本发明属于免疫技术领域，特别涉及一种大肠杆菌o157免疫磁珠洗液。
背景技术：
大肠杆菌o157:h7是肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagicescherichiacoli,ehec)中较为显著的血清型菌株，大肠杆菌o157:h7的感染剂量极小(仅为10个菌)。感染后的病人可能会出现腹泻等症状，进一步发展为出血性结肠炎，病情发展极快，致死率高，给社会和大众健康造成严重伤害。
食源性的ehec感染中，肉类及其制品、牛奶、水果及其制品等均可受到污染，在常规的大肠杆菌检测中，难以检测到此病原菌，为了提高检测率，不断有分子检测产品的涌现，灵敏度得到了提高，但检测结果更容易受到样品基质的影响，检测前样品前处理的重要性变得尤为突出。
众多检测技术中，免疫磁珠法效果显著。免疫磁珠法是一种具有特异性的分离富集技术，在多个领域如dna提取、蛋白纯化、细胞筛选、食源性致病微生物富集等，都有重要的应用价值。高品质的抗体资源对免疫磁珠特异性富集至关重要，但实际应用中，不同的食品基质如肉沫会干扰富集过程，造成免疫磁珠的回收率降低从而降低富集效果。因此在免疫富集操作过程中，需要使用免疫磁珠洗液清除食品杂质。但常规免疫磁珠洗液并没有起到很好的效果。尤其是对肉沫样品进行富集，损失了大量免疫磁珠，从而降低了目标菌的检出率。而且还降低了清洗效果，增加了其他病原菌，使得清洗过程不能达到实验要求。
根据现有技术的缺陷，研制一种大肠杆菌o157免疫磁珠洗液成为亟需解决的问题。
技术实现要素：
本发明的首要目的在于提供一种大肠杆菌o157免疫磁珠洗液，以降低食品基质的干扰并提高大肠杆菌o157的检出率。
为达到上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明第一个方面，提出了一种大肠杆菌o157免疫磁珠洗液。根据本发明的实施例，大肠杆菌o157免疫磁珠洗液，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有表面活性剂、蛋白质、水溶性糖、无机盐、特异性抑菌剂，其中特异性抑菌剂可以抑制样品中的非目标菌生长。根据本发明的实施例，可提高了洗液的清洗效果，并且有效降低了食品基质的干扰，而且具有特异持续性增菌的功效，尤其是目标菌含量极低的样品增菌效果显著，从而提高了大肠杆菌o157的检出率。
根据本发明的实施例，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有0.2～1.45g/l表面活性剂、0.5～0.7g/l无机盐、4.8～33.9g/l蛋白质、5.0～6.5g/l水溶性糖、0.003～1.017g/l特异性抑菌剂。
根据本发明的实施例，
所述表面活性剂选自tween-20、tritonx-100、ohodasurfon-870中的至少一种；
所述蛋白质选自胰蛋白胨、酪蛋白钠、乳白蛋白中的至少一种；
所述水溶性糖选自乳糖；
所述无机盐选自nacl、kcl的至少一种；
所述特异性抑菌剂选自新生霉素钠、胆盐。
根据本发明的实施例，所述洗液的ph＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有5.0～6.5g/l乳糖、4.8～6.8g/l胰蛋白胨、7.6～10.6g/l酪蛋白钠、7.0～10.0g/l乳白蛋白、0.5～0.7g/lnacl、13～17mg/l新生霉素钠、0.6～1.0g/l胆盐、0.60～0.75g/ltween-20、0.20～0.35g/ltritonx-100和0.20～0.35g/lohodasurfon-870。发明人发现，质量比在上述范围内时，增菌和清洗效果更显著。为了进一步效果，发明人进行了进一步优化，惊喜地发现，配比效果大大增强，在上述范围内时，增菌和清洗效果更佳显著。
根据本发明的实施例，所述洗液的ph＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有5.0g/l乳糖、4.8g/l胰蛋白胨、7.6g/l酪蛋白钠、7.0g/l乳白蛋白、0.5g/lnacl、13mg/l新生霉素钠、0.6g/l胆盐、0.60g/ltween-20、0.20g/ltritonx-100和0.20g/lohodasurfon-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。
根据本发明的实施例，所述洗液的ph＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有6.5g/l乳糖、5.8g/l胰蛋白胨、8.6g/l酪蛋白钠、8.5g/l乳白蛋白、0.65g/lnacl、15mg/l新生霉素钠、0.8g/l胆盐、0.70g/ltween-20、0.30g/ltritonx-100和0.30g/lohodasurfon-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。
根据本发明的实施例，所述洗液的ph＝7.0～7.5，其溶液为缓冲液，所述缓冲液中添加有7.0g/l乳糖、6.8g/l胰蛋白胨、10.6g/l酪蛋白钠、10.0g/l乳白蛋白、0.70g/lnacl、17mg/l新生霉素钠、1.0g/l胆盐、0.75g/ltween-20、0.35g/ltritonx-100和0.35g/lohodasurfon-870。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。
根据本发明的实施例，所述缓冲液为pbs缓冲液或tris-hcl缓冲液。在上述配比中，增菌和清洗效果更佳显著。
本发明第二方面，本发明提出了前面所述免疫磁珠洗液的制备方法，按前面任一项所述的配方称取各原料，混合即得免疫磁珠洗液。
本发明第三方面，本发明提出了前面所述免疫磁珠洗液的使用方法，包括以下步骤：将免疫磁珠与样品混匀孵育，静置磁分离，去上清；加入前面任一项所述免疫磁珠洗液孵育，静置磁分离，去上清。
根据本发明的实施例，所述免疫磁珠与样品的体积比为：20μl：1ml。
根据本发明的实施例，所述孵育条件为35～37℃孵育10～15min。
根据本发明的实施例，所述静置磁分离1～2min。
根据本发明的实施例，所述免疫磁珠洗液体积为1～2ml。
本发明第四方面，本发明提出了前面任一项所述免疫磁珠洗液作为大肠杆菌o157检测试剂中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明的大肠杆菌o157免疫磁珠洗液组分以特定比例混合，能够提高免疫清洗功效，而且特异增菌，提高了大肠杆菌o157的检出率。有效降低食品基质的干扰，提高了免疫磁珠的准确率、灵敏度，满足现代工业生产需求。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整的说明，但并不局限于此。
ohodasurfon-870是一种表面活性剂，购于扬州施惠尔生物科技有限公司，货号spbhs17。胰蛋白胨(货号t819615)，购自于麦克林公司。新生霉素钠盐(货号mb5425)，购自于大连美仑生物技术有限公司。胆盐(b8550)，采购于北京索莱宝科技有限公司；其他材料、试剂，如无特殊说明，均为商业途径购得。
大肠杆菌o157免疫磁珠制备方法：
1)取1mg羧基磁珠放ep管中，加入1ml超纯水中超声30s，离心去上清取沉淀，清洗，最后重悬于100μl超纯水中；
2)缓慢加入mix&go活化剂(货号a-smpn100，购于sigma)100μl，置于混匀仪上室温活化1h；
3)活化后加1mlmest(25mm，ph6.0)缓冲液洗涤2遍，重悬于100μlmes缓冲液中；
4)缓慢加入抗大肠杆菌o157抗体(购自于abcam，货号ab30521)50～80μg，置于混匀仪上室温偶联2h；
5)用tbst缓冲液洗涤磁珠，加入1ml封闭液(含1％bsa的pbs溶液)，置于混匀仪上封闭2h；
6)封闭完成后，用tbst缓冲液洗涤磁珠，得到本发明后续实验的大肠杆菌o157免疫磁珠。
实施例1～8
实施例1～8的大肠杆菌o157免疫磁珠洗液按照表1的配方1～8对原料称取，使用pbs缓冲液(0.1m,ph7.4)配制成相对应的溶液；混合，搅拌混匀，使得洗液的ph＝7.0～7.5，即得大肠杆菌o157免疫磁珠洗液。
常规洗液配方为含0.5g/ltween-20的pbs(0.1m，ph7.4)溶液。
表1免疫磁珠洗液不同配方组分
对本发明实施例的免疫磁珠洗液做进一步效果检测。
免疫磁珠洗液的单因素分析
大肠杆菌o157免疫磁珠洗液组分：乳白蛋白、ohodasurfon-870单因素水平按表2设置，其他组分使用pbs缓冲液(0.1m,ph7.4)分别配制为6.5g/l乳糖、4.8g/l胰蛋白胨、7.6g/l酪蛋白钠、0.5g/lnacl、13mg/l新生霉素钠、0.6g/l胆盐、0.60g/ltween-20、0.20g/ltritonx-100、0.35g/lohodasurfon-870，混合。
另外，将大肠杆菌o157按照以下组别设置：0.5cfu/g、1.0cfu/g、2.5cfu/g、5.0cfu/g、10.0cfu/g、15.0cfu/g、20.0cfu/g，分别对猪肉进行人工感染。
依据国标gb4789.4-2016的实验步骤，对感染后的猪肉样品增菌，分别取增菌液1ml、20μl的免疫磁珠加到1ml猪肉样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1ml本发明制备的免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清取沉淀，沉淀洗涤两次。
按lamp试剂盒(货号kjd05l，广东环凯微生物科技有限公司)说明书或者其他定量方法鉴定大肠杆菌o157的含量。
表2大肠杆菌o157免疫磁珠洗液组分的单因素实验
结果如表2所示，免疫磁珠洗液中乳白蛋白的适宜浓度为2.5～20g/l，大肠杆菌o157的检出量为2.5～10cfu/g，灵敏度极高；cfu/gohodasurfon-870的适宜浓度为0.1～0.4g/l，大肠杆菌o157的检出量为2.5～10cfu/g，灵敏度极高。
免疫磁珠洗液的灵敏度实验
按照0.1cfu/g、0.5cfu/g、2.5cfu/g、5cfu/g、10cfu/g、20cfu/g、62.5cfu/g七个水平对猪肉样品进行人工污染,依据国标gb4789.4-2016对样品增菌，分别取增菌液1ml，20μl免疫磁珠加入1ml样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1ml免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清，重复洗涤操作进行两次。
最后用lamp试剂盒或其他定量方法进行结果鉴定。
结果如表3所示。使用本发明制备的磁珠洗液能够显著地提高了检测大肠杆菌o157的灵敏度，其中配方4、5和6(实施例4、5和6)阳性检出率最多，效果最好。
表3大肠杆菌o157免疫磁珠洗液对检出率的影响
实际样品验证
从三个农贸市场各采集50份猪肉样品，按照国标gb4789.4-2016对样品增菌，分别取增菌液1ml，20μl免疫磁珠加入1ml样品中混匀后，37℃孵育10min，放入磁力架中静置1～2min，去除上清；加入1ml本发明实施例的免疫磁珠洗液混匀后，37℃孵育15min,放入磁力架中静置1～2min后去除上清，重复洗涤操作进行两次。
最后用lamp试剂盒或其他定量方法进行结果鉴定。
表4免疫磁珠洗液对阳性检出率的影响
从表4中所示的结果可以看出，使用配方4、5、6的洗液检出的阳性样品明显高于常规洗液，本发明实施例4、5和6制备的免疫磁珠洗液更有利于提高阳性样品的检出率。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。