吲唑类衍生物及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及吲唑类衍生物及其制备方法和用途，属于化学医药领域。


背景技术：

2.酪氨酸激酶(tyrosine kinase,tk)能够通过将蛋白的酪氨酸残基磷酸化而传递信号，调控细胞生长、分化、死亡和其他生理生化过程。酪氨酸激酶的异常可以引起多种疾病。酪氨酸激酶的异常表达不仅对肿瘤发生发展具有重要作用，也与肿瘤侵袭、转移、新生血管及肿瘤对化疗的耐药有关。目前，酪氨酸激酶作为药物研发的重要靶点已成为抗肿瘤药物开发的热点，包括伊马替尼、吉非替尼、索拉非尼、克唑替尼、阿西替尼等在内的多种酪氨酸激酶抑制剂的抗肿瘤作用已在临床中得到验证，并使越来越多的肿瘤患者受益。
3.成纤维生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,fgfrs)是一种位于细胞膜上的受体酪氨酸激酶。fgf/fgfr信号通路在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多种癌症中出现异常活化。fgfr信号通路参与了调控细胞增殖、分化、迁移、存活、胚胎发育、血管生成和器官形成的信号转导过程。fgfr信号通路在癌症中频繁出现改变，并且临床前模型证明fgfr信号通路异常具有促使癌症形成的潜力。fgfr处于细胞信号通路的上游，通过衔接蛋白活化下游信号通路或直接与转录因子结合传导信号。fgfr激活突变或过表达能使fgfr信号通路持续过度活化，与癌症进程密切相关。
4.除癌症之外，fgfr也被报道与纤维化关联紧密。fgf信号与肺纤维化的发病机理有关。fgfr的受体酪氨酸激酶活性被尼达尼布抑制，能降低小鼠被博莱霉素诱导的纤维化。通过抑制fgf/fgfr通路能在体外降低tgf-β诱导的肺纤维原细胞的增殖和分化，并在体内降低博来霉素诱导的纤维化。在特发性肺纤维化中，fgf1和fgfr1的表达发生变化，并且fgf信号对肺纤维化的成纤维细胞迁移具有重要作用。因此，fgfr也是治疗肺纤维化的潜在靶点。
5.因此，开发对fgfr具有抑制作用的药物，对于肿瘤及肺纤维化的治疗具有重要意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供吲唑类衍生物及其制备方法和用途。
7.本发明提供了式ⅰ所示的化合物或其药学上可接受的盐：
8.9.x选自ch或n；
10.r1选自取代或未取代的芳基；
11.环a选自取代或未取代的五元杂环。
12.进一步地，环a选自取代或未取代的五元杂环，所述五元杂环含有1～2个杂原子，所述杂原子为氮或氧。
13.优选地，所述取代的五元杂环含有至少一个选自下组的取代基：卤素、羟基、c1～c6烷基。
14.优选地，环a选自
[0015][0016]
最优选地，环a选自
[0017]
进一步地，r1选自取代或未取代的5～10元芳基。
[0018]
优选地，r1选自取代或未取代的5～6元芳基。
[0019]
优选地，r1选自取代或未取代的吡唑基、取代或未取代的苯基。
[0020]
进一步地，所述取代的吡唑基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、取代或未取代的烷基。
[0021]
优选地，所述取代的吡唑基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、未取代的c1～c6烷基、卤素取代的c1～c6烷基、羟基取代的c1～c6烷基。
[0022]
优选地，所述取代的吡唑基为其中，r2选自羟基取代的c1～c6烷基。
[0023]
进一步地，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、取代或未取代的烷基、-c(＝o)r3；其中，r3选自取代或未取代的环烷基；其中，所述环烷基含有0～2个杂原子，所述杂原子为氮或氧。
[0024]
优选地，所述取代的苯基含有至少一个选自下组的取代基：卤素、未取代的c1～c6烷基、卤素取代的c1～c6烷基、羟基取代的c1～c6烷基、-c(＝o)r3；其中，r3选自未取代的5～6元环烷基、烷基取代的5～6元环烷基、叔丁氧羰基取代的5～6元环烷基。
[0025]
优选地，r3选自未取代的6元环烷基、烷基取代的6元环烷基、叔丁氧羰基取代的6元环烷基；其中，所述6元环烷基含有2个氮原子。
[0026]
优选地，r3为其中，r4、r5、r6、r7、r8独立地选自-h、叔丁氧羰基、取代或未取代的烷基。
[0027]
优选地，r4、r5、r6、r7、r8独立地选自-h、叔丁氧羰基、未取代的c1～c6烷基、取代的c1～c6烷基。
[0028]
优选地，r4、r5、r6、r7、r8独立地选自-h、叔丁氧羰基、未取代的c1～c6烷基。
[0029]
优选地，r4、r5、r6、r7、r8独立地选自-h、叔丁氧羰基、甲基。
[0030]
优选地，r4、r5、r6、r7、r8均选自-h，或者，r5、r6、r7、r8均选自-h，r4选自甲基或叔丁氧羰基，或者，r6、r7均选自-h，r5、r8均选自甲基，r4选自-h或叔丁氧羰基。
[0031]
进一步地，r1选自：
[0032][0032][0033]
进一步地，所述化合物选自：
[0034]
[0035][0036]
本发明还提供了所述化合物或其药学上可接受的盐的制备方法，包括如下步骤：
[0037]
s1、化合物1经碘代得到中间体2：
[0038][0039]
s2、原料sm-1与sm-2经过钯催化的偶联反应，得到化合物3：
[0040][0041]
其中，ha为-br或-i；
[0042]
s3、中间体2与化合物3经过钯催化的偶联反应，得到中间体4：
[0043][0044]
s4、中间体4与化合物5经过钯催化的偶联反应，得到式ⅰ所示的化合物：
[0045][0046]
进一步地，所述制备方法满足以下至少一项：
[0047]
步骤s1将化合物1溶于dmf中，加入碱和i2进行反应，即得中间体2；
[0048]
步骤s2将原料sm-1，原料sm-2，钯催化剂，碱以及配体溶于溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得化合物3；
[0049]
步骤s3将中间体2，化合物3，钯催化剂和碱加入溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得中间体4；
[0050]
步骤s4将中间体4，化合物5，钯催化剂和碱加入溶剂中，惰性气氛保护下进行反应，即得式ⅰ所示的化合物。
[0051]
进一步地，所述制备方法满足以下至少一项：
[0052]
步骤s1中，所述碱选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钠或氢氧化钾中的一种以上；
[0053]
步骤s1中，化合物1：碱：碘的摩尔比为1：1.5～3.0：1.1～1.8；
[0054]
步骤s1中，反应时间为1～5h；
[0055]
步骤s2中，所述溶剂为甲苯；
[0056]
步骤s2中，所述碱为diea；
[0057]
步骤s2中，所述钯催化剂为pd2(dba)3；
[0058]
步骤s2中，所述配体为三叔丁基膦四氟硼酸盐；
[0059]
步骤s2中，sm-1：sm-2：碱的摩尔比为1：1.1～1.5：1.5～2.0；
[0060]
步骤s2中，所述惰性气氛为n2；
[0061]
步骤s2中，反应温度为95
±
3℃；
[0062]
步骤s2中，反应时间为7～10h；
[0063]
步骤s3中，所述碱选自diea、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾或碳酸铯中的一种
以上；
[0064]
步骤s3中，钯催化剂选自醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物或三(二亚苄基茚丙酮)二钯；
[0065]
步骤s3中，溶剂选自二氧六环或二氧六环与水的混合溶剂；
[0066]
优选地，所述混合溶剂中二氧六环与水的体积比为4～8：1；
[0067]
步骤s3中，反应温度为80～100℃；
[0068]
步骤s3中，反应时间为5～10h；
[0069]
步骤s3中，中间体2与化合物3的摩尔比为1.0：1.0～1.2；
[0070]
步骤s3中，所述惰性气氛为n2；
[0071]
步骤s4中，所述碱选自碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、磷酸钾或碳酸铯中的一种以上；
[0072]
步骤s4中，钯催化剂选自醋酸钯、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯、[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物或三(二亚苄基茚丙酮)二钯；
[0073]
步骤s4中，溶剂选自二氧六环或二氧六环与水的混合溶剂；
[0074]
优选地，所述混合溶剂中二氧六环与水的体积比为4～8：1；
[0075]
步骤s4中，反应温度为90～110℃；
[0076]
步骤s4中，反应时间为5～10h；
[0077]
步骤s4中，所述惰性气氛为n2；
[0078]
步骤s4中，中间体4与化合物5的摩尔比为1.0:1.0～1.2。
[0079]
本发明还提供了所述化合物或其药学上可接受的盐在制备fgfr抑制剂类药物中的用途；优选地，所述的药物是fgfr1抑制剂。
[0080]
进一步地，所述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防癌症的药物中的用途；优选地，所述癌症为乳腺癌、结直肠癌、肺癌、膀胱癌、血液癌、前列腺癌、卵巢癌、胰腺癌、胃癌或肝癌。
[0081]
进一步地，所述化合物或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防器官纤维化的药物中的用途；优选地，所述器官纤维化为肺纤维化或肝纤维化。
[0082]
本发明还提供了药物组合物，它是以所述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分，加入药学上可接受的辅料或者辅助性成分制备而成的制剂。
[0083]
术语定义：
[0084]
本发明提供的化合物和衍生物可以根据iupac(国际纯粹与应用化学联合会)或cas(化学文摘服务社，columbus，oh)命名系统命名。
[0085]
术语“烷基”是直链或支链的饱和烃基的基团。c1～c6烷基的实例包括但不限于甲基(c1)、乙基(c2)、正丙基(c3)、异丙基(c3)、正丁基(c4)、叔丁基(c4)、仲丁基(c4)、异丁基(c4)、正戊基(c5)、3-戊基(c5)、戊基(c5)、新戊基(c5)、3-甲基-2-丁基(c5)、叔戊基(c5)和正己基(c6)。
[0086]
术语“芳基”是指在芳族环系中包含或不包含杂原子的4n+2芳族环系的基团，其中，杂原子选自氮、氧和/或硫。
[0087]
术语“环烷基”是指包含或不包含杂原子的饱和的环状烃基，其可以是单环结构，也可以是两个以上的环，其中，杂原子选自磷、硫、氧和/或氮。
[0088]
术语“卤素”是指氟(f)、氯(cl)、溴(br)、碘(i)。
[0089]
术语“药学上可接受的”是指某载体、运载物、稀释剂、辅料，和/或所形成的盐通常在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。
[0090]
术语“药学上可接受的盐”是指本发明化合物与无机和/或有机酸和碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐(内盐)，还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将上述化合物与一定数量的酸或碱适当(例如等当量)进行混合而得到。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷冻干燥制得。本发明中所述盐可以是化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
[0091]
本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
[0092]
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增溶剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
[0093]
固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
[0094]
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。
[0095]
除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
[0096]
除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
[0097]
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
[0098]
用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。
[0099]
本发明所述药学上可接受的辅料，是指除活性成分以外包含在剂型中的物质。
[0100]
本发明所述药学上可接受的辅助性成分，它具有一定生理活性，但该成分的加入不会改变上述药物组合物在疾病治疗过程中的主导地位，而仅仅发挥辅助功效，这些辅助功效仅仅是对该成分已知活性的利用，是医药领域惯用的辅助治疗方式。若将上述辅助性成分与本发明药物组合物配合使用，仍然应属于本发明保护的范围。
[0101]
本发明提供了一类结构新颖的吲唑类衍生物。生物学实验表明，这类化合物对fgfr展现出明显的抑制作用，并且，部分化合物在单独使用的情况下即可有效抑制乳腺癌细胞、结直肠癌细胞、肺癌细胞等癌细胞，具有广谱的抗癌作用；此外，对成纤维细胞和人肝星状细胞的增殖也表现出明显的抑制作用，且动物体内抗博来霉素诱导的肺纤维化效果与目前临床上用于治疗肺纤维化的药物尼达尼布相当，抗纤维化疗效显著。本发明为抗癌、抗纤维化药物的开发和应用提供了新的选择。
附图说明
[0102]
图1为本发明化合物6-2抑制博来霉素诱导的肺纤维化的肺部结构变化-he(苏木精-伊红染色)图。
具体实施方式
[0103]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0104]
实施例1
[0105][0106]
将原料1(1.6g,8mmol)溶于dmf(20ml)中，加入氢氧化钾(897mg,16mmol)、碘(3g,12mmol)，室温反应3h后tlc监测。反应完毕后用保险粉的饱和水溶液淬灭反应，将反应液倒入水中，有白色固体析出，将固体过滤后干燥，得中间体2(白色固体，90％)，ms m/z(esi)：322.9[m+h]
+
。
[0107][0108]
将1-boc-(2s,6r)-2,6-二甲基哌嗪(1.8g,8.4mmol)溶于二氯甲烷50ml中，加入n,n-二异丙基乙胺(diea，2.4ml,14.4mmol)，室温下搅拌，再加入4-碘苯甲酰氯(2.1g,8mmol)，室温反应3h后tlc监测。反应完毕后将反应液用二氯甲烷稀释，水洗3次，有机相用
无水硫酸钠干燥后减压浓缩，得中间体7-1(浅黄色固体，86％)，ms m/z(esi)：445.1[m+h]
+
。
[0109][0110]
中间体7-2的制备方法与中间体7-1类似，是由1-boc-哌嗪与4-碘苯甲酰氯反应制得(白色固体，89％)，ms m/z(esi)：417.1[m+h]
+
。
[0111][0112]
中间体7-3的制备方法与中间体7-1类似，是由n-甲基哌嗪与4-碘苯甲酰氯反应制得(浅黄色固体，92％)，ms m/z(esi)：353.0[m+na]
+
。
[0113][0114]
将中间体7-1(3.55g,8mmol)、乙烯基硼酸频哪醇酯(1.6ml,9.6mmol)、diea(2.4ml,14.4mmol)加入干燥甲苯(80ml)中，再加入pd2(dba)3(1mmol％)、三叔丁基膦四氟硼酸盐(1mmol％)，氮气保护下升温至95℃反应8h，tlc监测。反应完毕后减压浓缩溶剂，剩余物用乙酸乙酯溶解后经硅藻土过滤，滤液用饱和nacl溶液洗涤三次，有机相用无水硫酸钠干燥后减压浓缩，柱层析(pe:ea＝4:1)得中间体3-1(浅黄色固体，53％)，ms m/z(esi)：471.4[m+h]
+
。
[0115][0116]
中间体3-2的制备方法与中间体3-1类似，是由中间体7-2与乙烯基硼酸频哪醇酯反应制得(浅黄色固体，61％)，ms m/z(esi)：443.3[m+h]
+
；
[0117][0118]
中间体3-3的制备方法与中间体3-1类似，是由中间体7-3与乙烯基硼酸频哪醇酯反应制得(浅黄色固体，57％)，ms m/z(esi)：357.2[m+h]
+
；
[0119][0120]
中间体3-4的制备方法与中间体3-1类似，是由2-(4-溴-1h-吡唑-1-基)乙醇与乙烯基硼酸频哪醇酯反应制得(浅黄色固体，50％)，ms m/z(esi)：265.2[m+h]
+
。
[0121][0122]
将中间体2(1.3g,3.8mmol)、化合物3-1(2g,4.2mmol)、pd(dppf)cl2(5mmol％)，碳酸钾(940mg,1.8mmol)，加入1,4-二氧六环与水(4:1)的混合溶剂50ml中，n2置换后于100℃下反应10h，tlc监测反应。反应完全后将反应液减压浓缩，剩余物用乙酸乙酯溶解，经硅藻土过滤，滤液浓缩后，经柱层析(pe:ea＝2:1)得到中间体4-1(浅黄色固体，47％)。ms m/z(esi)：561.2[m+na]
+
。
[0123][0124]
中间体4-2的制备方法与中间体4-1类似，是由中间体3-2与中间体2反应制得(浅黄色固体，46％)，ms m/z(esi)：511.1[m+h]
+
；
[0125][0126]
中间体4-3的制备方法与中间体4-1类似，是由中间体3-3与中间体2反应制得(浅黄色固体，51％)，ms m/z(esi)：447.1[m+na]
+
；
[0127][0128]
中间体4-4的制备方法与中间体4-1类似，是由中间体3-4与中间体2反应制得(浅
黄色固体，35％)，ms m/z(esi)：333.1[m+h]
+
；
[0129][0130]
取中间体4-1(269mg,0.5mmol)，化合物5-1(134mg,0.55mmol)，pd(dppf)cl2(5mmol％)，碳酸钾(138mg,1mmol)，加入1,4-二氧六环与水(4:1)的混合溶剂15ml中，n2置换后于100℃下反应8h，tlc监测反应。反应完全后将反应液减压蒸除，剩余物用二氯甲烷与甲醇混合溶剂溶解，经硅藻土过滤，滤液浓缩后，经薄层色谱层析(dcm:meoh＝12:1)得到化合物6-1(浅黄色固体，17％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.35(s,1h),11.83(s,1h),8.38(d,j＝8.4hz,1h),8.33(d,j＝4.9hz,1h),7.90(s,1h),7.84(d,j＝7.9hz,2h),7.74
–
7.56(m,4h),7.46(d,j＝7.9hz,2h),7.30(d,j＝4.9hz,1h),6.68(dd,j＝3.5,1.9hz,1h),4.33(s,2h),3.53(s,2h),3.00(d,j＝5.2hz,2h),1.42(s,9h),1.10(d,j＝20.8hz,6h)；hrms(esi-tof)m/z calcd for c
34
h
36
n6o3[m+h]
+
:577.2928,found:577.2935。
[0131][0132]
取化合物6-1(50mg)，加入hcl/1,4-二氧六环溶液10ml，室温下搅拌5h，浓缩溶剂，剩余物用甲醇溶解后经薄层色谱层析(dcm:meoh＝8:1)得化合物6-2(浅黄色固体，39％)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δ13.25(s,1h),11.82(s,1h),8.38(d,j＝8.4hz,1h),8.33(d,j＝4.9hz,1h),7.90(s,1h),7.84(d,j＝7.9hz,2h),7.74
–
7.56(m,4h),7.46(d,j＝7.9hz,2h),7.30(d,j＝4.9hz,1h),6.68(dd,j＝3.5,1.9hz,1h),3.41(s,3h),3.19(s,3h),1.08(d,j＝20.8hz,6h),0.86(m,1h)；hrms(esi-tof)m/z calcd for c
29
h
28
n6o[m+h]
+
:477.2404,found:477.2409。
[0133]
下表1中化合物的制备方法与化合物6-1和6-2的制备方法类似。
[0134]
表1
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139][0140][0141]
以下通过生物学实验证明本发明的有益效果。
[0142]
试验例1本发明化合物的生物学实验
[0143]
一、实验仪器及材料
[0144]
本发明中生物实验所用到的仪器如下，超净工作台bhc-1000iia/b3：苏净安泰生物技术公司；恒温水浴箱polyscience 9505：polyscience公司；灭菌锅mls-3780：sanyo公司；烘箱：binder公司；超纯水仪milli-q integral 10：millipore公司；酶标仪multiscan mk3、细胞培养箱、低速离心机sorvall st1：thermofisher公司；centrifuge 5415c超速离心机：德国eppendorf公司；nuaire nu-425-600e生物安全柜：美国nuaire公司；bcd-215yd型普通冰箱：中国haier公司；sanyo(-80℃)超低温冰箱：日本三洋电器集团；rocker 51702摇床：美国cole parmer公司；96孔细胞培养板：costa corning公司；普通光学显微镜：olympus公司；移液枪：thermo公司；ph计：coring公司；高压灭菌锅：sanyo公司。
[0145]
本发明实验中采用的细胞系购自美国atcc公司。培养细胞所用各种必需品购自gibco brl公司，包括dmem培养基、rpmi 1640培养基、胎牛血清(fbs)和胰酶。四甲基偶氮唑蓝(mtt)、二甲基亚砜(dmso)购自美国sigma公司。
[0146]
二、实验方法
[0147]
1、激酶测试
[0148]
用dmso将化合物稀释至反应中最终所需最高抑制剂浓度的50倍。将100μl化合物稀释液转移到96孔板中。在同一96孔板的两个空白孔中加入100μldmso。该96孔板作为源板。将10μl化合物从源板转移到的96孔板中，作为中间板。向中间板的每个孔中加入90μl l1x激酶缓冲液。在振荡器上将中间板中的化合物混合10分钟。将96孔中间板的每孔取5μl转移至384孔板，设置副孔。在1x激酶碱缓冲液中加入激酶。在1x激酶碱缓冲液中加入fam标记的肽和atp。测定板中已含有5μl化合物10％dmso溶液。向384孔测定板的每个孔中加入10μl l2.5x酶溶液。在室温下孵育10分钟。向384孔测定板的每个孔中加入10μl的2.5x肽溶液。在28℃下孵育特定时间后，加入25μl终止缓冲液以停止反应。在caliper上收集数据，将数据进一步换算为ic
50
。
[0149]
2、细胞培养
[0150]
从液氮中取出冻存保种的细胞，迅速置于37℃恒温水浴复温融化，在无菌条件下用培养基洗涤1次。然后用完全培养基接种于培养瓶内，在37℃，5％co2培养箱中培养，第二天置换新鲜细胞培养液。悬浮生长细胞的传代：细胞培养2～3天后，从培养箱中取出培养瓶，收集细胞悬液于离心管中，1500rpm/min，离心3min，倒去上清液，细胞沉淀用完全培养基重悬并吹打均匀，然后分至3～5瓶培养。一般3～4天传代1次；贴壁生长细胞的传代：细胞贴壁长满至瓶底的80％左右，从培养箱中取出培养瓶，吸去培养基，用0.25％胰酶洗涤1次，然后加入0.25％的胰酶消化液消化，观察细胞收缩变圆后，加入完全培养基终止消化，并吹打使细胞分散脱落，收集细胞悬液，1500rpm/min，离心3min，倒去上清液，细胞沉淀用完全培养基重悬并吹打均匀，然后分至3～5瓶瓶培养。一般3～4天传代1次。
[0151]
3、细胞增殖抑制实验(mtt法)
[0152]
收集对数生长期的细胞，以每孔2.5
×
103～1
×
104个的数量接种于96孔板中，在37℃、5％co2的细胞培养箱中培养过夜24小时，采用dmem培养基稀释待测药物并加入到96孔板中，每种药物8个梯度，每个梯度含3个复孔。加药组中，按梯度(终浓度分别为1000、333、127、42.3、14.1、4.7、1.56、0.53nm)每孔加入100μl化合物的培养基溶液，每个浓度设3个复孔；阴性对照组每孔中加入含1
‰
dmso的空白培养基100μl，共6个复孔；空白对照组每孔中
只加入100μl培养基。将板置于37℃、5％co2细胞培养孵箱内培养72小时。药物处理组、隐形对照组和空白组每孔加入20μlmtt溶液(5mg/ml)，继续培养2-4小时，待甲瓒形成后，终止培养，倾去上清液后每孔加150μldmso(对于悬浮细胞则直接加入50μl 20％sds溶液)，在摇床上摇15～20分钟。用酶标仪在570nm波长下检测每孔细胞吸光度(od 570
)，取其平均值记录结果。细胞增殖抑制率＝(对照组od
570-实验组od
570
)/(对照组od 570-空白od
570
)
×
100％。最后，使用graphpad prism软件拟合半数抑制浓度。
[0153]
4、动物体内抑制肺纤维化实验
[0154]
1.动物模型及给药：c57bl/6小鼠(7-9周龄，体重18-22g)购自华阜康(中国北京)。将小鼠养并在spf条件下维持在设施中。在实验的第0天，先用10％水合氯醛将小鼠麻醉，然后给小鼠单次气管内滴注溶于生理盐水(2mg/kg体重)的博来霉素，同时注射等体积的生理盐水到对照组的大鼠中。第二天随机将小鼠分组，每组10只，每天口服灌胃本发明化合物6-2(30mg/kg)，阳性对照为尼达尼布(nintedanib，bibf1120)(30mg/kg,溶剂配比为dms0:ped400:生理盐水＝0.5:3.5:6)药和等体积的溶剂做对照。给药14天后，处死小鼠。
[0155]
2.he染色在实验的第15天处死小鼠。将肺组织样品置于4％(m/v)pbs-缓冲的多聚甲醛溶液中，三天后，取部分组织冲水2h，后使用梯度乙醇脱水并包埋在石蜡中。将包裹在石蜡中的组织切割连续切片(3μm)并用苏木精和伊红染色以评估组织病理学变化程度。
[0156]
三、实验结果
[0157]
1、化合物对fgfr1激酶的抑制情况。
[0158]
表2化合物对fgfr1激酶的ic50值
[0159]
[0160][0161]
注：字母a代表ic
50
为50nm以下，字母b代表ic
50
为50nm至100nm，字母c代表ic
50
为100nm至500nm，字母d代表ic
50
为500nm以上。
[0162]
2、化合物对肿瘤细胞的增殖抑制情况。
[0163]
表3化合物对肿瘤细胞的ic50值
[0164][0165]
注：4t1是鼠源乳腺癌细胞，hct116是人结肠癌细胞，a549是人非小细胞肺癌细胞。
[0166]
3、化合物对nih-3t3鼠源胚胎成纤维细胞，人肺成纤维细胞和人肝星形细胞lx2的增殖抑制情况。
[0167]
表4化合物对成纤维细胞和人肝星形细胞的ic50值
[0168]
[0169]
4、动物体内实验结果
[0170]
实验结果见图1。图1，he染色结果显示：假手术组，小鼠肺组织结构完整清晰，肺泡壁未见增厚，无炎性细胞侵入，无成纤维细胞增生；溶剂对照组，小鼠肺泡结构破坏，大量的炎性细胞浸润及成纤维细胞增生，肺泡间隔增宽，呈明显纤维化状态；尼达尼布阳性对照组，小鼠肺组织结构完整，清晰，较溶剂组相比，明显的好转；6-2化合物治疗组，与溶剂对照组相比，情况明显好转，病变程度明显减少，肺实质结构未见明显大量破坏。
[0171]
以上实验结果表明，本发明化合物6-2具有抗肺纤维化的作用。