专利名称：基因重组融合蛋白pfk的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基因重组融合蛋白PFK的制备方法。
背景技术：
恶性肿瘤即癌症，是威胁人类健康的最严重的疾病之一。恶性实体肿瘤的常规治疗包括手术摘除、化学治疗、放射治疗等，这些治疗方法存在易复发，对人体的毒副作用大，会诱导抗药性产生等不理想之处。生命科学基础研究的突破和生物技术的发展，为恶性肿瘤的最终攻克提供了其他更加有效和可行的手段。
20世纪70年代初，Folkman博士提出“肿瘤增殖具有血管依赖性”的观点，即体积超过1mm3～2mm3的肿瘤需要新生血管维持营养和氧气的供给并且排出代谢产物，还需要新生血管提供转移的通道。从这个观点出发，提出一种治疗肿瘤的新策略，即不直接从正面攻击肿瘤，而是阻断肿瘤的营养供应，间接地抑制肿瘤生长，使其处于休眠状态。这就是抗血管生成疗法，也被形象地称为肿瘤的“饿死疗法”。
抗血管生成疗法是近几年来肿瘤生物治疗研究的热点，与以往的方法相比，有着显著的优越性①广泛的抑瘤谱；②不易产生耐药性；③无明显毒副作用；④药物易于到达靶部位；⑤可同时治疗肿瘤的转移；⑥与化疗和放疗有协同作用。目前已发现了多种血管生成抑制剂，有数百种药物进入了临床试验阶段，大多数处于二期临床，有十几种药物进入了三期临床，它们都显示出了初步疗效和光明的治疗前景。
PF4(人血小板第四因子)能抑制内皮细胞增殖和血管新生，它的COOH末端是活性关键部位。目前PF4已进入二期临床试验。
Angiostatin(血管抑素)是人纤溶酶原(Plasminogen)的kringle 1-kringle4区域，具有抑制血管内皮细胞增殖的能力。目前血管抑素已进入一期临床试验。其中K1(Kringle 1)不仅能有效抑制内皮细胞的增殖，还具有结合赖氨酸的能力(可以用赖氨酸亲和柱纯化蛋白)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因重组融合蛋白PFK的制备方法，该方法利用毕赤酵母真核表达系统对重组基因PFK进行表达，从而得到一种多靶点、多功能、高效的抗肿瘤血管生成基因重组融合蛋白PFK。
为达到上述目的，本发明采用如下技术方案一种基因重组融合蛋白PFK的制备方法，其特征在于该方法，包括以下步骤a.重组质粒pPICZαA-PFK的构建重组质粒pPICZαA-PFK包括2个功能域片段和2段连接臂，2个功能域片段分别是PF4 COOH端的13个氨基酸、K1基因；2段连接臂分别是连接PF4 COOH端13个氨基酸和K1基因的柔性连接臂(Gly)3；连接K1基因和K5基因的柔性连接臂(Ser(Gly)4)3。
b.重组酵母基因工程菌pPICZαA-PFK/GS115的构建；c.重组融合蛋白PFK的表达；d.重组融合蛋白PFK的纯化。
上述的重组质粒pPICZαA-PFK的构建方法为根据K1和PF4COOH-末端13个氨基酸的核苷酸序列设计PFK的上下游引物，通过PCR直接得到PFK融合基因。PFK片段用EcoRI和Kpn I双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之间，构成重组质粒pPICZαA-PFK。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
上述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-PFK/GS115的构建的方法为重组质粒pPICZαA-PFK用Sac I线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。
上述的重组融合蛋白PFK的表达方法为将重组酵母接种在BMGY中，振荡培养使菌增殖至O.D.＝5～6，离心收集菌体，将菌体重悬在BMMY中，使其O.D.值达到1.0，在28℃下进行甲醇诱导。每隔24小时补加甲醇至甲醇终浓度为0.5％，发酵至72小时时停止发酵，收获蛋白。
上述的重组融合蛋白PFK的纯化为用环氧氯丙烷法制备Sepharose-4B-Lys亲和柱，将发酵上清液加入用0.02M PBS(PH＝8.0)平衡好的亲和柱，0.4M NaCl/0.02MPBS(PH＝8.0)洗去杂蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)+0.2M NaCl/0.02M PBS(PH＝8.0)洗脱。取10uL的洗脱液进行SDS-PAGE分析，剩余部分透析(0.02M PBS，PH＝7.4，2×24小时)后冻存在-20℃。
毕赤酵母是真核表达系统，能以甲醇为唯一碳源，pPICZαA是分泌型表达质粒，含有醇氧化酶的强启动子(PAOXI)，在甲醇的诱导下能表达外源蛋白，并能分泌到胞外，方便蛋白的提取与纯化。毕赤酵母能通过发酵罐发酵生产大量的目的蛋白，不需要外加热源，成本低，规模大。
图1为重组质粒pPICZαA-PFK的构建流程2为PFK蛋白对PIEC细胞生长的抑制率曲线图具体实施方式
本发明主要包括三大部分重组酵母基因工程菌pPICZαA-PFK/GS115的构建，重组融合蛋白PFK的表达与纯化，重组融合蛋白PFK生物活性的测定。
具体方案叙述如下1 重组质粒pPICZαA-PFK的构建和鉴定根据K1和PF4COOH-末端13个氨基酸的核苷酸序列设计PFK的上下游引物上游引物5’-GGGGAA TTCCCG CTG TAC AAG AAA ATA ATT AAG AAA CTT TTG GAGAGT GGC CC6GGC GTG TAT CTC TCA GAG TGC-3’；下游引物5’-ACGGT ACCGCC GCC GCC AGA GCC GCC GCC AGA GCC GCC GCC AGA ACCACC AGA ACA CAC-3’。
为了能以K1的cDNA为模板，通过PCR直接得到PFK融合基因，我们在PFK的上游引物中引入PF4 COOH端的39个核苷酸和连接臂(Gly)3的核苷酸序列，在下游引物中引入柔性连接臂(Ser(Gly)4)3的核苷酸序列，这样在PCR扩增之后就能直接得到350bp的融合基因PFK。回收纯化扩增产物。
PFK片段用EcoRI和Kpn I双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/Kpn I之间，构成重组质粒pPICZαA-PFK。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。重组质粒pPICZαA-PFK用EcoRI和Kpn I双酶切，得到350bp和3.6kb两个片段，与预期结果相符。DNA序列测定表明，PFK基因的序列正确。
2 重组酵母基因工程菌pPICZαA-PFK/GS115的构建和鉴定重组质粒pPICZαA-PFK用Sac I线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。挑选Zeocin浓度为1000ug/ml平板上长出的克隆。用玻璃珠法提取重组酵母的染色体组，以其为模板，以PFK的上下游引物进行PCR扩增，得到350bp大小的片段，说明融合基因PFK成功地整合到了酵母染色体上。
3 重组融合蛋白PFK的表达将重组酵母接种在BMGY中，振荡培养使菌增殖至O.D.＝5～6，离心收集菌体，将菌体重悬在BMMY中，使其O.D.值达到1.0，在28℃下进行甲醇诱导。每隔24小时补加甲醇至甲醇终浓度为0.5％，并且每隔24小时(0，24，48，72，96小时)取出1ml菌液，将取出来的菌液离心，把上清液和菌体分别保存在-80℃。
将甲醇诱导不同时间(0，24，48，72，96小时)的发酵上清液浓缩后用SDS-PAGE分析，从图4观察到在23KD处有特异性蛋白条带；并且随诱导时间延长，重组酵母表达目的产物的量也随之增加。Bradford法测定发酵液中总蛋白含量并用凝胶图像扫描测定目的蛋白所占的比例，计算出
4 重组融合蛋白PFK的纯化融合蛋白PFK中的K1具有结合赖氨酸的能力，因此可以用Sepharose 4B-Lys亲和柱纯化。用环氧氯丙烷法制备Sepharose-4B-Lys亲和柱，将发酵上清液加入用0.02M PBS(PH＝8.0)平衡好的亲和柱，0.4M NaCl/0.02M PBS(PH＝8.0)洗去杂蛋白，0.2MEACA(6-氨基正己酸)+0.2M NaCl/0.02M PBS(PH＝8.0)洗脱。取10uL的洗脱液进行SDS-PAGE分析，剩余部分透析(0.02M PBS，PH＝7.4，2×24小时)后冻存在-20℃。
SDS-PAGE电泳图经凝胶图像密度扫描表明，纯化的重组融合蛋白PFK的纯度到达92.3％。本发明保留进一步提高纯度的可能。
5 12.8升发酵罐生产重组融合蛋白PFK在优化了的发酵条件下，重组融合蛋白PFK的表达量达到280mg/L。
6 MTT法测定重组融合蛋白PFK的生物活性将纯化得到的重组融合蛋白PFK，分别以终浓度50，25，10ng/ml加入猪髋动脉内皮细胞(PIEC)培养液中，用MTT比色分析法测定PFK蛋白对PIEC细胞生长的抑制率。图2的抑制率曲线表明PFK能抑制猪髋动脉内皮细胞的生长，ID50≈12ng/ml。
7 重组菌株的遗传稳定性将重组酵母菌pPICZαA-PFK/GS115传代10次以上后，PCR分析表明目的基因仍稳定地整合在染色体上，SDS-PAGE结果说明目的蛋白仍然表达，Bradford法测定和凝胶图像密度扫描证实目的蛋白的表达量基本维持不变。
重组融合基因PFK的核苷酸序列为
CCGCTGTACAAGAAAATAATTAAGAAACTTTTGGAGAGTGGCCCGGGCGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTACC最终获得的重组融合蛋白PFK的氨基酸序列为PLYKKIIKKLLESGPGVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEESGGGSGGGSGGGT。
序列表<110>上海大学<120>基因重组融合蛋白PFK的制备方法<140>
<141>
<160>4<210>1<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>1GGG GAA TTC CCG CTG TAC AAG AAA ATA ATT AAG AAA CTT TTG GAG AGT GGC CCG GGCGTG TAT CTC TCA GAG TGC 74<210>2<211>59<212>DNA<213>人工序列<220>
<222>
<223>
<400>2AC GGT ACC GCC GCC GCC AGA GCC GCC GCC AGA GCC GCC GCC AGA ACC ACC AGA ACACAC 59<210>3<211>348<212>DNA<213>人工序列
<220>
<222>
<223>
<400>3CCGCTGTACAAGAAAATAATTAAGAAACTTTTGGAGAGTGGCCCGGGCGTGTATCTCTCAGAGTGCAAGACTGGGAATGGAAAGAACTACAGAGGGACGATGTCCAAAACAAAAAATGGCATCACCTGTCAAAAATGGAGTTCCACTTCTCCCCACAGACCTAGATTCTCACCTGCTACACACCCCTCAGAGGGACTGGAGGAGAACTACTGCAGGAATCCAGACAACGATCCGCAGGGGCCCTGGTGCTATACTACTGATCCAGAAAAGAGATATGACTACTGCGACATTCTTGAGTGTGAAGAGGAATCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTACC348<210>4<211>116<212>PRT<213>人(homo sapiens)<220>
<222>
<223>
<400>5PLYKKIIKKLLESGPGVYLSECKTGNGKNYRGTMSKTKNGITCQKWSSTSPHRPRFSPATHPSEGLEENYCRNPDNDPQGPWCYTTDPEKRYDYCDILECEEESGGGSGGGSGGGT 11权利要求
1.一种基因重组融合蛋白PFK的制备方法，其特征在于该方法，包括以下步骤a.重组质粒pPICZαA-PFK的构建重组质粒pPICZαA-PFK包括2个功能域片段和2段连接臂，2个功能域片段分别是PF4 COOH端的13个氨基酸、K1基因；2段连接臂分别是连接PF4 COOH端13个氨基酸和K1基因的柔性连接臂(Gly)3；连接K1基因和K5基因的柔性连接臂(Ser(Gly)4)3；b.重组酵母基因工程菌pPICZαA-PFK/GS115的构建；c.重组融合蛋白PFK的表达；d.重组融合蛋白PFK的纯化。
2.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白PFK的制备方法，其特征在于所述的重组质粒pPICZαA-PFK的构建方法为根据K1和PF4 COOH-末端13个氨基酸的核苷酸序列设计PFK的上下游引物上游引物5’-GGGGAA TTCCCG CTG TAC AAG AAA ATA ATT AAG AAA CTT TTG GAGAGT GGC CCG GGC GTG TAT CTC TCA GAG TGC-3’；下游引物5’-ACGGT ACCGCC GCC GCC AGA GCC GCC GCC AGA GCC GCC GCC AGA ACCACC AGA ACA CAC-3’。以K1的cDNA为模板，通过PCR直接得到PFK融合基因。PFK片段用EcoRI和KpnI双酶切后插入质粒pPICZαA的EcoRI/KpnI之间，构成重组质粒pPICZαA-PFK。转化大肠杆菌TOP10F’，挑选出抗Zeocin的阳性克隆。
3.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白PFK的制备方法，其特征在于所述的重组酵母基因工程菌pPICZαA-PFK/GS115的构建的方法为重组质粒pPICZαA-PFK用SacI线性化后，电击转化毕赤酵母GS115，将电击后的混合液涂布在Zeocin浓度分别为100，250，500和1000ug/ml的YPDS平板上，30℃培养2～4天，待克隆长出。
4.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白PFK的制备方法，其特征在于所述的重组融合蛋白PFK的表达方法为将重组酵母接种在BMGY中，振荡培养使菌增殖至O.D.＝5～6，离心收集菌体，将菌体重悬在BMMY中，使其O.D.值达到1.0，在28℃下进行甲醇诱导。每隔24小时补加甲醇至甲醇终浓度为0.5％，发酵至第72小时时停止发酵，收获蛋白。
5.根据权利要求1所述的基因重组融合蛋白PFK的制备方法，其特征在于所述的重组融合蛋白PFK的纯化为用环氧氯丙烷法制备Sepharose-4B-Lys亲和柱，将发酵上清液加入用0.02M PBS(PH＝8.0)平衡好的亲和柱，0.4M NaCl/0.02MPBS(PH＝8.0)洗去杂蛋白，0.2M EACA(6-氨基正己酸)+0.2M NaCl/0.02MPBS(PH＝8.0)洗脱。取10uL的洗脱液进行SDS-PAGE分析，剩余部分透析(0.02MPBS，PH＝7.4，2×24小时)后冻存在-20℃。
全文摘要
本发明涉及一种基因重组融合蛋白PFK的制备方法。该方法包括以下步骤重组质粒pPICZαA－PFK的构建、重组酵母基因工程菌pPICZαA－PFK/GS115的构建、重组融合蛋白PFK的表达、重组融合蛋白PFK的纯化。毕赤酵母是真核表达系统，能以甲醇为唯一碳源，pPICZαA是分泌型表达质粒，含有醇氧化酶的强启动子(P
文档编号A61P35/00GK1948477SQ20061002621
公开日2007年4月18日 申请日期2006年4月28日 优先权日2006年4月28日
发明者陈宇光, 黄筱颖 申请人:上海大学