一种用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的SSR引物组、试剂盒及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的ssr引物组、试剂盒及其应用。

背景技术：

甘蔗是我国重要的糖能兼用作物，我国85％以上的糖来源于甘蔗，培育高产、高糖、抗逆性强的甘蔗品种，对甘蔗产业具有重要作用。甘蔗的育种也称为高贵化育种，通过野生资源与热带种杂交，再多代回交，以提高甘蔗品种的适应性、抗逆性，宿根性等特性。但由于当前可用的亲本材料少，品种面临遗传背景狭窄，品种的适应性、抗逆性、宿根性等性能下降的问题。斑茅具有抗逆性强、宿根性强、分蘖多、耐贫瘠等优异的特点，是改良甘蔗品种的优异材料。目前通过远缘杂交的方法已经成功的将斑茅野生种导入到甘蔗背景中，并得到了大量甘蔗与斑茅的杂交后代，部分优异品系已经应用于甘蔗的杂交育种。然而甘蔗与斑茅杂交后代的遗传规律复杂，染色体随着回交代数的增加而减少，研究显示甘蔗与斑茅杂交高代材料中几乎每代丢失1/2斑茅染色体，这样高水平的丢失直接影响斑茅血缘的检测。

目前，鉴定甘蔗与斑茅的杂交后代是否含有斑茅血缘的方法主要有基因组原位杂交技术(genomicinsituhybridization,gish)和分子标记技术。这两种方法中，利用gish技术对杂交后代进行鉴定需要的周期长、技术难度高，通常需要专业人员进行操作，且无法进行早期鉴定。利用分子标记技术进行鉴定，技术难度小，在小苗阶段即可完成鉴定，减少了实际生苗培养的土地、人工等的投入。目前已经有关于利用分子标记进行甘蔗中斑茅血缘鉴定的分子标记技术，如5srdna、its标记、aelp技术等，但是由于标记的数量较少，这些标记存在于个别染色体上，如果染色体丢失会造成标记失效，无法有效地检测丢失该染色体的杂交后代。

cn1566362a公开了甘蔗斑茅杂种的dna鉴定方法，包括甘蔗、斑茅基因组dna提取、试剂配制、扩增和电泳检测。所述鉴定方法能从dna分子水平上获得最直接的杂种证据，具有准确、直观、便捷的特点，鉴定速度快，环境影响因素小，鉴定的准确率高，成功地解决了长期以来甘蔗斑茅杂种鉴定的困难，确保了被鉴定杂种的真实性，提高了育种利用的有效性。然而，由于其仅选用两条引物进行标记，标记范围有限，并不能避免甘蔗与斑茅杂交后，斑茅后代染色体丢失后标记失效而无法检出斑茅血缘的问题。

因此，开发更多斑茅特异性的标记，特别是能均匀分布于一整套染色体上的标记，是高代材料中斑茅血缘鉴定过程的关键所在。

技术实现要素：

本申请的首要目的在于提供一种用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的ssr引物组。

本发明的另一目的在于提供一种用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的试剂盒。

本发明的再一目的在于提供上述用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的ssr引物组以及试剂盒的应用。

本发明的上述目的，通过以下技术方案予以实现：

一种用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的ssr引物组，包括10组引物对，具体序列如下：

(1)引物对ssr1

f1：5’-gcgtagaatctgtcggcact-3’(tm＝60.43℃)；

r1：5’-caacgcgtaatttccatgtg-3’(tm＝59.99℃)；

(2)引物对ssr2

f2：5’-gggatggcaatggcatataa-3’(tm＝60.51℃)；

r2：5’-tctgcgctctggtcaactta-3’(tm＝59.74℃)；

(3)引物对ssr3

f3：5’-ccaatcatccttgctcaggt-3’(tm＝60.07℃)；

r3：5’-gcgaggcagactggttattc-3’(tm＝59.84℃)；

(4)引物对ssr4

f4：5’-tcgagtagtactgcagctgatga-3’(tm＝60.23℃)；

r4：5’-catggtgtgtctcatgaacct-3’(tm＝58.42℃)；

(5)引物对ssr5

f5：5’-atctcctccacattggcttg-3’(tm＝60.07℃)；

r5：5’-ttttcaatgaagtggagccc-3’(tm＝60.05℃)；

(6)引物对ssr6

f6：5’-ccccagtgcttcgctactac-3’(tm＝59.90℃)；

r6：5’-ttttcctgattggaaaaccg-3’(tm＝59.91℃)；

(7)引物对ssr7

f7：5’-tttcctgaacacgcaggag-3’(tm＝59.97℃)；

r7：5’-ctgctcatagcaaggggtgt-3’(tm＝60.28℃)；

(8)引物对ssr8

f8：5’-accgacatgagagctggact-3’(tm＝59.87℃)；

r8：5’-gtttcatgcttttcgattgc-3’(tm＝58.36℃)；

(9)引物对ssr9

f9：5’-ggctcgtaggagcattcaac-3’(tm＝59.84℃)；

r9：5’-tgagaacagcatggagacct-3’(tm＝58.38℃)；

(10)引物对ssr10

f10：5’-agcctgcaggtctctctgac-3’(tm＝59.74℃)；

r10：5’-atgcaatgcaacacgacaat-3’(tm＝60.00℃)。

ssr标记具有多态性高，共显性和稳定性好的优点，在基因组中得到了广泛应用。本发明以本单位开展的斑茅基因组调研为基础，以高粱基因组为参考，自主开发一组均匀分布于一套染色体组上的具有斑茅特异性的ssr标记，对于提高甘蔗与斑茅远缘杂交后代中斑茅血缘的鉴定，特别是对高代材料中斑茅血缘的鉴定具有重要意义。

所述的用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的ssr引物组在鉴定甘蔗与斑茅杂交后代中含有斑茅血缘的材料或制备用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的试剂盒中的应用。

一种用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的试剂盒，包括上述用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的ssr引物组。

所述的用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的试剂盒，还包括用于pcr的试剂。

所述的用于pcr的试剂包括用于2×pcr扩增的预混液和用于pcr的水中的至少一种。

所述的用于pcr扩增的预混液包括浓度为0.05u/μlextaq聚合酶和pcr缓冲液。

所述的用于pcr的缓冲液为含有4mmmg²⁺和0.4mmdntp的缓冲液。

所述的用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的试剂盒在鉴定甘蔗与斑茅杂交后代中含有斑茅血缘的材料中的应用。

一种鉴定甘蔗与斑茅杂交后代中斑茅血缘的方法，包括如下步骤：

(1)提取待鉴别甘蔗与斑茅杂交后代样品基因组dna；

(2)以步骤(1)中提取的待鉴别样品基因组dna为模板，利用上述引物组或上述试剂盒进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

(3)将步骤(2)中pcr扩增产物进行凝胶电泳检测，处理后并统计凝胶电泳结果；

(4)分析步骤(3)中的凝胶电泳结果，鉴定甘蔗与斑茅杂交后代中是否含有斑茅血缘。

步骤(1)中所述的基因组dna可通过常规的技术提取得到，如核酸沉淀法、磁珠法、吸附柱法等；优选通过如下步骤制备得到：取待鉴定植株叶片经液氮研磨，加入预热的裂解缓冲液；经水浴加温混匀，然后加入氯仿/异戊醇，离心后取上清与预冷的dna沉淀液混匀后冰浴，继续离心取沉淀用乙醇洗涤后干燥，再用te溶解，保存备用；其中，所述裂解缓冲液由nacl溶液、tris-hcl缓冲液、na2-edta溶液、ctab溶液组成，所述的裂解缓冲液需要室温保存；所述的dna沉淀液为peg8000和nacl溶液；更优选通过如下步骤制备得到：取植株叶片，液氮碾磨，取约0.1g研磨后的样品加入到2ml离心管中，加入65℃预热的裂解缓冲液700μl，65℃水浴30min期间翻转混匀，加入等体积氯仿/异戊醇混合液(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)，混匀，15℃、11000rpm离心10min，取上清，加入等体积预冷的dna沉淀液，混匀，冰浴30min，离心，弃上清，沉淀中加入75％乙醇洗涤，离心，倒掉上清后干燥，加100μlte缓冲液溶解，于-20℃保存备用；其中，所述的裂解缓冲液由1.4mnacl溶液、0.1mtris-hcl缓冲液、20mmna2-edta溶液、2％ctab溶液组成；所述的dna沉淀液为20％(m/v)peg8000，其中含有2mnacl溶液。

步骤(2)中所述的pcr的体系优选为：每个引物对配制一个反应体系，每20μl反应体系中含dna模板0.5μl，2×pcr扩增的预混液10μl，10μmol·l^-1的每个引物对的上下游引物各0.5μl，余量为水。

步骤(2)中所述的pcr的条件优选为：94℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，33个循环；72℃总延伸10min。

步骤(3)中所述的电泳为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。

所述的电泳条件为250v恒压电泳5小时。

所述的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓度为7％(v/v)。

所述的电泳缓冲液为0.5×tbe。

所述的处理包括漂洗、银染、漂洗、显色、漂洗凝胶等步骤。

步骤(4)中所述的鉴定的方法为：若凝胶上出现斑茅特异性条带即可判断待鉴别样品含有斑茅血缘；反之，不含斑茅血缘。各引物对扩增产物斑茅特异性条带位置为：ssr1出现在240bp左右；ssr2主带出现在185bp左右，在185～195之间出现1～2副带；ssr3主条带出现265bp左右，在265～289之间出现1～2条副带；ssr4出现在250bp和275bp左右，两条条带同时出现或只出现其中一条；ssr5条带出现在185bp左右；ssr6条带出现在250bp左右；sss7条带出现在180bp左右；ssr8条带出现在178bp和165bp左右，两条带同时出现；ssr9条带出现在280bp左右；ssr10条带出现在245bp左右。

与现有技术相比，本发明具有以下的优点及有益效果：

(1)本申请所述的ssr1～ssr10引物对是一套自主开发的具备斑茅特异性的ssr标记，这套ssr标记的特点是平均分布于斑茅的一套染色体组(10条)上，以这套标记的一对或几对引物扩增，只要出现了斑茅特异性条带即可判断为存在斑茅血缘。本发明提供的ssr引物是经过优化筛选得到的，特异性强。利用这套染色体可以避免斑茅后代染色体丢失后由于标记失效而无法检出斑茅血缘的问题，因此这组标记特别适合甘蔗与斑茅杂交高代材料的鉴定。

(2)植物材料不限部位和发育时期，可以在甘蔗幼苗期以叶片为材料进行鉴定，早期淘汰不含斑茅血缘的材料，减少种植的成本。

(3)试验操作步骤简便易行，重复性高，在短时间内可完成大批试验材料的鉴定，可广泛用于今后的通过甘蔗与斑茅杂交的种质创新和含斑茅血缘甘蔗品系的筛选。

附图说明

图1为ssr1对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；其中，泳道m为dl500的dnamaker、泳道1为江西83-4、泳道2为四川79-ⅰ-9、泳道3为海南92-77、泳道4为贵州78-ⅱ-14、泳道5为云南82-85、泳道6为badila、泳道7为新台糖22号、泳道8为粤糖94-128、泳道9为hocp07-613、泳道10为yce07-71、泳道11为yce01-92、泳道12为yce01-105、泳道13为yce06-140、泳道14为bc2-32；箭头表示目标条带。

图2为ssr2对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；各泳道对应的样品与图1相同。

图3为ssr3对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；各泳道对应的样品与图1相同。

图4为ssr4对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；各泳道对应的样品与图1相同。

图5为ssr5对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；各泳道对应的样品与图1相同。

图6为ssr6对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；各泳道对应的样品与图1相同。

图7为ssr7对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；各泳道对应的样品与图1相同。

图8为ssr8对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；各泳道对应的样品与图1相同。

图9为ssr9对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；各泳道对应的样品与图1相同。

图10为ssr10对不同斑茅原种、甘蔗亲本材料和甘蔗与斑茅杂交后代材料的扩增结果图；各泳道对应的样品与图1相同。

图11为本发明引物ssr2、ssr4和ssr10与its标记在鉴定高代回交世代中斑茅血缘的扩增结果图；其中：泳道m为dl500的maker，泳道1为yce07-71，泳道2为新台糖22号，泳道3为y22-1、泳道4为y22-2、泳道5为y22-3、泳道6为y22-4、泳道7为y22-5、泳道8为y22-6、泳道9为y22-7、泳道10为y22-8、泳道11为y22-9、泳道12为y22-10。

图12为ssr2与位于同一染色体的非特异性标记e02-77186扩增结果比较图；其中a为ssr2扩增效果图；b为非特异性标记扩增效果图；各泳道对应的样品与图1相同。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：斑茅、甘蔗及其甘蔗与斑茅杂交不同回交材料的斑茅血缘鉴定

本实施例用ssr1～ssr10组成一套ssr标记，完整地展示了在利用这套ssr标记进行甘蔗与斑茅杂交不同回交世代的材料中斑茅血缘鉴定的效果，同时分别展示了不同对引物扩增时，斑茅特异性条带的情况，为应用这些引物对斑茅血缘进行鉴定提供参考。

具体操作步骤如下：

本实施例选取了5个不同地区的斑茅原种(江西83-4、四川79-ⅰ-9、海南92-77、贵州78-ⅱ-14和云南82-85)、4个甘蔗亲本材料(badila、新台糖22号、粤糖94-128和hocp07-613)、5个斑茅杂交后代材料(yce07-71、yce01-92、yce01-105、yce06-140、bc2-32)，以上材料均可从广东省甘蔗种质资源库获取。

(1)提取待鉴别甘蔗与斑茅杂交后代样品基因组dna

首先提取上述14份材料的基因组dna，作为模板备用；基因组dna的提取采用ctab提取法，具体步骤如下：

1)取上述14份材料幼嫩的叶片，用液氮研磨，加100mg左右的组织样品加入2ml离心管中。

2)加入700μl65℃预热的裂解缓冲液，65℃水浴30min，期间翻转均匀2～3次。

3)加入700μl氯仿/异戊醇(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)混合液，剧烈震荡10min，11000rpm15℃离心10min，将上清转入1.5ml的离心管中。

4)加入等体积的预冷的dna沉淀液，混匀，冰浴静置30min，11000rpm离心10min，弃上清。

5)向上述沉淀中加入1ml75％的乙醇洗涤2次，倒掉上清液，真空干燥10min。

6)加30μlte缓冲液用于溶解dna，-20℃条件下保存备用。

上述裂解缓冲液由1.4mnacl、0.1mtris-hcl、20mmna-edt、2％ctab混合而成，置于室温保存即可；上述dna沉淀液为浓度20％(m/v)peg8000，其中，含有2mnacl。

(2)以上述提取的待鉴别样品基因组dna为模板，分别用ssr1～ssr10引物对及pcr试剂进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。

其中，pcr反应体系为：dna模板0.5μl，2×pcr扩增的预混液10μl，10μmol·l^-1的上述引物各0.5μl，加入无菌超纯水至终体积为20μl。

pcr扩增程序为：94℃变性5min，94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环，72℃总延伸10min，4℃保存。

(3)将步骤(2)中的pcr反应产物进行凝胶电泳检测，并统计凝胶电泳结果

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行凝胶电泳检测，凝胶浓度7％(v/v)，电泳缓冲液为0.5×tbe，250v恒压电泳4-5小时，电泳结束后，漂洗、银染，漂洗，显色，漂洗凝胶后记录读取数据。

pcr产物用7％(v/v)的非变性page电泳检测，具体步骤如下：

1)清冼玻璃板，干燥后组装，将玻璃板底端开口处用1％(m/v)琼脂胶封住。

2)按比例配好电泳凝胶(表1)，轻轻摇匀后立即注胶(注意不要产生气泡)，插上梳子，平放静置1h使胶凝固。

3)将胶已经凝固的玻璃板固定在电泳槽上，加入适量的0.5×tbe缓冲液，液面盖过梳孔，拔出梳子。

4)在每个pcr产物加入2.5μl上样指示剂，振动混匀后用微量进样器分别取本实施例所述待鉴定样品3μl加至点样孔中。

5)每个电泳槽250v恒压，一般二甲苯青下移至凝胶的3/4时即可停止电泳，需要约5小时。

6)电泳结束后，撬开玻璃板，用刀片把四周的琼脂胶去掉，小心取出胶体，放入盛有蒸馏水的盘中轻轻振荡，冲洗两次。

7)用20ml0.1％的硝酸银溶于400ml中，然后倒入盘中进行染色10min，期间在振荡器上轻轻振荡，然后倒掉盘中硝酸银，再用蒸馏水轻轻冲洗两次。

8)然后用配好显色液母液20ml溶于400ml二级水中，加入甲醛1.0ml，显色10min左右，拍照，保存为jpeg格式。

表17％(v/v)非变性胶各组分用量

上述步骤中各试剂配方的制备方法：

1、10×tbe电泳缓冲液：108gtris，55g硼酸，7.4448gedta-na2(ph8.0)用去离子水溶解，定容到1l。

2、10％(m/v)过硫酸铵溶液：称取过硫酸铵30g，加入去离子水至300ml，4℃下可贮存数周。

3、上样指示剂：称取500mg溴酚蓝，加重蒸水20ml，在室温下过夜，再称取500mg二甲苯青于20ml去离子水溶解，加入80g蔗糖，加去离子水溶解，混合上述三个溶液，加去离子水定容至200ml，于4℃保存备用。

4、12％page配制(1000ml)：丙烯酰胺114g，甲叉丙烯酰胺6g，urea尿素240g，10×tbe200ml，补去离子水至1000ml(4℃保存备用)。

5、20×0.1％agno3染色液：称取10gagno3，加去离子水溶解定容至500ml。

6、20×显色液：称取naoh50g，四硼酸钠1.9g，加去离子水溶解定容至500ml。

(4)对扩增条带分析，分析斑茅特异性条带的情况

分析电泳结果：若出现斑茅特异性条带即可判断待鉴别样品含有斑茅血缘；反之，不含斑茅血缘。

鉴定结果如图1～10所示，结果发现：利用ssr1～ssr10对上述不同地区的斑茅原种、甘蔗及甘蔗与斑茅杂交后代进行扩增显示，利用10对引物扩增均出现斑茅特异性的条带，其中ssr2、ssr3、ssr4、ssr5、ssr8、ssr9和ssr10标记在不同斑茅材料间存在多态性；从不同世代的甘蔗与斑茅杂交后代的扩增结果可知，其中，yce01-92(11泳道)均有标记且均检出特异性的条带；yce01-105(12泳道)除了ssr9未检出，其他都检出斑茅特异性的条带；bc2-32(14泳道)除了ssr6未检出，其他标记都检出特异性条带；高代yce07-71(10泳道)利用ssr2、ssr4和ssr10引物检出特异性条带，yce06-140(13泳道)利用ssr3、ssr4和ssr5引物检出特异性条带。由此可见，通过本申请所述的一套ssr标记可以最大限度检出甘蔗与斑茅杂交后代中斑茅血缘的情况，避免了由于染色体丢失而造成的单一标记无法检出斑茅血缘的情况。

对比例1本发明ssr标记与its标记检测甘蔗与斑茅杂交后代中斑茅血缘的对比

为了进一步验证本发明的标记在鉴定高代材料斑茅血缘中的优势，本实施例对比了斑茅血缘鉴定的常规标记its与本发明标记在鉴定高代回交世代中斑茅血缘的差异。

本实施例以ssr2、ssr4和ssr10为代表，材料为yce07-71(含斑茅血缘，是甘蔗与斑茅杂交然后回交四代得到的材料，属于高代的材料)、新台糖22号(不含斑茅血缘)，10个yce07-71和新台糖22号杂交后代：y22-1、y22-2、y22-3、y22-4、y22-5、y22-6、y22-7、y22-8、y22-9、y22-10，这10个材料是从以yce07-71为母本，新台糖22号为父本的杂交组合中随机挑选的株高、茎径、茎的颜色、芽型等存在显著差异的材料；将本申请所述ssr标记与its标记方法进行对比。

(1)提取待鉴别甘蔗与斑茅杂交后代样品基因组dna

首先提取上述14份材料的基因组dna，作为模板备用；基因组dna的提取采用ctab提取法，具体步骤如下：

1)取上述14份材料幼嫩的叶片，用液氮研磨，加100mg左右的组织样品加入2ml离心管中。

2)加入700μl65℃预热的裂解缓冲液，65℃水浴30min，期间翻转均匀3次。

3)加入700μl氯仿/异戊醇(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)混合液，剧烈震荡10min，11000rpm15℃离心10min，将上清转入1.5ml的离心管中。

4)加入等体积的预冷的dna沉淀液，混匀，冰浴静置30min，11000rpm离心10min，弃上清。

5)向上述沉淀中加入1ml75％的乙醇洗涤2次，倒掉上清液，真空干燥10min。

6)加30μlte缓冲液用于溶解dna，-20℃条件下保存备用。

上述裂解缓冲液由1.4mnacl、0.1mtris-hcl、20mmna-edt、2％ctab混合而成，置于室温保存即可；上述dna沉淀液为浓度20％(m/v)peg8000，含2mnacl。

(2)以上述提取的待鉴别样品基因组dna为模板，分别用引物ssr4和its进行pcr扩增，得到pcr扩增产物

其中，pcr反应体系为：dna模板0.5μl，2×pcr扩增的预混液10μl，10μmol·l^-1的上述引物各0.5μl，加入无菌超纯水至终体积为20μl。

分别用标记ssr2、ssr4和ssr10进行pcr扩增，程序为：94℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，33个循环；72℃总延伸10min，4℃保存。

its标记的pcr扩增程序为：95℃变性5min，93℃变性50s，52℃退火20s，72℃延伸30s，30个循环，72℃总延伸5min，4℃保存。

its7:5’-ggaagaaagaaaacaagggt-3’；

its8:5’-gggacggmcmaaacaaaatt-3’。

(3)将步骤(2)中的pcr反应产物进行凝胶电泳检测，并统计凝胶电泳结果

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行凝胶电泳检测，凝胶浓度7％(v/v)，电泳缓冲液为0.5×tbe，250v恒压电泳4～5小时，电泳结束后，漂洗、银染，漂洗，显色，漂洗凝胶后记录读取数据。

(4)鉴定结果

利用its引物进行鉴定(如图11)，可见亲本yce07-71在300～400bp直接有清晰的两条条带(1号泳道)，新台糖22号没有条带(2号泳道)，但是在杂交后代中(3～12号泳道)中，仅五个材料第4、5、7、8、9泳道可见明显的扩增条带，而在3、6、10、11、12泳道没有条带，这种情况说明，斑茅高代回交中很大部分已经丢失了含有这个标记的染色体，导致its标记无法鉴定是否含有斑茅血缘。但是，利用本发明中所述ssr引物组进行斑茅血缘鉴定，对yce07-71中出现特异性条带的三个标记进行鉴定；其中：ssr2标记可以清晰显示3、5和9泳道有斑茅特异的条带；ssr4标记，在所用的甘蔗与斑茅杂交后代中均可见斑茅特异的条带，仅扩增产物的量上存在差异；ssr10标记，在4、5、6、8、10、11泳道有斑茅特异条带出现。三对引物扩增只要其中一对引物出现特异性条带即可表明含有斑茅血缘，因此利用这三对引物鉴定出10个的后代都含有斑茅血缘。本发明利用多对引物进行联合鉴定，最大程度避免了由于染色体丢失而无法鉴定出斑茅血缘的情况，由此可见本发明的ssr标记在鉴定斑茅血缘中显著优于its标记。

对比例2本发明特异性ssr标记与非特异性ssr标记的扩增情况比较

为了证明本发明所述ssr标记在斑茅血缘鉴定中，鉴定斑茅血缘的特异性标记效果优异于其他非特异性标记的效果，本实施例选取了ssr2标记与位于同一染色体上的其他标记进行比较。

具体操作步骤如下：

本实施例选取的材料与实施例1所述材料相同，即5个不同斑茅原种(江西83-4、四川79-ⅰ-9、海南92-77、贵州78-ⅱ-14和云南82-85)、4个甘蔗亲本材料(badila、新台糖22号、粤糖94-128和hocp07-613)、5个斑茅杂交后代材料(yce07-71、yce01-92、yce01-105、yce06-140和bc2-32)

(1)提取待鉴别甘蔗与斑茅杂交后代样品基因组dna

首先提取上述14份材料的基因组dna，作为模板备用；基因组dna的提取采用ctab提取法，具体步骤如下：

1)取上述14份材料幼嫩的叶片，用液氮研磨，加100mg左右的组织样品加入2ml离心管中。

2)加入700μl65℃预热的裂解缓冲液，65℃水浴30min，期间翻转均匀2～3次。

3)加入700μl氯仿/异戊醇(氯仿与异戊醇的体积比为24:1)混合液，剧烈震荡10min，11000rpm15℃离心10min，将上清转入1.5ml的离心管中。

4)加入等体积的预冷的dna沉淀液，混匀，冰浴静置30min，11000rpm离心10min，弃上清。

5)向上述沉淀中加入1ml75％的乙醇洗涤2次，倒掉上清液，真空干燥10min。

6)加30μlte缓冲液用于溶解dna，-20℃条件下保存备用。

上述裂解缓冲液由1.4mnacl、0.1mtris-hcl、20mmna-edt、2％ctab混合而成，置于室温保存即可；上述dna沉淀液为浓度20％(m/v)peg8000，含2m的nacl。

(2)以步骤(1)提取的dna做模板，分别用特异性引物ssr2和非特异性标记e02-77186进行pcr扩增，得到pcr反应产物

非特异性标记e02-77186的引物对为：

正向引物序列：5’-gcgctaatcaaatgctcctc-3’(tm＝59.95℃)

反向引物序列：5’-cgtaccgaaactaaacccca-3’(tm＝59.86℃)

pcr反应体系为：dna模板0.5μl，2×pcr扩增的预混液10μl，10μmol·l^-1上述引物各0.5μl，加入无菌超纯水至终体积20μl。

pcr扩增程序为：94℃变性5min；94℃变性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，33个循环；72℃总延伸10min，4℃保存。

(3)将步骤(2)中的pcr反应产物进行凝胶电泳检测，并统计凝胶电泳结果

采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行凝胶电泳检测，凝胶浓度7％(v/v)，电泳缓冲液为0.5×tbe，250v恒压电泳4～5小时，电泳结束后，漂洗、银染，漂洗，显色，漂洗，凝胶后记录读取数据。

(4)鉴定结果

利用ssr2进行鉴定斑茅特异性条带与其他条带区分明显(图12a)，不存在干扰条带，而利用非特异性标记e02-77186进行鉴定，甘蔗(图12b中的4～9泳道)与斑茅(图12b中的1～5泳道)有相似的扩增条带出现，在甘蔗与斑茅杂交后代中(图12中的10～14泳道)很难判断哪些条带来自与斑茅，无法用于鉴定斑茅血缘。由此可见，本申请所述ssr标记有利于在短时间内可完成大批试验材料的鉴定，可广泛用于通过甘蔗与斑茅杂交的种质创新和含斑茅血缘甘蔗品系的筛选。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所）

<120>一种用于鉴定甘蔗中斑茅血缘的ssr引物组、试剂盒及其应用

<160>24

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr1-f

<400>1

gcgtagaatctgtcggcact20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr1-r

<400>2

caacgcgtaatttccatgtg20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr2-f

<400>3

gggatggcaatggcatataa20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr2-r

<400>4

tctgcgctctggtcaactta20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr3-f

<400>5

ccaatcatccttgctcaggt20

<210>6

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr3-r

<400>6

gcgaggcagactggttattc20

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr4-f

<400>7

tcgagtagtactgcagctgatga23

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr4-r

<400>8

catggtgtgtctcatgaacct21

<210>9

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr5-f

<400>9

atctcctccacattggcttg20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr5-r

<400>10

ttttcaatgaagtggagccc20

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr6-f

<400>11

ccccagtgcttcgctactac20

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr6-r

<400>12

ttttcctgattggaaaaccg20

<210>13

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr7-f

<400>13

tttcctgaacacgcaggag19

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr7-r

<400>14

ctgctcatagcaaggggtgt20

<210>15

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr8-f

<400>15

accgacatgagagctggact20

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr8-r

<400>16

gtttcatgcttttcgattgc20

<210>17

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr9-f

<400>17

ggctcgtaggagcattcaac20

<210>18

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr9-r

<400>18

tgagaacagcatggagacct20

<210>19

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr10-f

<400>19

agcctgcaggtctctctgac20

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>ssr10-r

<400>20

atgcaatgcaacacgacaat20

<210>21

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>its7

<400>21

ggaagaaagaaaacaagggt20

<210>22

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>its8

<400>22

gggacggmcmaaacaaaatt20

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>e02-77186正向引物序列

<400>23

gcgctaatcaaatgctcctc20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<220>

<223>e02-77186反向引物序列

<400>24

cgtaccgaaactaaacccca20