一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重PCR检测引物及试剂盒的制作方法

本发明涉及病毒株鉴别方法技术领域，更具体地，涉及一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和/或360-505r基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒。

背景技术：

非洲猪瘟(africanswinefever，asf)是由非洲猪瘟病毒(africanswinefevervirus，asfv)，可引起急性出血热，导致猪的大量发病率和死亡率事件(死亡率接近100％)。世界动物卫生组织(oie)将其列为必须报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫病。从2018年第一例非洲猪瘟在我国爆发来，非洲猪瘟对我国养猪业造成重大的损失，严重影响我国的养猪业的健康发展。非洲猪瘟疫情已经扩散到亚洲多个国家。非洲猪瘟对我国乃至亚洲国家的影响将会持续很长时间。国内外研究表明非洲猪瘟病毒cd2v和360-505r基因敲除后，可以显著降低病毒毒性，敲除这两个基因的非洲猪瘟活病毒有望成为疫苗。

非洲猪瘟病毒属于dna病毒目，非洲猪瘟病毒科，非洲猪瘟病毒属成员，是一种具有20面体结构，直径为175～215nm，基因组全长170～190kb，含有151个开放阅读框，可编码150～200种蛋白，具有囊膜的双股线性dna病毒。

近年来，国内外学者对其建立了荧光抗体试验、普通pcr诊断，sybrgreen实时荧光定量pcr等技术进行asf的检测。普通pcr方法成本较低，操作方便，得到了广泛应用。在pcr方法检测非洲猪瘟病毒cd2v和360-505r基因缺失毒株的时候，通过分别扩增cd2v和360-505r基因来确定是否基因缺失。存在步骤繁琐，不利于快速鉴定，而且普通pcr方法灵敏度相对较低。

技术实现要素：

本发明第一方面的目的，在于提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和/或360-505r基因缺失株的巢式二重pcr检测引物组。

本发明第二方面的目的，在于提供包含上述检测引物的试剂盒。

本发明第三方面的目的，在于提供一种巢式二重pcr鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和/或360-505r基因缺失株的快速区分方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和/或360-505r基因缺失株的巢式二重pcr检测引物组，包括外侧引物组及内测引物组，所述检测引物组的核苷酸序列如下所示：

外侧引物组：

asfv-cd2v-f1：5’gataatttcgccaccgcactag3’(seqidno：1)；

asfv-cd2v-r1：5’ctgtgggcctcatttttcgtt3’(seqidno：2)；

asfv-360-505r-f1：5’tcatttagagaaggtcatcataggagc3’(seqidno：3)；

asfv-360-505r-r1：5’agactgttgttcactggtttgagat3’(seqidno：4)；

内测引物组：

asfv-cd2v-f2：5’ttattgccctaaagattgggttgg3’(seqidno：5)；

asfv-cd2v-r2：5’gctgtttgatttctaggagagcttg3’(seqidno：6)；

asfv-360-505r-f2：5’ctattcaacgagcaggaaacaact3’(seqidno：7)；

asfv-360-505r-r2：5’tacaccatactgaacctagctttcc3’(seqidno：8)。

本发明的第二个方面，提供一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和/或360-505r基因缺失株的巢式二重pcr检测试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一个方面所述的检测引物组。

进一步地，所述试剂盒中还包括dna提取试剂和pcr扩增试剂。

更进一步地，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。

优选地，所述阳性对照品为包含非洲猪瘟病毒cd2v基因的质粒dna；所述阴性对照品为去离子水。

本发明的第三个方面，提供一种巢式二重pcr鉴别非洲猪瘟病毒野毒株与cd2v和/或360-505r基因缺失株的快速区分方法，包括以下步骤：

s1.从样品中提取病毒核酸；

s2.以步骤s1中提取的核酸为模板，用权利要求1中所述的外侧引物组对样品进行第一次二重pcr扩增反应获得扩增产物a；

s3.以步骤s2中扩增产物a为模板，用权利要求1所述的内侧引物组对样品进行第二次二重pcr扩增反应获得扩增产物b；

s4.将步骤s3中pcr扩增产物b进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。

进一步地，根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤s4所述确定病毒类型的方法为：

当无扩增产物时，则样品中没有病毒；

当扩增产物为一条片段，大小为1637bp，则样本中的病毒为野毒株；

当扩增产物为两条片段，大小分别为553和239bp，则样本中的病毒缺失cd2v和360-505r基因；

当扩增产物为三条片段，大小分别为1637，553和239bp，则样品中为cd2v和360-505r基因缺失毒株和野毒株混合感染。

优选地，步骤s2所述第一次二重pcr扩增反应的反应体系包括：2×premixprimestarhs10μl，外侧引物组asfv-cd2v-f1/r1(20μm)、asfv-360-505r-f1/r1(10μm)各1μl，模板dna1μl，补加去离子水至20μl。

优选地，步骤s3所述第二次二重pcr扩增反应的反应体系包括：2×premixprimestarhs10μl，内侧引物组asfv-cd2v-f2/r2(20μm)、asfv-360-505r-f2/r2(10μm)各1μl，模板dna1μl，补加去离子水至20μl。

更优选地，所述2×premixprimestarhs包含takaraprimestarhsdnapolymerase1.25u/25μl，dntpmixture各0.4mm，primestarbuffer2mmmg²⁺。

进一步地，步骤s2所述第一次二重pcr扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，54℃退火5s，72℃延伸2min，共25个循环；最后72℃延伸10min。

进一步地，步骤s3所述第二次二重pcr扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，54℃退火5s，72℃延伸1min30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

本发明的有益效果是：

1.巢式pcr，是使用两对pcr引物扩增目的片段的pcr方法，经过两次pcr扩增，可以极大程度的提高普通pcr的灵敏度，且二次pcr引物发生非特异性结合的概率极低。多重pcr(multiplexpcr)，又称多重引物pcr或复合pcr，它是在同一pcr反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的pcr反应，是一种快速准确的检测方法。本发明综合利用巢式pcr和多重pcr的优势，利用4对引物两次二重pcr扩增非洲猪瘟病毒cd2v和360-505r基因，灵敏度高，比普通二重pcr灵敏度高10¹⁰个级别以上。通过二重pcr同时检测两个基因，减少了鉴定不同基因的检测成本和检测时间。

2.本项目通过巧妙设计引物的区域，不单单可以简便的凝胶电泳可以非常简便鉴别检测的样品是否有非洲猪瘟病毒感染，以及感染的毒株是否有基因缺失，还能判断是否有野毒株和基因缺失株的混合感染。

3.本发明具有特异性强、可重复性好等优势，仅对非洲猪瘟病毒(asfv)的dna产生特异性的扩增反应，对猪瘟病毒(csfv)、猪伪狂犬病毒(prv)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(prrsv)、猪细小病毒(ppv)、猪乙型脑炎病毒(jev)、轮状病毒(rv)、猪流行性腹泻病毒(pedv)和猪德尔塔冠状病毒(pdcov)的核酸等均无扩增反应。

4.本发明的专用试剂盒经济实惠，仅需两次二重pcr扩增即可鉴别出两个基因，对于传统巢式pcr方法分别扩增检测两个基因的样本来说，成本降低了约1/2。

5.本发明为我国非洲猪瘟病毒的临床检测提供了新手段，该试剂盒临床应用操作便捷，实用性强，可用于生产实践中非洲猪瘟病毒的疫情监控、鉴别诊断以及疫病的净化，也可用于专业实验室对非洲猪瘟病毒株的快速鉴定，可为提升我国非洲猪瘟的综合防控水平提供技术支撑。

附图说明

图1巢式二重pcr引物及位点示意图。

图2非洲猪瘟病毒(asfv)巢式二重pcr优化试验结果。注：m：dl2000marker；1：cd2v基因缺失；2：360-505r基因缺失；3：无基因缺失的野毒株；4：缺失cd2v和360-505r株；5：cd2v和360-505r基因缺失株和野毒株混合；6：阳性质粒(cd2v和360-505r基因)；7：阴性对照(去离子水)。

图3非洲猪瘟病毒(asfv)巢式二重pcr特异性试验结果。注：1：无基因缺失的野毒株；2：缺失cd2v和360-505r株；3：缺失cd2v和360-505r株和野毒株混合；4：阳性质粒(cd2v和360-505r基因)；5：阴性对照(去离子水)；6：猪瘟病毒(csfv)；7：猪伪狂犬病毒(prv)；8：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(prrsv)；9：猪细小病毒(ppv)；10：猪乙型脑炎病毒(jev)；11：轮状病毒(rv)；12：猪流行性腹泻病毒(pedv)；13：猪德尔塔冠状病毒(pdcov)；14：猪圆环病毒ⅱ(pcv2)。

图4非洲猪瘟病毒(asfv)巢式二重pcr敏感性试验结果。注：m：dl2000marker；1-11：模板浓度分别为1×10^-8ng/μl、1×10^-9ng/μl、1×10^-10ng/μl、1×10^-11ng/μl、1×10^-12ng/μl、1×10^-13ng/μl、1×10^-14ng/μl、1×10^-15ng/μl、1×10^-16ng/μl、1×10^-17ng/μl、1×10^-18ng/μl。

图5非洲猪瘟病毒(asfv)外侧引物二重pcr敏感性试验结果。注：m：dl2000marker；1-9：模板浓度分别为1×10^-2ng/μl、1×10^-3ng/μl、1×10^-4ng/μl、1×10^-5ng/μl、1×10^-6ng/μl、1×10^-7ng/μl、1×10^-8ng/μl、1×10^-9ng/μl、1×10^-10ng/μl。

图6非洲猪瘟病毒(asfv)内侧引物二重pcr敏感性试验结果。注：m：dl2000marker；1-8：模板浓度分别为1×10^-3ng/μl、1×10^-4ng/μl、1×10^-5ng/μl、1×10^-6ng/μl、1×10^-7ng/μl、1×10^-8ng/μl、1×10^-9ng/μl、1×10^-10ng/μl。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例中所用的原料如无特殊说明，均可从常规商业途径得到。

实施例1引物设计

发明人大量对比ncbi(美国国立生物信息中心)的genbank数据库中已公布的非洲猪瘟病毒(asfv)的cd2v和360-505r基因高度保守且具有特异性区域，设计为asfvcd2v和360-505r基因为特异性外侧引物对和内侧引物对，外侧引物对分别命名为p1、p2、p3、p4；内侧引物对分别命名为p5、p6p7、p8。引物的位置如附图1所示。由此来提供了一种鉴别asfv野生型毒株和基因缺失的毒株的巢式pcr引物，具体为：

外侧引物组：

p1:asfv-cd2v-f1：5’gataatttcgccaccgcactag3’，如seqidno：1所示；

p2:asfv-cd2v-r1：5’ctgtgggcctcatttttcgtt3’，如seqidno：2所示；

p3:asfv-360-505r-f1：5’tcatttagagaaggtcatcataggagc3’，如seqidno：3所示；

p4:asfv-360-505r-r1：5’agactgttgttcactggtttgagat3’，如seqidno：4所示。

内侧引物组：

p5:asfv-cd2v-f2：5’ttattgccctaaagattgggttgg3’，如seqidno：5所示；

p6:asfv-cd2v-r2：5’gctgtttgatttctaggagagcttg3’，如seqidno：6所示；

p7:asfv-360-505r-f2：5’ctattcaacgagcaggaaacaact3’，如seqidno：7所示；

p8:asfv-360-505r-r2：5’tacaccatactgaacctagctttcc3’，如seqidno：8所示。

外侧引物p1和p2用于扩增asfv的cd2v片段，片段长度为2179bp。

外侧引物p3和p4用于扩增asfv的360-505r片段，片段长度为484bp。

内侧引物p5和p6用于扩增asfv的cd2v片段，片段长度为1637bp。

内侧引物p7和p8用于扩增asfv的360-505r片段，片段长度为239bp。

实施例2三重pcr检测方法

材料与方法

1.1实施例1中引物

1.2样品dna提取

对dna提取没有特殊要求，可按常规方法或者dna提取试剂盒提取。提取的dna置-20℃保存备用或立即用于pcr扩增。

1.3阳性质粒

以genbank数据库中已公布的asfvcd2v和360-505r基因全长加上两侧的部分序列人工合成基因，与puc57载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，涂布于含50mg/l硫酸卡纳霉素的lb培养基平板上，37℃培养12-16h，挑菌筛选测序鉴定后，扩大培养阳性菌液后提取质粒，将阳性的质粒分别命名为puc57-cd2v和puc57-360-505r。

人工比对genbank数据库中已公布的asfvcd2v基因及其两侧的部分序列后设计引物asfv-cd2v-f1/r1扩增包含cd2v基因的一段序列，与pjet1.2克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，涂布于含100mg/l氨苄青霉素的lb培养基平板上，37℃培养12-16h，挑菌筛选测序鉴定后，扩大培养阳性菌液后提取质粒，将阳性的质粒分别命名为pjet1.2-cd2v。

1.4巢式二重pcr反应建立敏感性试验

将1.3中所得阳性质粒puc57-cd2v和puc57-360-505r稀释到0.01ng/μl作为检测模板。引物分别稀释为终浓度2μm，1.5μm，1μm，0.75μm，0.5μm，0.25μm等。应用pcr仪，采用矩阵法筛选不同引物浓度组合，得到针对巢式二重pcr引物浓度和反应条件。

按照以下步骤进行巢式二重pcr：

s1.按照核酸提取试剂盒说明书从样品中提取病毒核酸；

s2.以核酸为模板，用权利要求1所述的外侧引物对样品进行第一次二重pcr扩增反应获得扩增产物；采用20μl反应体系2×premixprimestarhs10μl，外侧引物组asfv-cd2v-f1/r1(20μm)、asfv-360-505r-f1/r1(10μm)各1μl，模板dna1μl，补加去离子水至20μl。其中2×primestarhs包含takaraprimestarhsdnapolymerase1.25u/25μl，dntpmixture各0.4mm，primestarbuffer2mmmg²⁺。pcr扩增反应的反应条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，54℃退火5s，72℃延伸2min，共25个循环；最后72℃延伸10min。

s3.以步骤s2的扩增反应的产物为模板，用权利要求1所述的内侧引物对样品进行第二次二重pcr扩增反应获得第二轮扩增产物；采用20μl反应体系2×premixprimestarhs10μl，内侧引物组asfv-cd2v-f2/r2(20μm)、asfv-360-505r-f2/r2(10μm)各1μl，模板dna1μl，补加去离子水至20μl。其中2×primestarhs包含takaraprimestarhsdnapolymerase1.25u/25μl，dntpmixture各0.4mm，primestarbuffer2mmmg²⁺。

扩增条件为：95℃预变性5min；98℃变性10s，54℃退火5s，72℃延伸1min30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。

s4.将步骤s3中的第二轮扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，在凝胶成像系统下观察结果，确定病毒类型。

pcr扩增产物进行电泳鉴定：称取1g琼脂糖放入500ml锥形瓶中，加入1×tae电泳缓冲液100ml，于微波炉中熔解，再加入10μl染色液混匀。在电泳槽模内放好梳子，倒入琼脂糖凝胶，待完全凝固后取出置于电泳槽中，将9μlpcr扩增产物与1μl10xloadingbuffer混合后点样于琼脂糖凝胶孔中，以120v电压于1×tae电泳缓冲液中电泳，凝胶成像系统观察结果。

按照上述方法对阳性质粒样品和确诊感染非洲猪瘟病毒的猪脾脏组织样品进行检测，1：cd2v基因缺失；2：360-505r基因缺失；3：无基因缺失的野毒株；4：缺失cd2v和360-505r株；5：缺失cd2v和360-505r株和野毒株混合；6：阳性质粒(cd2v)；7：阴性对照(去离子水)进行巢式二重pcr检测，实验结果见附图2。从结果中可以看出2对引物具有良好的特异性，各个pcr产物在凝胶电泳图上明显分开，泳道5混合感染样品分别扩增出3条大小分别为1637，553和239bp的特异性条带，与预期大小相符，均未出现任何非特异扩增条带，实验结果清晰明了。

1.5重复性试验

每份样品做3个重复，分别提取dna，在同一次扩增中进行测定。试验重复3次检测结果一致。

实施例3特异性试验

按照实施例2中1.4建立的巢式二重pcr检测方法对1：无基因缺失的野毒株；2：缺失cd2v和360-505r株；3：缺失cd2v和360-505r株和野毒株混合；4：阳性质粒(cd2v)；5：阴性对照(去离子水)；6：猪瘟病毒(csfv)；7：猪伪狂犬病毒(prv)；8：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(prrsv)；9：猪细小病毒(ppv)；10：猪乙型脑炎病毒(jev)；11：轮状病毒(rv)；12：猪流行性腹泻病毒(pedv)；13：猪德尔塔冠状病毒(pdcov)；14：猪圆环病毒ⅱ(pcv2)进行检测。结果如附图3所示。

从附图3中可以看出，对应1：无基因缺失的野毒株；2：缺失cd2v和360-505r株；3：缺失cd2v和360-505r株和野毒株混合；4：阳性质粒(cd2v)的泳道在对应的片段大小的位置都能看到清晰的条带，而5：阴性对照(去离子水)；6：猪瘟病毒(csfv)；7：猪伪狂犬病毒(prv)；8：猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(prrsv)；9：猪细小病毒(ppv)；10：猪乙型脑炎病毒(jev)；11：轮状病毒(rv)；12：猪流行性腹泻病毒(pedv)；13：猪德尔塔冠状病毒(pdcov)；14：猪圆环病毒ⅱ(pcv2)对应的泳道都没有显示出条带，说明该检测方法具有较好的特异性。

实施例4敏感性试验

将阳性模板(puc57-cd2v和puc57-360-505r)浓度分别稀释为1×10^-18ng/μl、1×10^-17ng/μl、1×10^-16ng/μl、1×10^-15ng/μl、1×10^-14ng/μl、1×10^-13ng/μl、1×10^-12ng/μl、1×10^-11ng/μl、1×10^-10ng/μl、1×10^-9ng/μl、1×10^-8ng/μl、1×10^-7ng/μl、1×10^-6ng/μl、1×10^-5ng/μl、1×10^-4ng/μl、1×10^-3ng/μl、1×10^-2ng/μl等。

按照实施例2中1.4建立的巢式二重pcr检测方法对上述不同模板浓度进行检测。结果如附图4所示。从附图4中可以看出，泳道1至11可以看到清晰的2条条带，说明该方法的敏感性达到1×10^-18ng/μl。

外侧引物二重pcr检测结果如附图5所示，泳道1至4可以看到清晰的2条条带，说明外侧引物二重pcr敏感性为1×10^-5ng/μl。

内侧引物二重pcr检测结果如附图6所示，泳道1至3可以看到清晰的2条条带，说明内侧引物二重pcr敏感性为1×10^-5ng/μl。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

sequencelisting

<110>华南农业大学

肇庆大华农生物药品有限公司

<120>一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒

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