一种适用于秸秆微贮的乳酸菌菌剂及其制备工艺的制作方法

本发明属于家畜饲料中的秸秆微贮
技术领域：
，尤其涉及一种适用于秸秆微贮的乳酸菌菌剂及其制备工艺。
背景技术：
：微贮是通过乳酸菌的增殖，将原料中的发酵底物转化成乳酸等酸性物质，维持酸性厌氧环境，以利于微贮作物长期保存的一种贮藏方式。微贮饲料颜色黄绿、气味酸香、柔软多汁、适口性好，在畜牧业生产中广泛应用，尤其在反刍动物饲养中，已成为重要的优质粗饲料来源。与牧草晾晒成干草相比，牧草微贮可以大幅度缩短从收割到贮藏的时间，避免不良天气造成的饲草损失，使青绿饲草的营养成分得到最大限度的保存。目前在黑龙江省，每年便会产生约为4千万吨的玉米秸秆，但当地农民却不能有效地利用秸秆，玉米秸秆的处理方式多为焚烧或随意丢弃，且这种处理方式会造成严重的环境污染(如雾霾的频发)和资源浪费。与此同时，黑龙江还是畜牧大省，仅牛就有约5百万头，但饲料化的秸秆量不仅不足，且质量不优。很多事实表明，玉米秸秆用微贮发酵的方法发酵后，会变成一种含有酸香气味、牲畜爱食且易消化的粗饲料。这样的处理方法，在一定程度上不仅解决了上述问题，而且还会带来巨大的经济效益。而乳酸菌在微贮发酵的过程中，有很重要的作用，会直接影响微贮饲料制备的好坏。由于玉米秸秆自身所携带的乳酸菌数量较少，无法在微贮发酵过程中发挥作用，会严重影响微贮饲料的制备，因此需要额外添加乳酸菌才能保证生产出高品质的微贮饲料。乳酸菌是近年来正在推广的微贮微生物添加剂，其主要作用是调节微贮物料内微生物组成，迅速成为优势菌群，竞争抑制有害微生物生长，快速转化有限的糖分，显著地降低微贮ph值，从而有效提高微贮饲料的质量，具有较大潜力和广阔的发展前景。目前市售的微贮乳酸菌添加剂是常温乳酸菌，其最适生长温度一般都高于15℃，当气温低于此温度时，就会生长代谢迟缓，导致发酵延迟、甚至停滞，不适于黑龙江省玉米秸秆微贮饲料制备时的环境温度。而大面积修建发酵车间或提供持续供暖系统投入量大，不符合实际发展现状。而且乳酸菌多以冻干粉的形式供应市场，但乳酸菌直接进行冷冻干燥时很容易衰退失活，活菌稳定性低。目前，对微贮乳酸菌的研制主要集中在植物乳杆菌等单一菌种，而且冻干粉有效活菌数低，存活率低。技术实现要素：为了解决上述技术问题，本发明提供一种适用于秸秆微贮的乳酸菌菌剂，该乳酸菌菌剂由植物乳杆菌lp-1522和屎肠球菌ef0518混合冻干粉组成，所述的植物乳杆菌菌株lp-1522于2015年2月4日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.10516，分类学命名为lactobacillusplantarum；所述屎肠球菌菌株ef0518于2018年05月31日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.15833，分类学命名为enterococcusfaecium；所述植物乳杆菌菌株和屎肠球菌菌株的保藏地址都为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明还提供了一种适用于秸秆微贮的乳酸菌菌剂的制备工艺，该方法包括如下步骤：(1)对植物乳杆菌lp-1522和屎肠球菌ef0518分别使用发酵罐进行规模化培养；(2)利用离心机分别对2种菌体培养液进行分离，收集菌体形成菌泥；(3)植物乳杆菌菌泥和屎肠球菌菌泥按照活菌数2:1.5-2的比例进行混合；(4)以非脂乳固体含量≥8.5％的脱脂纯牛奶作为介质与保护剂混合成为复合保护剂，该复合保护剂与2种菌的混合菌泥按照体积比1-1.5:1进行充分地混合；(5)混匀后的菌泥液体分装到2000ml冻干盘中，每个冻干盘中分装800-1000ml菌泥液体，-30℃～-40℃预冷冻2h，然后转入冻干机中冻干；所述复合保护剂除脱脂牛奶外各组分及其终浓度分别为0.4-0.6％vc、3.0-5.0％甘油、7.0-9.0％蔗糖、4.0-6.0％谷氨酸，并调节ph值至7.5；所述冻干机冻干工艺参数为：-30℃30min，-20℃1h，-10℃20h，-5℃2.5h，0℃2.5h，5℃1h，10℃1h，15℃1h，25℃4h；进一步的，所述步骤(1)中植物乳杆菌的规模化培养包括如下步骤：中试在装量350l的500l发酵罐中进行培养，以mrs为初始培养基，在0.5kgf/cm2下灭菌30min，在培养基温度低于38℃时接种，接种量0.5％，保温37℃静止培养，培养过程中前16h每4h搅拌5min，以后每2h搅拌一次，培养过程16h与24h2次补料至总糖质量浓度8.0％，同步直接补充混合氮源质量浓度至8.0％，培养过程中使用氢氧化钠三次调整ph到6.0-6.5，培养在40h～41h时结束。进一步的，所述步骤(1)中屎肠球菌的规模化培养包括如下步骤：中试在装量350l的500l发酵罐中进行，mrs培养基装量350l，在0.5kgf/cm2蒸汽压力下灭菌30min，待培养基温度降至40℃以下时0.5％接种量接种，控制温度36-38℃，静止培养，使用30％氢氧化钠在16h、24h时分别调整ph到6.0-6.8，培养时间32h。进一步的，所述步骤(2)中2种菌体培养液分别经管式离心机分离，转速为16000r/min，分别收集菌泥。进一步的，所述步骤(4)中复合保护剂与2种菌的混合菌泥按照体积比1:1进行充分地混合。进一步的，所述步骤(5)中每个冻干盘中分装900ml菌泥液体。进一步的，所述复合保护剂除脱脂牛奶外各组分终浓度为0.5％vc、4.0％甘油、8.0％蔗糖、5.0％谷氨酸，并调节ph值至7.5。现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的乳酸菌菌剂的制备工艺采用植物乳杆菌lp-1522菌泥和屎肠球菌ef0518菌泥按照一定比例混合作为菌种，添加特定的复合防冻剂并调节ph值，通过预冷冻及设置特定参数的冻干机冻干制备出菌体存活率和有效活菌数更高的冻干粉，而且简化了操作步骤，不需要分别制备冻干粉再混合。附图说明图1为乳酸菌菌剂制备流程图。具体实施方式实施例11.植物乳杆菌lp-1522发酵罐规模化培养，包括如下步骤：mrs培养基组分为：蛋白胨10.0g，牛肉浸粉5.0g，葡萄糖20.0g，酵母浸粉4.0g，乙酸钠(ch3coona·3h2o)5.0g，磷酸氢二钾(k2hpo4·3h2o)2.0g，硫酸镁(mgso4·7h2o)0.58g，柠檬酸二铵2.0g，吐温801.0ml，硫酸锰(mnso4·h2o)0.25g，蒸馏水1000ml，ph6.2-6.6。中试在装量350l的500l发酵罐中进行培养，以mrs为初始培养基，在0.5kgf/cm2下灭菌30min，在培养基温度低于38℃时接种，接种量0.5％，保温37℃静止培养，培养过程中前16h每4h搅拌5min，以后每2h搅拌一次，培养过程16h与24h2次补料至总糖质量浓度8.0％，同步直接补充混合氮源质量浓度至8.0％，培养过程中使用氢氧化钠三次调整ph到6.0-6.5，培养在40h～41h时结束。培养液经管式离心机分离，转速16000r/min，收集菌泥。在此工艺条件下，四批次的试验结果(如表1)表明，发酵液中活菌数量5.8×109cfu/ml，菌体的平均得率0.63％，残还原糖1.55％。表1500l发酵罐生产试验结果2.屎肠球菌ef0518发酵罐规模化培养，包括如下步骤：中试在装量350l的500l发酵罐中进行，mrs培养基装量350l，在0.5kgf/cm2蒸汽压力下灭菌30min，待培养基温度降至40℃以下时0.5％接种量接种，控制温度36-38℃，静止培养，使用30％氢氧化钠在16h、24h时分别调整ph到6.0-6.8，培养时间32h。3.冻干粉剂型产品的生产主要依托发酵设备、菌体分离设备与冻干设备进行，已经完成对植物乳杆菌和屎肠球菌的规模化培养，利用容积500l的发酵罐成功地生产出高密度的液体菌剂。利用高速管式离心机以转速10000r/min、流量150l/hr条件进行连续离心(表2)，收集菌体，植物乳杆菌和屎肠球菌的回收率分别达到88.63％、89.30％，收集得到的菌泥含水量65％以下，菌体得率分别为0.63％、0.61％，为菌体的冻干奠定基础。表2生产试验500l发酵罐菌体(菌泥)收集结果4.菌体的预冷冻以及冻干机冻干植物乳杆菌菌泥和屎肠球菌菌泥按照活菌数2:1.5-2的比例进行混合，以非脂乳固体含量≥8.5％的脱脂纯牛奶作为介质与保护剂混合成为复合保护剂，该复合保护剂与2种菌的混合菌泥按照体积比1-1.5:1进行充分地混合；混匀后的菌泥液体分装到2000ml冻干盘中，每个冻干盘中分装800-1000ml菌泥液体，-30℃～-40℃预冷冻2h，然后转入冻干机中冻干。复合保护剂除脱脂牛奶外各组分终浓度为0.5％vc、4.0％甘油、8.0％蔗糖、5.0％谷氨酸，并调节ph值至7.5。冷冻会对细胞和生命体产生一定的破坏作用，其机理是非常复杂的，目前尚无统一的理论，但一般认为主要是由机械效应和溶质效应引起。生物物质的冷冻过程首先是从纯水结冰开始，冰晶的生长逐步造成电解质的浓缩，随后是低共熔混合物凝固，最后全部变为固体。机械效应是细胞内外冰晶生长而产生的机械力量引起的，特别是对于有细胞膜的生命体影响较大，一般冰晶越大，细胞膜越易破裂，从而造成细胞死亡；冰晶小，对细胞膜的机械损伤也较小。缓慢冷冻产生的冰晶较大，快速冷冻产生的冰晶较小。就此而言，快速冷冻对细胞的影响较小，缓慢冷冻更容易引起细胞的死亡。产品在进行冷冻干燥前，需要装入适宜的容器进行预先冻结，才能进行升华干燥。预冷冻过程不仅是为了保护物质的主要性能不变，而且要获得冻结后产品有合理的结构以利于水份的升华。因此，对料样进行预冷冻是十分必要的。虽然在预冷冻条件下，冻干瓶内的液体样品都能够被冻结，但随温度的提高冻结时间会相应延长，实际的冻干效果有很大的区别，在-5℃时样品外观形态极差；-20℃时料样有瑕疵；-30℃与-40℃时料样齐整，是比较适合的预冷冻条件。冷冻干燥是通过冰的升华作用达到干燥的目的，水蒸气自料层内溢出的速度决定着冻干的速率，水蒸汽溢出阻力来自很多方面，如产品的种类、成份、浓度、保护剂等，无疑料层的厚度也是重要的影响因素之一，理论上物料堆积的厚度愈薄，传热和传质越快，干燥时间越短。干燥时相同规格冻干瓶内的装液量决定着料层的厚度，也相应地影响着冻干速度。预冷冻后，按照表3所示的冻干机工艺参数进行冻干。表3冻干机工艺参数区段运行时间设定温度℃130min-30260min-20320hr-1042h30min-552h30min0660min5760min10860min1594h25预计总时33hr30min5.冻干粉产品检验结果采用制定的工艺流程与工艺参数，进行了冻干粉产品生产试验。采用半固体琼脂试管法检测总有效活菌数，冻干前后菌体存活率达到90.09％，有效活菌数4.80×1011cfu/g，产品卫生指标达到饲料卫生标准(gb13078)中要求。表4依据饲料卫生标准(gb13078)对冻干粉产品检验结果序号测定项目允许量(最小值)①实际测定结果1杂菌率％≤1.0--2黄曲霉毒b1μg/kg≤10.0≤0.13砷(以总as计)mg/kg≤2.0≤0.044铅(以pb计)mg/kg≤5.00.025汞(以hg计)mg/kg≤0.10.016镉(以cd计)mg/kg≤0.50.017大肠菌群个/kg≤1.0×105未检出8霉菌总数个/kg≤2.0×107未检出9沙门氏菌不得检出未检出备注：⑴饲料卫生标准(gb13078)中未对微生物饲料添加剂类产品提出明确指标。⑵本表中“标准要求”所列的是标准中最小值。⑶标准中规定，“浓缩饲料、添加剂预混合饲料添加比例与本标准备注不同时，其卫生指标允许量可进行折算”。以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。当前第1页1 2 3