专利名称：斑蝥在制药中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及斑蝥、斑蝥合剂的用途，尤其涉及它们在制药领域中的应用。
背景技术：
斑蝥早在十三世纪的《仁斋直指方》中就有记载，可用治于乳癌及腹部癌。古人还常用“斑蝥煮鸡蛋，弃斑蝥食蛋”的偏方治疗肝癌及其它消化系统癌症，至今仍在民间沿用。中医学认为斑蝥性寒味辛，有毒。据《神农本草经》记载，斑蝥可以治疗痈疽、溃疡、癣疮等病症，具有攻毒蚀疽、破血散结的作用。临床发现其还有多种新用途，治疗一些疑难杂症具有独特的疗效，如治疗风湿痛、神经痛、梅核气、斑秃、乳腺增生、鼻炎、传染疣、肝炎、癌肿等。
原发性肝癌(PHC，以下简称肝癌)为常见的消化道恶性肿瘤，东亚地区是世界肝癌高发区，其发病率在恶性肿瘤中居第三位，男性肝癌发病率约是女性的3倍，新病例中73％是男性。肝癌病死率高(死亡率/发病率＝0.95)，2000年死亡病例39.6万，在恶性肿瘤死因中排列第二。如何有效地防治本病是医药界面临的一个重要课题，免疫学和分子生物学的不断发展为肿瘤学的基础研究开辟了广阔的前景。中医认为感受邪毒是肝癌的主要病因之一，祛除邪毒是治疗肝癌的重要方法。现代研究又证实，免疫系统能影响肿瘤生长，而荷瘤的宿主往往有免疫功能低下的改变。因此，增强和调整肿瘤患者免疫功能，将有利于对肿瘤的控制。目前，中医药在抑制肿瘤生长、转移、提高患者生存质量和延长患者生命等方面都取得了可喜的进展。中晚期肝癌患者免疫功能常严重受损，尤以细胞免疫功能下降为主，提高细胞免疫功能对于肝癌患者病情的缓解有积极作用。
系统性红斑狼疮是一种较常见的累及多系统多器官的自身免疫性疾病，由于细胞和体液免疫功能障碍，产生多种自身抗体。发病机理主要是由于免疫复合物形成。病情呈反复发作与缓解交替过程。
白癜风是一种常见的色素脱失性皮肤黏膜疾病，主要由神经精神异常或者免疫功能失调等因素导致皮肤黑素细胞缺失或黑素生成障碍而引起，在我国发病率约为0.1-2％。除局部皮肤色素脱失形成的白斑外，患者通常无其它任何自觉症状，但由于多见于年轻人，且影响容貌美观，往往给患者造成一种无形的心理压力，乃至影响正常的生活和工作。
目前对H22肝癌、系统性红斑狼疮、白癜风还没有效果好的药物。
发明内容
本发明的目的在于以下几方面斑蝥在制备治疗或预防免疫失调引起的疾病的药中的应用。
斑蝥在制备治疗或预防H22肝癌的药中的应用。
斑蝥在制备治疗或预防系统性红斑狼疮的药中的应用。
斑蝥在制备治疗或预防白癜风的药中的应用。
斑蝥合剂在制备治疗或预防免疫失调引起的疾病的药中的应用。
斑蝥合剂在制备治疗或预防H22肝癌的药中的应用。
斑蝥合剂在制备治疗或预防系统性红斑狼疮的药中的应用。
斑蝥合剂在制备治疗或预防白癜风的药中的应用。
其中所述斑蝥合剂选自斑蝥素、羟基斑蝥胺、斑蝥酸钠、去甲斑蝥素一种或几种。
本发明的目的是通过以下技术方法来实现的本发明以肝癌(H22)小鼠为模型，进行斑蝥、斑蝥合剂对荷瘤小鼠的小鼠体重、瘤重及抑瘤率、T淋巴细胞增殖功能、NK杀伤功能、T淋巴细胞表型、细胞因子实验。结果显示了斑蝥、斑蝥合剂具有抑制肿瘤组织生长的作用，并且对荷瘤小鼠的免疫功能有一定调节作用。
本发明所公开斑蝥在制药中的应用，其优点表现在(1)本发明对斑蝥、斑蝥合剂发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。
(2)本发明的斑蝥、斑蝥合剂安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
(3)斑蝥、斑蝥合剂具有抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的双重效应，为临床治疗肿瘤提供了依据。我们认为斑蝥合剂抗肿瘤的作用机理是通过提高荷瘤小鼠脾淋巴细胞中CD4+、CD8+T淋巴细胞功能以及改变CD4+/CD8+比值，增强NK细胞杀伤功能，诱导IFN-γ和IL-4分泌，改善荷瘤小鼠的细胞及体液免疫而实现的。
图1显示斑蝥对荷瘤小鼠体重及瘤重的影响图2显示斑蝥对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响注1.正常组T淋巴细胞转化刺激指数为42.01；注2.与生理盐水组比较，*P＜0.01。
图3显示斑蝥对荷瘤小鼠NK细胞杀伤功能的影响注与生理盐水组比较，*P＜0.01。
图4显示斑蝥对荷瘤小鼠T细胞亚群变化的影响。
图5显示斑蝥对荷瘤小鼠分泌IFN-γ能力的影响注与生理盐水组比较，*P＜0.01。
图6显示斑蝥对荷瘤小鼠分泌IL-4能力的影响注与生理盐水组比较，*P＜0.01。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
实施例1斑蝥在制备治疗或预防H22肝癌的药中的应用1材料和方法1.1实验材料1.1.1斑蝥的制备取中药斑蝥饮片置煎煮容器内，加相当于药材量5-7倍的冷水浸泡1-2h，煮沸30min，过滤。药渣加3-5倍量水继续煎煮，煮沸20min，过滤。合并两次滤液，于水浴上浓缩成相当于原生药材0.01g/ml的药液，冷却装入灭菌药瓶，置4℃冰箱备用。
1.1.2动物C57BL/6小鼠，雄性，10周龄，购自上海中科院动物中心。
1.1.3瘤株肝癌H22瘤株，由上海市免疫学研究所提供。
1.1.4试剂ConA(Sigma公司)，CD3、CD4、CD8单抗(eBioScience公司)，NK细胞杀伤试剂(上海市免疫研究所自配)，3H-TdR(上海原子能研究所)，IFN-γ和IL-4检测试剂盒(晶美公司)。
1.2实验方法1.2.1造模方法无菌条件下取生长7-9d传代接种的H22细胞株，将细胞5×106接种于每只小鼠右侧腋窝皮下。
1.2.3动物分组及给药方法小鼠30只，10只作为正常组，其余均按上法造模。小鼠接种肿瘤5天后，随机分成生理盐水组和实验组，每组10只，生理盐水组予以生理盐水处理，实验组给予斑蝥水煎液0.01g/ml，均灌胃0.2ml/只，连续给药15天。
1.2.4标本采集停药次日，断颈处死小鼠，剥离肿瘤组织并无菌取脾。
1.3检测指标1.3.1小鼠体重、瘤重及抑瘤率胃饲15天后，称取两组小鼠体重；处死小鼠后完整剥离肿瘤，用电子天平称取瘤重，计算抑瘤率。
1.3.2T淋巴细胞增殖功能采用3H-TdR掺入法。在96孔平底培养板中，每孔加入小鼠脾细胞悬液100μl，浓度为5×106/ml，三复孔培养。同时，分别加入ConA 10μl。于37℃、5％CO2条件下培养72h。终止培养前16h，每孔加入3H-TdR 1μCi。用细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，β-液闪仪测定cpm值，并计算刺激指数。
1.3.3NK杀伤功能用1640培养液分别调整小鼠脾细胞(效应细胞)和体外培养的K562细胞(靶细胞)浓度为5×106/ml和1×105/ml。按效∶靶＝50∶1比例，各取100μl加入96孔平底培养板，37℃、5％CO2条件下共同培养4h。并设自然释放和最大释放组作为实验阴阳性对照。然后1000rpm，离心5min。吸取上清100μl，加入底物液100μl，静置3min显色。再加入1N HCL终止反应，490nm波长读取OD值。计算NK细胞的杀伤百分率。
1.3.4T淋巴细胞表型采用直接免疫荧光及流式细胞仪分析。取小鼠脾细胞1×106，加入适量PE-Cy5-CD3、FITC-CD4和PE-CD8混合单抗，室温避光孵育20min。1000rpm，离心5min，洗涤2次后，加入300μl固定液，上机检测。
1.3.5细胞因子采用ELISA法。收集小鼠脾细胞经ConA刺激24h后的培养上清，按照细胞因子检测试剂盒操作说明分别测定IFN-γ和IL-4的含量。1.4统计学处理采用Statpal团体T检验统计分析各组别数据的差异显著性。
2结果2.1斑蝥对荷瘤小鼠体重、瘤重及抑瘤率的影响结果如图1所示。与正常组比较，两组发生肿瘤的小鼠体重均减轻，而实验组小鼠体重下降明显(P＝0.001)，但实验组小鼠肿瘤重量显著小于生理盐水组小鼠瘤重(P＝0.0015)，抑瘤率达65.76％。表明斑蝥能有效抑制小鼠肝癌细胞的生长。
2.2斑蝥对荷瘤小鼠T淋巴细胞增殖的影响两组T淋巴细胞转化功能均较正常小鼠有显著降低。实验组小鼠T淋巴细胞转化刺激指数增加显著(SI＝4.34＞3，P＝0.00129)，具有较强的增殖能力，结果见图2。说明斑蝥能显著上调小鼠的T淋巴细胞增殖功能。
2.3斑蝥对荷瘤小鼠NK细胞杀伤功能的影响与正常组比较，单纯胃饲生理盐水组NK细胞杀伤活性无显著性差异，说明罹患肝癌后，并不能有效地刺激小鼠NK细胞产生针对肿瘤的免疫应答。实验组小鼠NK细胞杀伤活性显著增高，为生理盐水组的5倍(P＜0.005)，结果见图3。说明斑蝥能增强患瘤小鼠NK细胞的杀伤功能。
2.4斑蝥对荷瘤小鼠T细胞亚群变化的影响如图4所示，与正常组比较，两肿瘤小鼠组T细胞数量均有明显下降(P＜0.05)，说明其免疫功能低下。同时，两组小鼠外周T细胞亚群比例发生明显变化CD4+/CD8+比例倒置，这可能是因为发生肿瘤后，小鼠体内肿瘤特异性CD8+T细胞克隆增殖的结果。而生理盐水组与实验组相比，后者更能改变T淋巴细胞亚群比例。
2.5斑蝥对荷瘤小鼠分泌细胞因子能力的影响IFN-γ测定显示见图5，实验组小鼠T细胞分泌IFN-γ能力有显著升高(P＜0.05)，说明斑蝥能显著上调CD4+Th1细胞的分泌能力，并进而上调小鼠细胞免疫功能，促进CD8+细胞毒性T细胞的抗肿瘤作用。IL-4检测结果显示见图6，实验组小鼠T细胞分泌IL-4的能力有显著升高(P＜0.001)，说明斑蝥能显著上调CD4+Th2细胞的分泌能力，并进而上调小鼠体液免疫功能。综合以上两种情况，实验组既能上调小鼠细胞免疫功能，又能有效刺激小鼠的体液免疫功能，因此能有效抑制小鼠肿瘤的生长。
3讨论中医在古代没有“肝癌”的病名，但类似于肝癌的记载却十分丰富，如“黄疸”、“臌胀”、“积聚”、“徵瘕”等。中医认为，这类疾病的发病机理主要是感受邪毒，机体正不抗邪，致阴阳失调，脏腑功能障碍，经络阻塞，气血运行失常，气滞血瘀，湿聚痰凝，郁久化火，终致气、血、湿、热、痰、瘀、毒互结而成肝癌。现代医学认为，机体的免疫功能与肿瘤的发生发展有密切关系。当宿主免疫功能低下或受抑制时，肿瘤发生率增高，而在肿瘤进行性生长时肿瘤患者的免疫功能受抑制，二者互为因果。如何增强机体免疫功能，更好地发挥机体的抗肿瘤免疫机制，历来是肿瘤免疫学研究的重要课题。我们针对肝癌“痰”、“瘀”、“毒”的病机特点，结合肿瘤免疫学初步探讨了斑蝥对荷瘤小鼠免疫系统的影响。
本实验表明斑蝥可以明显的抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长，抑瘤率达65.76％，P＝0.0015，并使小鼠体重降低，发生脱毛现象，说明其能有效的杀死肿瘤细胞，具有一定的毒副作用。
机体的抗肿瘤免疫主要依靠T淋巴细胞介导的细胞免疫。成熟的T淋巴细胞分为CD4+和CD8+T淋巴细胞两个亚群。一般认为CD4+T淋巴细胞产生大量的细胞因子，CD8+T淋巴细胞在CD4+淋巴细胞的辅助及细胞因子的作用下可以杀伤肿瘤细胞，初次的抗肿瘤免疫反应主要依赖CD8+T淋巴细胞和自然杀伤细胞的参与。肿瘤特异性的CD8+T淋巴细胞对肿瘤细胞也具有直接的杀伤作用。缺乏CD4+和CD8+T淋巴细胞，以及CD4+/CD8+比值的降低是导致抗肿瘤免疫效应低下的原因之一。研究发现枸杞多糖能促进CD4+、CD8+T淋巴细胞的增殖与活化。有报道三氧化二砷及巴戟天能令CD3+、CD4+细胞比例及CD4+/CD8+的比值明显上升。本实验通过3H-TdR掺入法及流式细胞术检测发现斑蝥能极明显促进T淋巴细胞增殖(P＝0.00129)，并改变T淋巴细胞亚群比例，说明其具有增强细胞免疫作用。
自然杀伤(nature killer，NK)细胞在机体肿瘤的监护、抵御感染、及在免疫功能调节中发挥重要作用，它是细胞免疫中的非特异部分，它不需要预先致敏就能杀伤肿瘤细胞，其杀伤作用无肿瘤特异性和MHC限制性，因此其非特异性杀伤能力降低往往是肿瘤发展和转移的重要原因之一。既往研究发现荷瘤机体NK细胞活性明显降低，本实验也取得了同样结果，即荷瘤(H22)模型组小鼠的NK细胞活性显著低于正常组，说明荷瘤机体NK细胞活性处于严重低下状态，而药物组的NK细胞活性明显高于模型组(P＜0.005)，从而表明斑蝥可以增强荷肝癌小鼠NK细胞活性，提高其免疫力。
IFN-γ是参与细胞免疫应答的重要细胞因子之一，能促进Th0细胞分化为Th1细胞，影响Th1/Th2比率；Th2细胞是B细胞最有效的辅助者，对体液免疫最为重要，IL-4能促进Th0细胞分化为Th2细胞，并抑制Th1细胞，分泌其系列因子，促进体液免疫应答。机体要处于良好的免疫状态，必须保持Th1/Th2平衡，一旦Th1/Th2比例失调，向Th2方向漂移，造成免疫抑制状态，机体的抗肿瘤免疫将受到严重干扰。本实验检测到药物组小鼠T细胞分泌IFN-γ及IL-4含量较模型组均有显著升高(P＜0.05，P＜0.001)，说明斑蝥能显著上调CD4+Th1及Th2细胞的分泌能力，同时增强小鼠细胞免疫和体液免疫功能，因此能有效抑制小鼠肿瘤的生长。
综上所述，本实验证实了斑蝥具有抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的双重效应，为临床治疗肿瘤提供了依据。我们认为斑蝥抗肿瘤的作用机理可能是通过提高荷瘤小鼠脾淋巴细胞中CD4+、CD8+T淋巴细胞功能以及改变CD4+/CD8+比值，增强NK细胞杀伤功能，诱导IFN-γ和IL-4分泌，改善荷瘤小鼠的细胞及体液免疫而实现的。
实施例2含有羟基斑蝥胺的斑蝥合剂在制备治疗或预防H22肝癌的药中的应用1材料和方法1.1实验材料1.1.1斑蝥合剂斑蝥合剂中斑蝥含量为0.02g/ml。
1.1.2动物C57BL/6小鼠，雄性，10周龄，购自上海中科院动物中心。
1.1.3瘤株肝癌H22瘤株，由上海市免疫学研究所提供。
1.1.4试剂ConA(Sigma公司)，CD3、CD4、CD8单抗(eBioScience公司)，NK细胞杀伤试剂(上海市免疫研究所自配)，3H-TdR(上海原子能研究所)，IFN-γ和IL-4检测试剂盒(晶美公司)。
1.2实验方法1.2.1造模方法无菌条件下取生长7-9d传代接种的H22细胞株，将细胞5×106接种于每只小鼠右侧腋窝皮下。
1.2.3动物分组及给药方法小鼠30只，10只作为正常组，其余均按上法造模。小鼠接种肿瘤5天后，随机分成生理盐水组和实验组，每组10只，生理盐水组予以生理盐水处理，实验组给予斑蝥合剂0.02g/ml，均灌胃0.2ml/只，连续给药15天。
1.2.4标本采集停药次日，断颈处死小鼠，剥离肿瘤组织并无菌取脾。
1.3检测指标1.3.1小鼠体重、瘤重及抑瘤率胃饲15天后，称取两组小鼠体重；处死小鼠后完整剥离肿瘤，用电子天平称取瘤重，计算抑瘤率。
1.3.2T淋巴细胞增殖功能采用3H-TdR掺入法。在96孔平底培养板中，每孔加入小鼠脾细胞悬液100μl，浓度为5×106/ml，三复孔培养。同时，分别加入ConA 10μl。于37℃、5％CO2条件下培养72h。终止培养前16h，每孔加入3H-TdR 1μCi。用细胞收集仪将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，β-液闪仪测定cpm值，并计算刺激指数。
1.3.3NK杀伤功能用1640培养液分别调整小鼠脾细胞(效应细胞)和体外培养的K562细胞(靶细胞)浓度为5×106/ml和1×105/ml。按效∶靶＝50∶1比例，各取100μl加入96孔平底培养板，37℃、5％CO2条件下共同培养4h。并设自然释放和最大释放组作为实验阴阳性对照。然后1000rpm，离心5min。吸取上清100μl，加入底物液100μl，静置3min显色。再加入1N HCL终止反应，490nm波长读取OD值。计算NK细胞的杀伤百分率。
1.3.4T淋巴细胞表型采用直接免疫荧光及流式细胞仪分析。取小鼠脾细胞1×106，加入适量PE-Cy5-CD3、FITC-CD4和PE-CD8混合单抗，室温避光孵育20min。1000rpm，离心5min，洗涤2次后，加入300μl固定液，上机检测。
1.3.5细胞因子采用ELISA法。收集小鼠脾细胞经ConA刺激24h后的培养上清，按照细胞因子检测试剂盒操作说明分别测定IFN-γ和IL-4的含量。
1.4统计学处理采用Statpal团体T检验统计分析各组别数据的差异显著性。
2结果1.斑蝥合剂对荷瘤小鼠肿瘤有显著的抑制作用。
2.实验组小鼠T淋巴细胞转化刺激指数和NK细胞杀伤百分数均比生理盐水组显著增加。
3.与生理盐水组相比，实验组更能改变T淋巴细胞亚群比例。
4.实验组小鼠T细胞分泌IFN-γ及IL-4能力均有显著升高。
实施例3斑蝥在制备治疗或预防系统性红斑狼疮的药中的应用1.动物和材料实验动物系统性红斑狼疮实验大鼠60只，体重200±10g，鼠龄160天，每4只一笼，室温23±2℃，湿度30-50％，精制颗粒饲料，2.分组我们将上述60只系统性红斑狼疮实验小鼠随机分为两组皮质类固醇激素治疗组30例该组注射皮质类固醇激素，每日注射量为0.01g，连续给药15天。
斑蝥治疗组30例该组给予斑蝥水煎液0.01g/ml，均灌胃0.2ml/只，连续给药15天。
3.观察斑蝥治疗组主要临床症状发热、关节肿痛、皮肤蝶形红斑、尿蛋白、血沉的改善所需要天数分别为4.0、19.2、27.9天和22.8天。
皮质类固醇激素治疗组主要临床症状发热、关节肿痛、皮肤蝶形红斑、尿蛋白、血沉的改善所需要天数分别为9.0、23.8、47.9天和52天。
其中皮质类固醇激素治疗组中4例于1年内死亡。
4.结果斑蝥治疗组疗效优于皮质类固醇激素治疗组，斑蝥可以在制备治疗或预防系统性红斑狼疮的药中的应用。
权利要求
1.斑蝥在制备治疗或预防免疫失调引起的疾病的药中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述疾病为H22肝癌。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述疾病为系统性红斑狼疮。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述疾病为白癜风。
5.斑蝥合剂在制备治疗或预防免疫失调引起的疾病的药中的应用。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述斑蝥合剂选自斑蝥素、羟基斑蝥胺、斑蝥酸钠、去甲斑蝥素一种或几种。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述疾病为H22肝癌。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述疾病为系统性红斑狼疮。
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于所述疾病为白癜风。
全文摘要
本发明涉及斑蝥、斑蝥合剂的用途，尤其涉及它们在制药领域中的应用。本发明所公开斑蝥在制药中的应用，其优点表现在(1)本发明对斑蝥、斑蝥合剂发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。(2)本发明的斑蝥、斑蝥合剂安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。(3)斑蝥、斑蝥合剂具有抑制肿瘤生长和调节机体免疫功能的双重效应，为临床治疗肿瘤提供了依据。
文档编号A61P37/00GK1879658SQ20061002627
公开日2006年12月20日 申请日期2006年4月29日 优先权日2006年4月29日
发明者周阿高, 张勇, 孔德云, 葛海良, 任秋华 申请人:上海交通大学医学院附属第九人民医院