用于鉴定心里美萝卜肉色的SNP位点及其应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域中的萝卜鉴定方法，特别涉及一种用于鉴定心里美萝卜肉色的snp位点及其应用。

背景技术：

心里美萝卜又叫红心萝卜，属于十字花科萝卜属萝卜种(raphanussativusvarl.)，是一种特色萝卜品种，因其外皮为浅绿色，其叶深绿色，内里为血红色，且口感脆、口味甜，肉质细嫩而得名。北京心里美以其悠久的种植历史，优良的品质风味，富含抗癌物质花青素享誉京华。心里美肉色是鉴定品种优劣的重要指标，100％的血红瓤率是育种家与种植户所期待的理想品种。但在品种选育过程中发现，在自交或杂交后代会出现白肉植株，影响了品种的纯度及商品性。故肉色鉴定是选育高血红瓤率心里美品种的关键。传统肉色鉴定需要将植株的肉质根切开或在肉质根上打洞，降低育种材料成活率，影响种子的正常繁殖。因此，有必要开发一种快速鉴定北京心里美萝卜红肉与白肉材料的方法。

单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,snp)指基因组单个核苷酸的变异，它是最微小的变异单元，是由单个核苷酸对置换、颠换、插入或缺失所形成的变异形式。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题在于如何在不损伤萝卜肉质根的前提下，提供一种快速鉴定北京心里美萝卜红肉与白肉材料的方法。

本发明要求保护rs_scaf158-73、rs_scaf158-87和/或rs_scaf158-94在鉴定或者辅助鉴定心里美萝卜肉色中的应用；所述rs_scaf158-73是萝卜基因组的一个snp位点，rs_scaf158-73位于萝卜基因组rs_scaf158上seqidno.1的第101位核苷酸，其为t或c；所述rs_scaf158-87是萝卜基因组的一个snp位点，rs_scaf158-87位于萝卜基因组萝卜基因组rs_scaf158上seqidno.2的第101位核苷酸，其为t或c；所述rs_scaf158-94是萝卜基因组的一个snp位点，rs_scaf158-94位于萝卜基因组rs_scaf158上seqidno.3的第101位核苷酸，其为t或c。

本发明还要求保护检测心里美萝卜基因组中rs_scaf158-73的多态性或基因型的物质、检测心里美萝卜基因组中rs_scaf158-87的多态性或基因型的物质和/或检测心里美萝卜基因组中rs_scaf158-94的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定心里美萝卜肉色产品中的应用；所述rs_scaf158-73是萝卜基因组的一个snp位点，rs_scaf158-73位于萝卜基因组rs_scaf158上seqidno.1的第101位核苷酸，其为t或c；所述rs_scaf158-87是萝卜基因组的一个snp位点，rs_scaf158-87位于萝卜基因组rs_scaf158上seqidno.2的第101位核苷酸，其为t或c；所述rs_scaf158-94是萝卜基因组的一个snp位点，rs_scaf158-94位于萝卜基因组rs_scaf158上seqidno.3的第101位核苷酸，其为t或c。

进一步，所述检测心里美萝卜基因组中rs_scaf158-73的多态性的物质为扩增包括rs_scaf158-73在内的心里美萝卜基因组dna片段的引物对，所述引物对包括seqidno.4中第22-48位核苷酸组成的单链dna、seqidno.5中第22-48位核苷酸组成的单链dna和seqidno.6中核苷酸组成的单链dna；

所述检测心里美萝卜基因组中rs_scaf158-87的多态性的物质为扩增包括rs_scaf158-87在内的心里美萝卜基因组dna片段的引物对，所述引物对包括seqidno.7中第22-48位核苷酸组成的单链dna、seqidno.8中第22-48位核苷酸组成的单链dna和seqidno.9中核苷酸组成的单链dna；

所述检测心里美萝卜基因组中rs_scaf158-94的多态性的物质为扩增包括rs_scaf158-94在内的心里美萝卜基因组dna片段的引物对，所述引物对包括seqidno.10中第22-48位核苷酸组成的单链dna、seqidno.11中第22-48位核苷酸组成的单链dna和seqidno.12中核苷酸组成的单链dna。

本发明还提供一种鉴定或辅助鉴定心里美萝卜肉色的方法，包括检测待测心里美萝卜中所述rs_scaf158-73的基因型、所述rs_scaf158-87的基因型和/或所述rs_scaf158-94的基因型，根据待测心里美萝卜的基因型鉴定或辅助鉴定心里美萝卜肉色：

所述rs_scaf158-73的基因型为tt的纯合型，心里美萝卜的肉色为红色或候选为红色；所述rs_scaf158-73的基因型为cc的纯合型，心里美萝卜的肉色为白色或候选为白色；所述rs_scaf158-73的基因型为ct的杂合型，心里美萝卜的肉色为红色或候选为红色；

所述rs_scaf158-87的基因型为tt的纯合型，心里美萝卜的肉色为红色或候选为红色；所述rs_scaf158-87的基因型为cc的纯合型，心里美萝卜的肉色为白色或候选为白色；所述rs_scaf158-87的基因型为ct的杂合型，心里美萝卜的肉色为红色或候选为红色；

所述rs_scaf158-94的基因型为tt的纯合型，心里美萝卜的肉色为红色或候选为红色；所述rs_scaf158-94的基因型为cc的纯合型，心里美萝卜的肉色为白色或候选为白色；所述rs_scaf158-94的基因型为ct的杂合型，心里美萝卜的肉色为红色或候选为红色。

所述rs_scaf158-73、rs_scaf158-87和/或rs_scaf158-94在心里美萝卜育种中的应用也应在本专利的保护范围之内。

进一步，所述心里美萝卜育种为培育绿皮红肉品种。

鉴定或辅助鉴定心里美萝卜肉色的方法在心里美萝卜育种中的应用也应在本发明的保护范围之内。

进一步，所述心里美萝卜育种为培育绿皮红肉品种。

本发明还提供一种心里美萝卜的育种方法，包括：检测心里美萝卜基因组中权利要求1中所述rs_scaf158-73、rs_scaf158-87和/或rs_scaf158-94的多态性，选择萝卜基因组中权利要求1中所述rs_scaf158-73的基因型为tt、rs_scaf158-87的基因型为tt和/或rs_scaf158-94的基因型为tt的心里美萝卜作为亲本进行育种。

下述1)-6)中任一种产品也应在本发明的保护范围之内：

1)扩增萝卜基因组scaf158上seqidno.1的第101位核苷酸在内的dna片段的引物对；

2)由seqidno.4所示的单链dna、seqidno.5所示的单链dna和seqidno.6所示的单链dna组成的引物组合物；

3)扩增萝卜基因组scaf158上seqidno.2的第101位核苷酸在内的dna片段的引物对；

4)由seqidno.7所示的单链dna、seqidno.8所示的单链dna和seqidno.9所示的单链dna组成的引物组合物；

5)扩增萝卜基因组scaf158上seqidno.3的第101位核苷酸在内的dna片段的引物对；

6)由seqidno.10所示的单链dna、seqidno.11所示的单链dna和seqidno.12所示的单链dna组成的引物组合物。

通过鉴定待测萝卜的snp位点的基因型，能够快速的鉴定萝卜的肉质根的肉色。同时对94个f2代心里美萝卜的检测实验结果表明，通过rs_scaf158-73和/或rs_scaf158-87检测肉质根的肉色的准确率可以达到99％，通过rs_scaf158-94检测肉质根的肉色的准确率可以达到98％。

附图说明

图1为96个心里美萝卜品种的rs_scaf158-73基因型的kasp检测结果图；

图2为96个心里美萝卜品种的rs_scaf158-87基因型的kasp检测结果图；

图3为96个心里美萝卜品种的rs_scaf158-94基因型的kasp检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1、材料与方法

萝卜满堂红(板叶)以下简称满堂红，表现为绿皮红肉，购自京研益农(北京)种业科技有限公司。

萝卜京脆1号以下简称京脆1号，表现为绿皮白肉，购自京研益农(北京)种业科技有限公司。

本发明以满堂红(mth-01)为母本，以京脆1号(jc-01)为父本，构建f2群体。利用改良的ctab法提取双亲及f2群体单株的基因组dna，并测定dna质量和浓度。选择20株具有突变体性状(绿皮白肉)的单株，分别取等量的dna均匀混合构建突变体“超级池”f2_mut_type_bulk。利用illuminahiseq2000测序系统分别对双亲mth-01、jc-01和f2_mut_type_bulk进行全基因重测序。

2、与心里美萝卜肉质根花青苷积累紧密连锁的snp位点的发现

心里美萝卜红肉与白肉材料基因组重测序：利用illuminahiseq2000测序系统分别对双亲mth-01、jc-01和f2_mut_type_bulk进行全基因重测序。

根据萝卜参考基因组序列，使用gatk分析软件分别对mth-01、jc-01和f2_mut_type_bulk进行snp分型，共获得snp3,242,800个。在分型结果中得到的snp位点数据较多，为得到造成子代差异性状的候选位点，我们执行以下过滤标准：

(1)亲本基因型为纯合，三个样品中在snp位置都有覆盖；(2)亲本的测序深度都大于等于10；(3)子代的测序深度大于等于10。

在心里美萝卜的染色体中共筛选获得37,638个snp，并计算每个snp的snp-inde值。snp-index为在f2_mut_type_bulk中每个snp位点，比对到该位置突变型碱基所占的比例。

其中，所述萝卜的参考基因组序列为(ncbibioproject：prjdb707)，包含萝卜基因组rs_scaf158序列(genbank:df196983.1)。

候选snp位点的筛选：由于该萝卜参考基因组的组装为scaffold水平，数目较多，有些scaffold长度较短，无法对满足条件的snp位点进行窗口滑动。我们选取snp-index最高的1％作为筛选性状侯区域的阈值。以候选snp位点为中心，前后各延长10kp的长度，作为该候选snp位点所在的候选区域，若某两个候选区域有overlap，则将这两个候选区域合并，形成更大的候选区域。根据该筛选标准初步获得61个侯选区域，覆盖785,125bp，包含388个snp标记(如表1所示)。

表1候选区域snp统计结果

为了验证候选区域内的snp标记的可用性，共合成150对kasp基因分型专用引物，利用mth-01(3株)、jc-01(3株)和f2单株(5株)材料对标记进行初步筛选，结果显示共计65对引物在双亲及f2单株间分型较好。进一步筛选snp位点与肉质根肉色的关系，发现rs_scaf158上的3个snp位点的kasp基因分型结果与f2群体中肉质根肉色共分离。将三个snp位点分别命名为rs_scaf158-73、rs_scaf158-87和rs_scaf158-94。

所述rs_scaf158-73位于萝卜基因组rs_scaf158上的第248277位核苷酸，其为c或t，rs_scaf158-73对萝卜基因组rs_scaf158上应于seqidno.1第101位核苷酸,seqidno.1中第101位的y表示其可以为c或t；rs_scaf158-73的基因型有如下三种：tt(t:t)、cc(c:c)和tc(t:c)，其中，tt是seqidno.1的第101位(rs_scaf158-73)为t的纯合型，cc是seqidno.1的第101位(rs_scaf158-73)为c的纯合型，tc是seqidno.1的第101位(rs_scaf158-73)为t和c的杂合型。

所述rs_scaf158-87位于萝卜基因组rs_scaf158上的第257194位核苷酸，其为t或c，rs_scaf158-87对应于萝卜基因组rs_scaf158上seqidno.2的第101位核苷酸,seqidno.2中第101位的y表示其可以为c或t；rs_scaf158-87的基因型有如下三种：tt(t:t)、cc(c:c)和tc(t:c)，其中，tt是seqidno.2的第101位(rs_scaf158-87)为t的纯合型，cc是seqidno.2的第101位(rs_scaf158-87)为c的纯合型，tc是seqidno.2的第101位(rs_scaf158-87)为t和c的杂合型。

所述rs_scaf158-94位于萝卜基因组rs_scaf158上的第266436位核苷酸，其为c或t，rs_scaf158-94对应于萝卜基因组rs_scaf158上的seqidno.3的第101位核苷酸，seqidno.3中第101位的y表示其可以为c或t；rs_scaf158-20的基因型有如下三种：tt(t:t)、cc(c:c)和tc(t:c)，其中，tt是seqidno.3的第101位(rs_scaf158-94)为t的纯合型，cc是seqidno.3的第101位(rs_scaf158-94)为c的纯合型，tc是seqidno.3的第101位(rs_scaf158-94)为t和c的杂合型。

rs_scaf158-73、rs_scaf158-87和rs_scaf158-94分别对应的kasp基因分型引物如表2所示，其中，位于引物5’端的5’-gaaggtgaccaagttcatgct-3’为fam荧光标签序列；位于引物5’端的5’-gaaggtcggagtcaacggatt-3’为hex荧光标签序列。

表2与心里美萝卜肉质根肉色紧密连锁的snp位点及kasp基因分型引物

3、检测表3的96个心里美萝卜的rs_scaf158-73、rs_scaf158-87和rs_scaf158-94的基因型

1)96个心里美萝卜的rs_scaf158-73基因型的检测

从表3的96个心里美萝卜(包括mth01和jc01，以及以mth-01为母本、以jc-01为父本构建的f2群体中的94个单株)的叶片中提取基因组dna，用kasp基因分型引物73-f1、73-f2和73-r对其进行pcr扩增和检测，确定心里美萝卜基因组rs_scaf158第248277位(rs_scaf158-73)核苷酸的种类。根据各个心里美萝卜基因组rs_scaf158第248277位(rs_scaf158-73)的核苷酸种类确定各个心里美萝卜的rs_scaf158-73基因型。

其中，kasp基因分型pcr反应体系：10ng基因组dna，5μlkaspv4.02×mastermix，0.14μlkasp72×assaymix，加ddh2o至10μl。其中，kaspv4.02×mastermix为lgc公司产品，由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真的taq酶，dntp等组成。kasp72×assaymix由浓度为100μmol·l^-1的73-f1、73-f2和73-r与ddh2o按12︰12︰30︰46的体积比混合得到。试验同时设置反应体系中不添加模板dna的空白对照，每个pcr板设置1个空白对照。

梯度pcr反应程序包括：95℃变性15min；10个循环，94℃变性20s，61℃(每循环降0.6℃)退火60s；26个循环，94℃变性20s，55℃退火60s。

采用双向单激发读板仪pherastar对pcr扩增产物进行扫描，fam激发波长为485nm，发射波长为520nm，hex激发波长为528nm，发射波长为560nm，系统参比荧光rox激发波长为575nm，发射波长为610nm。

采用krakentm软件对双向单激发读板仪pherastar扫描数据分析：聚合在接近x轴的显示蓝色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的等位基因型，聚合在接近y轴上的显示红色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为两种等位基因的杂合型。相应的，若检测的结果为靠近y轴的为红点表示rs_scaf158-73基因型为t:t；若检测结果为靠近x轴的蓝点表示rs_scaf158-73基因型为c:c；若检测的结果为位于中间区域的绿点表示基因型为c:t。此外，显示粉色的样本可能由于dna质量不好或浓度过低，扩增产物没有被明确分型，左下角显示黑色的样本为空白对照。图1为96个心里美萝卜的rs_scaf158-73基因型的kasp检测结果图，所述96个心里美萝卜的rs_scaf158-73基因型与其肉质根的肉色的对照如表3所示。

从表3的96个心里美萝卜(包括亲本的mth01和jc01，以及94个f2群体中的植株)的叶片中提取基因组dna，用kasp基因分型引物87-f1、87-f2和87-r对进行pcr扩增和检测，确定心里美萝卜基因组rs_scaf158第257194位(rs_scaf158-87)核苷酸的种类。根据各个心里美萝卜基因组rs_scaf158第257194位(rs_scaf158-87)的核苷酸种类确定各个心里美萝卜的rs_scaf158-87基因型。通过kasp法检测(检测方法和判定原则参考96个心里美萝卜的rs_scaf158-73基因型的检测中记载)，若检测的结果为靠近y轴的为红点表示rs_scaf158-87基因型为c:c；若检测结果为靠近x轴的蓝点表示rs_scaf158-87基因型为t:t；若检测的结果为位于中间区域的绿点表示基因型为c:t。图2为96个心里美萝卜的rs_scaf158-87基因型的kasp检测结果图，所述96个心里美萝卜的rs_scaf158-87基因型与其肉质根的肉色的对照如表3所示。

从表3的96个心里美萝卜(包括亲本的mth01和jc01，以及94个f2群体群体中的植株)的叶片中提取基因组dna，用kasp基因分型引物94-f1、94-f2和94-r对进行pcr扩增，用kasp法对pcr产物进行检测，确定心里美萝卜基因组rs_scaf158第266436位(rs_scaf158-94)核苷酸的种类。根据各个心里美萝卜基因组rs_scaf158第266436位(rsscaf158-94)的核苷酸种类确定各个心里美萝卜的rsscaf158-94基因型。通过kasp法检测(检测方法和判定原则参考96个心里美萝卜的rs_scaf158-73基因型的检测中记载)，若检测的结果为靠近y轴的为红点表示rs_scaf158-94基因型为c:c；若检测结果为靠近x轴的蓝点表示rs_scaf158-94基因型为t:t；若检测的结果为位于中间区域的绿点表示基因型为c:t。图3为96个心里美萝卜的rs_scaf158-94基因型的kasp检测结果图，所述96个心里美萝卜的rs_scaf158-94基因型与其肉质根的肉色的对照如表3所示。

上述96个心里美萝卜的基因型检测结果和肉色的对应关系如表3所示。由表3中可以看出，心里美萝卜的rs_scaf158-73基因型为tt时，其对应的心里美萝卜的性状为绿皮红肉；心里美萝卜的rs_scaf158-73基因型为ct时，其对应的心里美萝卜的性状为红皮红肉；心里美萝卜的rs_scaf158-73基因型为cc时，其对应的心里美萝卜的性状为绿皮白肉。通过鉴定萝卜中rs_scaf158-73的基因型检测萝卜肉质根的肉色，如果不考虑皮色的因素，对肉色的检测准确率为99％(12-96除外)。

心里美萝卜的rs_scaf158-87基因型为tt时，其对应的心里美萝卜的性状为绿皮红肉；心里美萝卜的rs_scaf158-87基因型为ct时，其对应的心里美萝卜的性状为红皮红肉；心里美萝卜的rs_scaf158-87基因型为cc时，其对应的心里美萝卜的性状为绿皮白肉。通过鉴定萝卜中rs_scaf158-87的基因型检测萝卜肉质根的肉色，如果不考虑皮色的因素，对肉色的检测准确率为99％(12-96除外)。

心里美萝卜的rs_scaf158-94基因型为tt时，其对应的心里美萝卜的性状为绿皮红肉；心里美萝卜的rs_scaf158-94基因型为tc时，其对应的心里美萝卜的性状为红皮红肉；心里美萝卜的rs_scaf158-94基因型为cc时，其对应的心里美萝卜的性状为绿皮白肉。通过鉴定萝卜中rs_scaf158-94的基因型检测萝卜肉质根的肉色，如果不考虑皮色的因素，对肉色的检测准确率为98％(基因型与肉色不符的为表3中的12-96和12-110)。

表3利用96个植株进行3个snp位点的kasp基因分型检测结果

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

序列表

<110>北京市农林科学院

<120>用于鉴定心里美萝卜肉色的snp位点及其应用

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>2

<211>201

<212>dna

<213>raphanussativus

<400>2

tatagcttgagaaacaggtatatgtatctactacctacacagcgtaccatgaagaaatct60

gttcaaattgatgactgtgagtactccttaggaacagagcyctctgaggagcctagagtt120

gaggagggaaggttgtaatcactaggaagaagaagagggtggtaataaagaaaggtgacg180

actttgctgctgaggaggatg201

<210>2

<211>201

<212>dna

<213>raphanussativus

<400>2

accatatgcactaaaagatcatccccttctctttcttttcatctaaaaacattaccttca60

ctgagaagaaagcaaaatcaataatgggacacctattagaycctaaaagcatgaatgaga120

ttaatggagatgatgaaaccgagcttggtttgagggcagtgaggctagccaattacatta180

ccttccccatggttttcaaag201

<210>3

<211>201

<212>dna

<213>raphanussativus

<400>3

tgaactcagtgtgttcattttctttgaagagcttctaaattccatattaggtccccatgc60

ttcttctggcaccaattgagtgtatgtatccaaaagttgtyctgctgtcagatttgcact120

catacaactgtccttattgatctccattgcttcttctgagctgctcttctcagtgttgcc180

ttcagaaaagtttacatgcaa201

<210>4

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gaaggtgaccaagttcatgctctgtgagtactccttaggaacagagcc48

<210>5

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gaaggtcggagtcaacggattctgtgagtactccttaggaacagagct48

<210>6

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

catcctcctcagcagcaaagtcgtcacctt30

<210>7

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

gaaggtgaccaagttcatgctaaatcaataatgggacacctattagat48

<210>8

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gaaggtcggagtcaacggattaaatcaataatgggacacctattagac48

<210>9

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ctttgaaaaccatggggaaggtaatgtaat30

<210>10

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

gaaggtgaccaagttcatgctattgagtgtatgtatccaaaagttgtt48

<210>11

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gaaggtcggagtcaacggattattgagtgtatgtatccaaaagttgtc48

<210>12

<211>30

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

ttgcatgtaaacttttctgaaggcaacact30