不结球白菜微卫星DNA标记指纹图谱及其应用的制作方法

本发明属于分子标记
技术领域：
，具体涉及一种不结球白菜微卫星dna标记指纹图谱及其应用。
背景技术：
：白菜类作物是十字花科(cruciferae)芸薹属(brassica)植物，它包含大白菜、不结球白菜和芜菁等多个栽培种群，是我国及东南亚地区重要的油料作物和蔬菜作物。我国作为白菜类作物的主要起源地，拥有丰富的白菜类蔬菜种质资源。不结球白菜(brassicacampestrisssp.chinensismakino)是其中很重要的一类，其原产于我国，俗称小白菜或青菜，北方称其为油菜，是人们喜爱的大众化蔬菜。目前市场上不结球白菜品种繁多，不同品种间茎叶的颜色存在差异，纤维素含量、多糖含量、可溶性蛋白含量、维生素c含量等功能成分含量高低不一，口感、抗病性等也存在较大差异，仅通过外观形态往往很难鉴别。简单重复序列(simplesequencerepeats,ssr)也称微卫星，在其基因组中座位两侧的dna序列是相对保守的单拷贝序列，经扩增变异丰富的串联重复序列可获得其长度的多态性。除着丝粒及端粒区域以外，ssr位点广泛分布在真核生物的染色体上，具有多态性高、稳定性强、dna用量少、操作简便、表现为共显性孟德尔遗传等特点，已经广泛应用于基因定位、图谱构建、多态性分析、种质资源的保存与利用、数量性状基因位点(qtls)分析等诸多方面，是目前最有应用价值且应用最广泛的分子标记技术之一。此技术不受植株生长发育阶段和环境的影响，当出现假冒或有争议的情况时可有效地用此技术进行监督和仲裁，有利于品种的推广和保护。另外，对种植者来说选择一种优良品种，有助于获得较高的经济效益。南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青、黄心黄、矮脚黄均是目前市场上的8份具有广泛代表性的优良不结球白菜品系，为了快速判断不结球白菜的品系，需建立有效可靠的检测方法。技术实现要素：本发明的目的是提供一种不结球白菜品种南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青自交系、黄心黄、矮脚黄自交不亲和系的微卫星dna标记指纹图谱，并将其用于上述品种的鉴定或纯度分析，该指纹图谱与常规形态学和细胞学检测相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好的优点。为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：一组用于构建不结球白菜微卫星dna标记指纹图谱的专用引物组，所述引物为9对ssr引物等位片段的组合，ssr引物序列如seqidno.1-18所示。构建不结球白菜微卫星dna标记指纹图谱的方法，包括以下步骤：分别提取不结球白菜南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青自交系、黄心黄、矮脚黄自交不亲和系的基因组dna，采用上述引物组进行pcr扩增，对pcr扩增产物进行电泳检测，获得不结球白菜dna指纹图谱。利用上述引物组构建得到的不结球白菜dna指纹图谱。上述不结球白菜dna指纹图谱在不结球白菜品种/系的鉴定或纯度分析上的应用。与现有技术相比，本发明的有益效果为：1、本发明利用ssr分子标记来鉴定不结球白菜品种，通过构建基于每个不结球白菜品种的ssr分子标记指纹图谱，为种植者提供参考。能从遗传本质上对不结球白菜品系进行种质鉴定，准确、可靠。2、当不结球白菜指纹图谱建立以后，在对某个未知样品进行真实检测时，几个小时就可以知道该不结球白菜dna指纹，因此可以迅速判断出不结球白菜品种的真实性。3、采用该发明，构建该dna指纹图谱所用的样品可以根据需要不断增加，并对指纹进行实时更新。4、本发明采用表的形式来说明dna指纹图谱，并将其转换成了数码形式，便于计算机识别和分析。附图说明图1为引物对brassr01092的pcr产物特征条带电泳图。电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a的标号代表引物对brassr01092，特征条带1大小为327bp。图2为引物对brassr01139的pcr产物特征条带电泳图。电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道b的标号代表引物对brassr01139，由上到下特征条带2大小为255bp，特征条带1大小为243bp。图3为引物对brassr03057的pcr产物特征条带电泳图。电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道c的标号代表引物对brassr03057，由上到下特征条带2大小为206bp，特征条带1大小为182bp。图4为引物对brassr03058的pcr产物特征条带电泳图。电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道d的标号代表引物对brassr03058，由上到下特征条带2大小为247bp，特征条带1大小为224bp。图5为引物对brassr03121的pcr产物特征条带电泳图。电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道e的标号代表引物对brassr03121，由上到下特征条带2大小为268bp，特征条带1大小为248bp。图6为引物对brassr04005的pcr产物特征条带电泳图。电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道f的标号代表引物对brassr04005，特征条带1大小为250bp。图7为引物对brassr04046的pcr产物特征条带电泳图。电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道g的标号代表引物对brassr04046，由上到下特征条带3大小为183bp，特征条带2大小为175bp，特征条带1大小为166bp。图8为引物对brassr05032的pcr产物特征条带电泳图。电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道h的标号代表引物对brassr03057，由上到下特征条带2大小为302bp，特征条带1大小为256bp。图9为引物对brassr03118的pcr产物特征条带电泳图。电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道i的标号代表引物对brassr03118，由上到下特征条带3大小为339bp，特征条带2大小为318bp，特征条带1大小为304bp。图10为南农五月慢9种引物对的pcr产物的电泳图谱，电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a-i依次为为9种引物对brassr01092、brassr01139、brassr03057、brassr03058、brassr03121、brassr04005、brassr04046、brassr05032、brassr03118的扩增条带。图11为加拿大五月慢9种引物对的pcr产物的电泳图谱，电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a-i依次为为9种引物对brassr01092、brassr01139、brassr03057、brassr03058、brassr03121、brassr04005、brassr04046、brassr05032、brassr03118的扩增条带。图12为四月白9种引物对的pcr产物的电泳图谱，电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a-i依次为为9种引物对brassr01092、brassr01139、brassr03057、brassr03058、brassr03121、brassr04005、brassr04046、brassr05032、brassr03118的扩增条带。图13为矮颗黄心乌9种引物对的pcr产物的电泳图谱，电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a-i依次为为9种引物对brassr01092、brassr01139、brassr03057、brassr03058、brassr03121、brassr04005、brassr04046、brassr05032、brassr03118的扩增条带。图14为青又青9种引物对的pcr产物的电泳图谱，电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a-i依次为为9种引物对brassr01092、brassr01139、brassr03057、brassr03058、brassr03121、brassr04005、brassr04046、brassr05032、brassr03118的扩增条带。图15为苏州青自交系9种引物对的pcr产物的电泳图谱，电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a-i依次为为9种引物对brassr01092、brassr01139、brassr03057、brassr03058、brassr03121、brassr04005、brassr04046、brassr05032、brassr03118的扩增条带。图16为黄心黄9种引物对的pcr产物的电泳图谱，电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a-i依次为为9种引物对brassr01092、brassr01139、brassr03057、brassr03058、brassr03121、brassr04005、brassr04046、brassr05032、brassr03118的扩增条带。图17为矮脚黄自交不亲和系9种引物对的pcr产物的电泳图谱，电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a-i依次为为9种引物对brassr01092、brassr01139、brassr03057、brassr03058、brassr03121、brassr04005、brassr04046、brassr05032、brassr03118的扩增条带。图18为待测样9种引物对的pcr产物的电泳图谱，电泳图中m泳道代表500bpmarker，从上至下的5条条带大小分别为500bp，400bp，300bp，250bp，200bp；泳道a-i依次为为9种引物对brassr01092、brassr01139、brassr03057、brassr03058、brassr03121、brassr04005、brassr04046、brassr05032、brassr03118的扩增条带。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的。可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。南农五月慢植株直立，稍束腰，叶椭圆形，全缘，叶色深绿，叶柄浅绿色。抗寒力中等，耐热力中等，冬性强，抽薹迟。加拿大五月慢株型直立，束腰，叶色深绿，叶柄肥厚，呈青绿色，叶脉粗。生长势旺，耐寒性强，抽薹晚，品质佳。四月白植株直立，叶片卵圆形，叶色浅绿，叶面光滑，有褶皱。耐寒、耐热、冬性强。食用品质差。矮颗黄心乌外叶翠绿、内叶浅黄至金黄、叶面有较大核桃纹，叶柄短、白色或浅绿色品质佳、耐寒。成熟时，心叶紧抱或半抱。青又青植株直立，强束腰，叶片椭圆形，叶柄肥厚，青绿色，菜茎白，纤维细，味甜口感好。苏州青植株直立，稍束腰，叶片广卵圆或近圆形，叶片深绿，叶柄淡绿色。黄心黄植株外形美观紧凑，半包心，棵矮，黄心早。外叶亮绿色，叶片厚实而有光泽，叶皱多，心叶金黄色，梗白，纤维含量少口感极佳，耐寒性强。南农矮脚黄植株直立、束腰，叶片翠绿色，近圆形，较厚。质地脆嫩，纤维少，易煮熟，味甜，品质优。南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青、黄心黄、矮脚黄均是目前市场上的优良不结球白菜品系，为了快速判断未知样品是否是上述8个品系，本发明建立了相对应的指纹图谱。实施例1不结球白菜dna指纹图谱的构建本实施例采用收集到的8份具有广泛代表性的不结球白菜品系为供试材料，用露地栽培苗提取dna，进行ssr分析，建立与之相对应的指纹图谱。得到的指纹图谱再用于对这8种不结球白菜品种进行鉴定，并为其它不结球白菜的种质鉴定提供一条可供借鉴的有效方法。建立不结球白菜dna指纹图谱的具体操作如下：1、选用代表性不结球白菜品种本实施例采用下表所示8份不结球白菜品种：种类编号品种名来源不结球白菜1南农五月慢南京农业大学不结球白菜2加拿大五月慢加拿大不结球白菜3四月白南京农业大学不结球白菜4矮颗黄心乌南京农业大学不结球白菜5青又青南京农业大学不结球白菜6苏州青自交系南京农业大学不结球白菜7黄心黄南京农业大学不结球白菜8矮脚黄自交不亲和系南京农业大学2、不结球白菜品系的dna提取及纯化根据植物基因组dna快速提取试剂盒(购自于杭州宝赛生物科技有限公司)说明书提取dna。用nanouv-3000超微量紫外分光光度计测定其浓度，稀释至20ng·μl-1，于-20℃下保存备用。3、pcr扩增及电泳检测采用ssr-pcr总体积为10μl的扩增体系，具体包括：2×taqmastermix为5μl，浓度为10μm正反向ssr引物各为1μl，浓度为50ng/μl模板dna为1μl，用去离子无菌水补足10μl体系。pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸lmin，共28个循环，最后72℃延伸7min，4℃保存。电泳步骤如下：扩增产物加3.33μl上样缓冲液，采用8％变性聚丙烯酰胺凝胶，1×tbe缓冲液，50w恒功率电泳约1.5h，银染检测电泳结果。选择有代表性的多态性扩增条带构建供试材料的指纹图谱。4、构建dna指纹图谱构建指纹图谱时，本着用最少引物、最少条带，又要把所有供试样品区分开来的原则，本实施例从59对引物中筛选出brassr01092fandr；brassr01139fandr；brassr03057fandr；brassr03058fandr；brassr03121fandr；brassr04005fandr；brassr04046fandr；brassr05032fandr；brassr03118fandr这9对引物对。引物序列如下表所示：如图1-图9所示，从上述9对引物扩增出的条带中选取稳定性和重复性良好、多态性高的条带，可用于构建这8个不结球白菜品种的dna指纹图谱。由图1-图9总结得出条带赋值标准表：根据每种不结球白菜呈现的条带信息，构建出8个品种的dna指纹图谱，在该图谱中，每个品种都具有其特异的dna指纹。为了描述方便，按照赋值标准表设定数字“00”表示图谱中对应引物没有扩增条带存在，“01”“02”“03”表示图谱中对应引物在确定位置上存在一条扩增条带，数字“12”“13”“23”表示图谱中对应引物在确定位置上存在两条扩增条带。最终，每个品种都拥有了一串短数字，如下表所示：由此可知，8个品种的特征图谱数据为：010201021201121213，010201120201121223，010201021200010113，010112021201010123，011201010201031212，010101020201030213，010101010201020201，010102010101020101。图10-图17即8个标准品种的标准图谱。实施例2不结球白菜dna指纹图谱用于不结球白菜的种质鉴定判断待测样品是否为南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青自交系、黄心黄、矮脚黄自交不亲和系8个品种中的一种，可按照如下方法对待测样品的dna指纹进行鉴定：提取待测样品dna，用提取的dna为模板，用ssr01092、ssr01139、ssr03057、ssr03058、ssr03121、ssr04005、ssr04046、ssr05032、ssr03118这9对引物对其进行ssr-pcr扩增，扩增产物在8％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，银染，绘制出该待测样品的dna指纹图谱，与实施例1构建的标准dna指纹图谱进行比对，就可以知道待测样品是否是南农五月慢、加拿大五月慢、四月白、矮颗黄心乌、青又青、苏州青自交系、黄心黄、矮脚黄自交不亲和系8个品种中的一种。实验结果见图18，可知待测样品的dna指纹是010201021200010113，这与四月白的标准指纹是一致的，因此所检测的不结球白菜品种是四月白。序列表<110>南京农业大学<120>不结球白菜微卫星dna标记指纹图谱及其应用<130>20191121<160>18<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ttgtcgttacctttccctcc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ggagacattggagctttggt20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3tcacgcacattcaagagaca20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gcaacaggaggatctggttt20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tatagcagtctccgcctcct20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ctcgatgctccaagaaaaca20<210>7<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gaacctcctgctctagcgtt20<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8taccagcacgaaactcaagc20<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ggtcagtgttgaccgtatcg20<210>10<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10aaacgggagattcaatggag20<210>11<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cttgtagccttcggtcaatg20<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12agcatttgtcaacgcacact20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13tgtcacatggcgtatccttt20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14cgcaattctctctggcatta20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15cttcgttgttatgcagcgtt20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16agacattgcgaaagatccct20<210>17<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gactctcagcctccttttgc20<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18tgactgggttcatgcgtaat20当前第1页1 2 3