳性的单克隆细胞再进行同样的克隆3次以上，直至克隆后所有细胞孔上清检测均为阳性、且各孔检测od450nm值较接近。将克隆化的ndv特异单克隆抗体杂交瘤细胞株扩大培养，冻存。经过20次的细胞融合、筛选、克隆、鉴定，建立了78株稳定分泌ndv特异单克隆抗体的杂交瘤细胞库。
6.新城疫病毒np蛋白的表达与纯化
根据当前流行vii型ndv强毒株(购自南京天邦生物科技有限公司)中np基因序列信息，人工合成经大肠杆菌密码子优化的核酸序列(由通用生物系统(安徽)有限公司合成)，在其序列两端分别引入nhei和hindiii酶切位点。随后，将人工合成序列与原核表达质粒pet28a(+)(北京索莱宝科技有限公司产品)分别进行nhei和hindiii(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)酶切消化，经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司产品)分别回收片段，在t4连接酶(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)的连接作用下，4℃孵育16h，转化至e.colirosetta感受态(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)中，获得可以表达新城疫病毒np蛋白的菌株。将该菌株培养至od600nm值约为1.0时，加入终浓度为1mmol/l的iptg(宝日医生物技术(北京)有限公司产品)，于37℃诱导表达6h，收集菌体，并经ni-nta亲和层析柱(ge公司产品)纯化，收集纯化的重组蛋白，经bca蛋白定量检测试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)测定其浓度为1.25mg/ml，-70℃保存备用。
7.新城疫病毒np蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选
按方阵法确定纯化np蛋白的包被浓度，用包被液为0.05mol/lph9.6碳酸盐缓冲液对纯化的np蛋白进行倍比稀释，用稀释至0.1μg/孔，置4℃包被过夜，pbst洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；以含10％小牛血清的pbst封闭每孔，200μl/孔，37℃放置2h，pbst洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；将78株稳定分泌ndv特异单克隆抗体的细胞上清(1:1000稀释)加入相应孔内，100μl/孔，37℃作用1h，pbst洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg(上海碧云天生物技术有限公司产品)，100μl/孔，37℃放置1h，pbst洗涤3次，每次5min，最后一次拍干；加入tmb底物，100μl/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μl2mol/l硫酸终止反应。经酶标仪测定od450nm值，选取od450nm值最高数值所对应的ndv特异单克隆抗体杂交瘤细胞株。上述试验重复3次后结果显示，杂交瘤细胞株4f6单克隆抗体的od450nm值最高。
8.腹水的制备
将灭菌的液体石蜡腹腔注射8～10周龄的balb/c小鼠(购自扬州大学比较医学实验中心)，0.5ml/只，7天后，将杂交瘤细胞株注射入小鼠腹腔，每只0.2ml(含2×106～5×106个杂交瘤细胞)，7～10天后采取腹部明显鼓起小鼠的腹水，3000r/min离心10min，收集上清，分装后于-20℃保存备用。
(二)单克隆抗体4f6的生物学特性
1.杂交瘤细胞株染色体分析
用姬姆萨染色法对杂交瘤细胞进行染色体计数。分别取sp2/0骨髓瘤细胞和阳性杂交瘤细胞培养，生长到对数期，向细胞瓶中加入秋水仙素，使其终浓度为0.1μg/ml，然后放入细胞培养箱中继续培养4～5h。用5ml37℃预温的0.075mol/lkci低渗液将细胞吹起混匀，置37℃温箱作用30min，向其中加入新配制的固定液(甲醇：冰醋酸为3:1)lml，边滴加边混匀，1000r/min离心10min。弃上清留细胞沉淀，用5ml固定液将细胞吹起，37℃作用30min，1000r/min离心10min，重复上述操作一次。细胞沉淀用lml固定液悬起混匀，用滴管吸取悬液1滴，滴在预先冰冻的载玻片上，平铺于载玻片上，自然干燥。用新配制的吉姆萨染液染色10min，自来水冲洗后晾干，置于显微镜下进行观察。此杂交瘤细胞株的染色体数量为94条，而骨髓瘤细胞的染色体的数量为54～64条，小鼠脾细胞染色体数量为40条，证明所获得的此杂交瘤细胞株是两种细胞融合的结果。
2.单克隆抗体的特异性鉴定
实验在24孔细胞培养板中进行。将当前流行vii型ndv强毒株、传染性法氏囊病毒株、h9n2亚型禽流感病毒株(以上毒株均购自南京天邦生物科技有限公司)分别接种到原代鸡胚成纤维(cef)细胞，培养72h病变后，吸弃细胞培养液，用无血清的培养液洗2次，然后向细胞培养孔中加入-20℃预冷的无水乙醇1ml/孔，4℃固定30min，用pbs洗3次，拍干；加入杂交瘤细胞4f6的培养上清液，200μl/孔，37℃孵育1h，pbs洗涤3次，拍干；加入200倍稀释的fitc标记的羊抗鼠igg抗体(武汉博士德生物工程有限公司产品)，200μl/孔，37℃孵育1h，pbs洗涤5次，置于荧光显微镜下观察。在荧光显微镜下，单克隆抗体只能与新城疫病毒wj10001株感染的cef细胞反应，产生荧光，而与其他病原感染的cef细胞无荧光，证明单克隆抗体对ndv的特异性。
3.单克隆抗体的类型测定
用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒(赛默飞世尔科技公司产品)测定杂交瘤细胞4f6株分泌单克隆抗体的亚类，结果显示，该单克隆抗体亚类为igmκ。
4.单克隆抗体的稳定性测定
将获得的杂交瘤细胞4f6株进行连续培养传代50次、液氮冻存与复苏试验，用间接elisa方法连续检测杂交瘤细胞培养上清液中的抗体效价均为105，证明此杂交瘤细胞株4f6能持续稳定地分泌抗ndv单克隆抗体。
5.单克隆抗体的效价测定
用vii型ndv毒株(购自南京天邦生物科技有限公司)作为包被抗原的间接elisa方法(见本发明“具体实施方式，(一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，4.杂交瘤细胞株的筛选”章节内容)测定杂交瘤细胞培养上清和小鼠腹水的效价，结果显示，杂交瘤细胞4f6培养上清elisa效价(即反应效价)为105，腹水反应效价为109。
用np蛋白作为包被抗原的间接elisa方法(见本发明“具体实施方式，(一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，7.新城疫病毒np蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选”章节内容)测定杂交瘤细胞培养上清和小鼠腹水的效价，结果显示，杂交瘤细胞4f6培养上清反应效价为106，腹水反应效价为1010。
对基因ii型ndv毒株(lasota株，购自中国兽医药品监察所)、基因iii型ndv毒株(mukteswar株，购自中国兽医药品监察所)、基因iv型ndv毒株(herts33株，购自中国兽医药品监察所)、基因vi型ndv毒株(购自南京天邦生物科技有限公司)、基因vii型ndv毒株(购自南京天邦生物科技有限公司)、基因ix型ndv毒株(f48e9株，购自中国兽医药品监察所)以及鸡、鸭、鹅、鸽源ndv毒株(购自南京天邦生物科技有限公司)分别进行抗原纯化和浓度测定(具体方法参照本发明“具体实施方式，(一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，1.ndv抗原的制备”章节内容)，用包被液(0.05mol/lph9.6碳酸盐缓冲液)稀释至800倍的ndv抗原量包被elisa板，100μl/孔，置4℃包被过夜，pbst洗涤3次，每次5min；以含10％小牛血清的pbst封闭每孔，200μl/孔，37℃放置2h，pbst洗涤3次，每次5min；分别将不同稀释倍数的单克隆抗体细胞上清和腹水、1:1000稀释的阴性血清加入相应孔内，100μl/孔，37℃作用1h，pbst洗涤3次，每次5min；加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠igg(上海碧云天生物技术有限公司产品)，100μl/孔，37℃放置1h，pbst洗涤3次，每次5min；加入tmb底物，100μl/孔，室温避光显色10min；每孔加入50μl2mol/l硫酸终止反应。经酶标仪测定od450nm值，以空白对照调零，p为各检测孔的值，n为阴性参考血清的od450nm值，当阴性参考血清的od450nm值≤0.1，阳性参考血清的od450nm值与阴性参考血清的od450nm值的比值≥2.1，即阴、阳性对照成立的前提下，p/n≧2.1的检测孔判为阳性，以单克隆抗体阳性孔的最高稀释倍数作为其反应效价。结果显示，杂交瘤细胞4f6培养上清对不同基因型ndv毒株以及不同动物源ndv毒株的反应效价均达到105，腹水反应效价均达到109。
6.单克隆抗体的识别表位筛选
通过肽扫描的方法对所制备单克隆抗体的识别表位进行筛选，根据截短np蛋白氨基酸序列，合成15肽用来进行抗原表位的筛选，每条合成肽的步移为5肽，与前后合成肽各有5个氨基酸重复。合成连续重叠的67条短肽，分别以100ng/孔包被elisa板，以制备的4f6腹水(1:10000)为一抗，hrp-igg为二抗，通过间接elisa方法(见本发明“具体实施方式，(一)单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立，7.新城疫病毒np蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选”章节内容)进行检测，根据检测的od450nm值初步鉴定单克隆抗体的识别表位。结果显示，4f6单克隆抗体识别的抗原表位在np蛋白第140～148位氨基酸，其多肽序列为sngtpfvta，该表位尚未报道。
本发明所述的新城疫病毒np蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株4f6，生物学性能十分优良，用其制备的小鼠腹水单克隆抗体对ndv的反应效价高达109、对np蛋白的反应效价高达1010(其效价显著高于现有资料报道的参数值)，并且对基因ii、iii、iv、vi、vii、ix等多个ndv亚型毒株以及鸡、鸭、鹅、鸽源ndv毒株的反应性强，抗ndv毒株范围广，具有良好的应用前景。另外，通过肽扫描的方法筛选出4f6单克隆抗体识别的抗原表位在新城疫病毒np蛋白第140～148位氨基酸，其多肽序列为sngtpfvta，该表位尚未报道。