本发明涉及生物技术领域，尤其涉及家禽基因功能技术领域，具体涉及一种用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记及其应用。
背景技术：
随着消费水平的不断提高，市场对肉鸭的需求趋向多元化，但目前市场上的品种多存在脂肪率高、瘦肉率低的特点，鲜有低低脂多肉型品种的存在。同时，脂肪率高的鸭肉在存储和运输过程中会更容易酸化腐败，给深加工带来一定的困难。因此，培育瘦肉型肉鸭是现代育种工作中亟待解决的问题。
在传统育种中，脂肪率和瘦肉率无法通过活体直接测定，必须屠宰后进行测定，造成了无法将优良个体留作种用的问题。育种工作者也尝试用改变饲料转化率、杂交等方式来得到优良的瘦肉型肉鸭，但因为育种周期长等原因育种效果不明显。目前，包括x射线摄影、核磁共振及超声波在内的成像技术也被应用到检测肉鸭的胸肌率和皮脂率中，但由于设备不便于携带、精确率不高等原因应用还不太广泛。随着分子生物技术的发展，分子标记辅助选择越来越受到育种工作者的青睐，通过分子标记辅助选择可以有目的的进行基因累加，把多种优质肉鸭的重要性状结合起来，大大缩短鸭育种的年限。
尽管str和snp分子标记在鸭生产性状相关候选基因鉴定和应用方面取得了一些进展。但是str存在的无效等位基因会使基因型判断存在错误，目前也有一些学者提出可以用毛细管电泳和sanger测序的结果互相校正以得到更加准确基因型。同时，单个snp的效应也不强，也有学者通过多个snp组成单倍型来获得更高的效应。更加准确的str分型和多个snp位点组成的复合标记在鸭的育种重还未见报道。
mef2基因家族是调控骨骼肌发育的转录因子，而作为其家族成员的mef2d基因对肌肉的发生、发育和再生具有重要作用。前人的研究发现，在鸭mef2d基因外显子中存在cag重复的多态性，而其str区域单核苷酸突变情况还有待探索。因此研究mef2d基因cag重复区域snp情况，并开发能准确选育瘦肉型肉鸭的复合分子标记很有必要。
综上所述，现有技术存在的问题是：
1)传统的瘦肉型肉鸭选育主要是通过对同胞或后裔进行屠宰测定胴体性状,然后根据遗传参数进行推测从而达到选育的效果。但是，因屠宰需投人大量的资金和相对较长的时间,同时需要测量人员要有足够的熟练度来保证数据的准确性。
2)成像技术辅助选育也被应用于瘦肉型肉鸭的选育工作中，根据核磁共振或超声波技术检测胸肌的厚度，再根据皮下脂肪和胸肌厚的转换公式估计出皮下脂肪的含量。超声波成像技术的准确率在60％左右，核磁共振成像技术的准确率在80％左右但由于其设备不便于携带在试剂运用过程中并不广泛。
3)str分子标记辅助越来越受到育种工作者的青睐，但是由于无效等位基因的存在使微卫星分型工作存在一定的错误。
4)单个snp效应不够强等原因导致目前能够用于实践的分子标记还很有限。
基于上述情况，本发明提出了一种用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记及其应用，可有效解决以上问题。
技术实现要素：
本发明针对畜禽育种过程中无法对肌肉和脂肪性状进行活体选育并且育种进程慢的问题，开发了一种复合分子标记，用于检测瘦肉型肉鸭。本发明的目的在于提供一种用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记及其应用。本发明的用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记是在鸭身上首次利用微卫星和单核苷酸突变两种分子标记形成复合标记。
为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是：
一种用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记，其特征在于：所述复合分子标记的核苷酸序列如seqno.1所示，即：tgccgattccttcgctgcgcttttggggagctgcagcgggcggtgggggctgcgtggggggctcctggggagggggctcgtgcctcggagctgggagagaggtgccccgtggccagcgctgccgtgggactcggtgccagccgtgctgctgctcacgttgacgttgtgctgctccttcccttgcagattatcagctgacgagcgctgagttgtcctcgctgcccgcattcagctctcccgggggcttgtccctcggcaacatctctgcctggcagcagcagcagcagcagcagcagcaycaacaycagcaycagcagcagcaycaycagcagcagcagcaycaycaycaycaycaycaycagcaycaycagcagcaycagcag(cagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcagcag)cacctcgttcccgtctcgctagggaacttaatgtaagtgacacgggtaccgtgggcggctcagttcgtgctgcaaaaggggagaaaaaaaaacaaaaagggaaaggggagcctgtccccgctgtcctggcaatgagcaggggtccccaggcgaggtcggagactcgggggggatttcggagagctgtggctggagatttgggggtcctggcgcatcgctccctgatggggggagctgaggtccaaaagggggcagagtagccctggggtgagcggtgacggggtgaccgtggaaggatg；其中，第273-421位重复数为37、40、46或49；第299、305、311、323、325、328、331、334、337、340、343、346、349和358位的y表示a或g。
本发明的用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记是在鸭身上首次利用微卫星和单核苷酸突变两种分子标记形成复合标记。
优选的，所述复合分子标记通过对鸭mef2d基因进行扩增后pcr测序和毛细管电泳而获得。
本发明还提供一种用于检测所述的用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记的引物对，所述引物对的核苷酸序列如表1所示。
表1
本发明还提供一种所述的用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记检测瘦肉型肉鸭基因型的方法，其特征在于：
s1、动物及样本收集；
s2、dna制备；
s3、毛细管电泳多态性验证；
s4、pcr测序多态性及snps鉴定；
s5、鸭mef2d基因变异的功能分析。
优选的，即根据两次测序结果分析得到的cag重复数来校正毛细管电泳结果，排除无效等位基因的错误。具体表现为若三次测序结果种存在一次及以上的杂合子结果，最终基因型判定为杂合子基因型。进而确定5个cag重复基因型(37/40、40/40、40/46、/40/49、49/49)，为避免观测个数较少，造成误差过大，去除n<3的基因型，分析基因型和屠宰性状的相关性。
优选的，确定了cag内部的15个snp位点，共确定出9个主要的单倍型组合。为避免观测个数较少，造成误差过大，去除n<3的基因型，在相同的cag重复基因型内分析不同snp单倍型组合和屠宰性状的相关性。
本发明所述的与瘦肉率、腿肌率、胸肌率、皮脂率和腹脂率相关的mef2d基因分子复合标记可以应用于鸭标记辅助选择育种中。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
本发明的用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记是在鸭身上首次利用微卫星和单核苷酸突变两种分子标记形成复合标记。
本发明为瘦肉型鸭的标记辅助选择育种提供了一种新的分子标记方法，以培育出低脂多肉的优质肉鸭品系。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是不能理解为对本专利的限制。
下述实施例中所述试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均从常规商业途径获得，或以常规方法制备。
本发明以包含mef2d基因的待测鸭全基因组dna为模板，用引物对1和2为引物，pcr扩增鸭mef2d基因cag重复区域后分别进行正反向测序，用引物对3通过毛细管电泳鉴定cag重复多态性。将正反向测序得到的cag重复多态性与毛细管电泳得到的结果进行校正后得到最终cag重复基因型。同时，获得cag内部snp单倍型组合。最后cag重复和内部snp单倍型组合形成的复合基因型与屠宰性状关联分析，发现提高瘦肉率、胸肌率和腿肌率同时降低皮脂率和腹脂率的复合分子标记。
实施例1：
s1、动物及样本收集
本研究选用的gf2系列中华绒鸭由四川农业大学家禽养殖场提供。本实验选取了225只农华麻鸭(公母各半)，在饲养期间，饲养条件、饲养管理和营养水平保持一致。用鸭子在线平台进行实验，将采集到的每只个体和全血标本经acd抗凝治疗后提高至9周，并在-20℃保存，用于基因组dna提取。屠宰试验按国家标准ny/t823-2004(家禽生产性能术语和测量统计方法)和ny/t1333-2007(禽肉质量测定)进行。以上操作均按照四川农业大学动物福利委员会的要求进行。
s2、dna制备
采用酚氯仿法提取全血基因组dna，经nanodrop2000和凝胶电泳鉴定dna在-20℃。
s3、毛细管电泳多态性验证
按130:1混合hidi和内部500标准，混合。采用国产96孔反应板组装，每孔加入9ul。在96孔板中加入1ul稀释pcr产物模板，离心至4000rpm停止。用金属浴加热器将95℃混合板加热变性5分钟，取出后立即放入-20℃。冷却后，离心4000转/分，解冻，混合，用abi3730测序仪进行毛细管电泳。在检测过程中，使用genescanversion3.0(appliedbiology,usa)采集数据，校准泳道线和内部分子量标准，测量迁移片段的大小。采用genemapper软件version4.0(美国应用生物公司)对等位基因进行处理和分析，获得原始数据。获得数据后，根据各自的电泳峰形对等位基因进行人工检测。
s4、pcr测序多态性及snps鉴定
根据北京鸭mef2d基因序列(genbanknonw_004677191.1)利用课题组初步扩增序列(genbankno:kt876438.1)得到的序列，采用引物1和2。以制备的全血基因组dna为扩增模板，通过pcr特异性扩增mef2d基因编码区和两端侧翼序列的cag重复序列。10μl反应系统是用于pcr:0.4μl上游和下游引物,1μl模板,5μl混合和3.2μlddh2o。反应条件如下:98℃5min；98℃10sec，退火温度15sec,72℃30sec,35个循环；72℃10min,4℃。经1.5％琼脂糖凝胶电泳检测合格的pcr反应产物送至华大基因(北京)测序。根据测序结果，利用seqman和dnaman软件对序列进行处理和比较，结合峰图，识别cag重复序列内侧翼序列的cag重复次数变化和snp位点。
表2双向测序和毛细管电泳结果进行cag重复分型
表3群体中snp突变类型基因型频率
表4群体中snp单倍型组合频率
s5、鸭mef2d基因变异的功能分析
为了研究mef2dcag重复序列在鸭群体中的可能功能作用及其区域变异(cag重复序列数和snp)，我们对cag重复序列基因型、snp单倍型和几个性状进行了相关分析。所有统计分析均采用ibmspss软件进行，显著性定义为p<0.05。结果用平均值±标准误差表示。针对mef2d基因编码区cag多态性及其侧翼序列中snp与单倍型的结合，采用一般线性模型对各性状进行相关性分析，并采用lsd方法进行多重比较。具体分析模型如下:yij＝μ+gi+sj+εij
yij是观察到的特征,μ为每个特征,总体均值gi是基因型效应,sj性的固定效果,εij是随机的环境效应。
表5cag重复基因型性状关联分析
注：*为差异显著(p<0.05)
表6snp单倍型组合性状关联性分析
注：*为差异显著(p<0.05)
表740/40基因型个体与snp单倍型组合形成的复合标记关联性分析
注：*为差异显著(p<0.05)
表840/49基因型个体与snp单倍型组合形成的复合标记关联性分析
注：*为差异显著(p<0.05)
通过本发明的实施，选择40/40基因型且单倍型组合为9和40/49基因型且单倍型组合为8的个体，被选择出的鸭腿肌率、胸肌率、瘦肉率比群体平均值提高3.99％、4.89％、5.09％，腹脂率和皮脂率下降4.81％和12.00％。
表9复合标记应用前后性状数值对比
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视+为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110>“四川农业大学”
<120>一种用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记及其应用
<130>
<160>3
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>717
<212>dna
<213>用于检测瘦肉型肉鸭的复合分子标记
<400>1
tgccgattcctcgctgcgcttttggggagctgcagcgggcggtgggggctgcgtgggggg60
ctcctggggagggggctcgtgcctcggagctgggagagaggtgccccgtggccagcgctg120
ccgtgggactcggtgccagccgtgctgctgctcacgttgacgttgtgctgctccttccct180
tgcagattatcagctgacgagcgctgagttgtcctcgctgcccgcattcagctctcccgg240
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