一种贴壁细胞的提取方法及用于该方法的提取装置与流程

文档序号:19790679发布日期:2020-01-24 14:14阅读:1375来源:国知局
一种贴壁细胞的提取方法及用于该方法的提取装置与流程

本发明涉及生物细胞领域,尤其涉及一种贴壁细胞的提取方法及用于该方法的提取装置。



背景技术:

贴壁细胞(adherentcells),这类细胞的生长必须有可以贴附的支持物表面,细胞依靠自身分泌的或培养基中提供的贴附因子才能在该表面上生长,繁殖。故而该类细胞的分离和提取比较困难和麻烦,目前的提取方法要么步骤繁多,操作麻烦且容易出错;要么细胞伤害较大;因此,提供一种操作简单,对细胞伤害小的贴壁细胞的提取方法及适用于该方法的提取装置对于细胞研究具有重要意义。



技术实现要素:

本发明克服了现有技术的不足,提供一种操作简单,对细胞伤害小的贴壁细胞的提取方法及适用于该方法的提取装置。

为达到上述目的,本发明采用的技术方案为:提供了一种贴壁细胞的提取方法,其特征在于:包括以下步骤:

在细胞培养孔板上铺上聚丙烯酰胺水凝胶,并使用磷酸缓冲盐溶液浸泡聚丙烯酰胺水凝胶;

将聚丙烯酰胺水凝胶在磷酸缓冲盐溶液浸泡的条件下,在紫外线下照射;之后吸走磷酸缓冲盐溶液,采用sulfo-sanpah溶液处理所述聚丙烯酰胺水凝胶;之后紫外线照射,再静置;之后吸走sulfo-sanpah溶液,采用无血清培养基孵育水凝胶,最后将细胞种在水凝胶上进行稀释培养;

细胞贴壁后,通过倒置显微镜物镜选取单个细胞;调节取样针到所述细胞位置;将取样针插入所述细胞周围的水凝胶中;移动取样针,破坏所述细胞周围的水凝胶,最终将所述细胞以及粘连在其上的水凝胶整体取出;

采用培养液将所述细胞以及粘连在其上的水凝胶从取样针上冲洗到指定位置;之后采用胰蛋白酶消化处理,去除所述水凝胶;最后将含有细胞的胰蛋白酶移到培养基对细胞进行培养。

作为一种优选方案,所述聚丙烯酰胺水凝胶由丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺和水制成。

作为一种更优选方案,所述聚丙烯酰胺水凝胶由30-45wt%的丙烯酰胺水溶液、1.5-3wt%的甲叉双丙烯酰胺水溶液、5-15wt%的过硫酸铵水溶液、四甲基乙二胺和水制成;所述丙烯酰胺水溶液、甲叉双丙烯酰胺水溶液以及水的总体积和过硫酸铵水溶液、四甲基乙二胺的体积比为1000:10-20:0.5-2;所述丙烯酰胺水溶液、甲叉双丙烯酰胺水溶液与水的体积比为1:0.8-2.5:0.8-1.5。

作为一种更优选方案,所述聚丙烯酰胺水凝胶通过以下步骤制成:

a.分别配置丙烯酰胺的水溶液、甲叉双丙烯酰胺的水溶液以及过硫酸铵的水溶液;

b.按比例称取丙烯酰胺溶液、甲叉双丙烯酰胺溶液、过硫酸铵溶液、四甲基乙二胺和水;混合均匀后加入bio-rad垂直灌胶架,在20-30℃条件下静置至少2小时。

作为一种优选方案,所述聚丙烯酰胺水凝胶应铺满培养孔板的底面,铺设厚度为0.5-2mm;磷酸缓冲盐溶液浸泡聚丙烯酰胺水凝胶的时间至少7天。

作为一种优选方案,所述聚丙烯酰胺水凝胶在磷酸缓冲盐溶液浸泡的条件下,在紫外线下照射时间至少为20分钟;采用sulfo-sanpah溶液处理聚丙烯酰胺水凝胶的时间至少为1小时;采用sulfo-sanpah溶液处理聚丙烯酰胺水凝胶后,再进行紫外线照射的时间至少为20分钟,之后静置的时间至少为1小时;采用无血清培养基孵育水凝胶的时间至少为6小时;

其中:所述紫外线的波长为313-340nm,紫外线辐照度为356-480μw·cm-2;sulfo-sanpah溶液应将聚丙烯酰胺水凝全部浸渍,sulfo-sanpah溶液的浓度为0.5-0.75mg/ml。

作为一种优选方案,所述胰蛋白酶消化处理时间至少为1分钟。

本发明还提供了一种用于上述提取方法的贴壁细胞提取装置,其特征在于:包括光源、细胞培养孔板、取样针、三轴支架、旋钮以及倒置显微镜物镜;所述光源、三轴支架分别设置于细胞培养孔板的上方,所述倒置显微镜物镜设置于细胞培养孔板的下方;所述旋钮设置在三轴支架上,所述取样针偏心设置在旋钮上,可随着旋钮的转动,而绕旋钮的中心转动。

作为一种优选方案,所述取样针为圆筒状、刀状或者挖勺状。

作为一种优选方案,所述取样针与细胞培养孔板倾斜设置。

本发明与现有的技术相比有益技术效果在于:

(1)本发明提取方法操作方便易行,不需要繁琐的步骤,仅需要4步便可以完成对于贴壁细胞的提取,减少了出错的可能性;同时采用的提取装置结构简单,成本低廉。

(2)本发明对于贴壁细胞的破坏很小,对于细胞研究具有重要意义。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1为本发明的贴壁细胞提取装置的结构示意图。

图中:1为光源、2为细胞培养孔板、3为取样针、4为三轴支架、5为旋钮、6为倒置显微镜物镜。

具体实施方式

现在结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明,这些附图均为简化的示意图,仅以示意方式说明本发明的基本结构,因此其仅显示与本发明有关的构成;同时以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案,而不能以此来限制本发明的保护范围。

如图1所示,一种用于贴壁细胞提取的提取装置,包括光源1、细胞培养孔板2、取样针3、三轴支架4、旋钮5以及倒置显微镜物镜6;其中光源1设置于细胞培养孔板2的正上方;三轴支架4设置于细胞培养孔板2的上方,光源1的一侧;倒置显微镜物镜2设置于细胞培养孔板的正下方,与光源1位置对应;旋钮5设置在三轴支架4上,取样针3偏心设置在旋钮5上;当转动旋钮5时,取样针3可绕旋钮5的中心转动。

取样针3设置为圆筒状(也可以选择刀状或挖勺状);取样针3与细胞培养孔板2倾斜设置,这样避免在操作时遮挡光线;需要说明的是,取样针3的结构不限于圆筒状,也可以选择刀状、挖勺状或其他便于取样的结构;另外,取样针3也可以设置为与细胞培养孔板2垂直设置,此时为了避免光线被遮挡光源1可搭配环形光源。

以下为采用上述提取装置进行贴壁细胞提取的应用实例。

实例1

一种贴壁细胞提取方法,包括以下步骤:

(1)在细胞培养孔板的底面铺满聚丙烯酰胺水凝胶,铺设厚度为1mm;使用磷酸缓冲盐溶液(pbs缓冲液)浸泡聚丙烯酰胺水凝胶7天,以消除水凝胶对细胞的毒性。

(2)经过步骤(1)处理的聚丙烯酰胺水凝胶在pbs缓冲液浸泡的条件下,在紫外线下照射20分钟,其中:紫外线的波长为313nm,紫外线辐照度为356μw·cm-2;采用紫外线照射可以对水凝胶灭菌,使细胞培养在无菌环境中进行;

之后吸走pbs缓冲液,采用sulfo-sanpah溶液浸渍处理聚丙烯酰胺水凝胶1小时,sulfo-sanpah溶液是一种交联剂,可在聚丙烯酰胺水凝胶和细胞之间起到桥梁作用,从而使细胞更好地贴壁于水凝胶;sulfo-sanpah溶液的用量为铺满培养孔板的底面,将聚丙烯酰胺水凝全部浸渍即可,sulfo-sanpah溶液的浓度为0.5mg/ml;

之后紫外线照射20分钟进行再次灭菌处理,再静置1小时;

之后吸走sulfo-sanpah溶液,采用无血清培养基孵育水凝胶表面6小时;

最后将细胞种在水凝胶上进行稀释培养,培养条件为37℃,5%co2。

(3)细胞贴壁后,放置在倒置显微镜物镜下观察并选取单个细胞;通过调节三轴支架4,将取样针3移动到选定细胞的位置;将取样针3对准细胞周围的水凝胶插入;通过旋转旋钮5移动取样针3,破坏细胞周围的水凝胶,最终将所述细胞以及粘连在其上的水凝胶整体取出。

(4)将细胞以及附带在其上的水凝胶移动至指定位置;向圆筒状取样针3的中空针尾中注入少量培养液,将细胞以及附带在其上的水凝胶从取样针3上冲洗到指定器皿中;再添加1ml胰蛋白酶在上述器皿中,并放入细胞培养箱消化1分钟,去除残留在细胞周围的水凝胶;最后将含有细胞的胰蛋白酶移到添加有血清的完全培养基上,对细胞进行常规培养,完成操作。

其中:步骤(1)中的聚丙烯酰胺水凝胶由以下步骤制成:

a.将丙烯酰胺配置成40wt%的水溶液,将甲叉双丙烯酰胺配置成2wt%的水溶液,将过硫酸铵配置成10wt%的水溶液,备用;

b.称取1.5ml的丙烯酰胺溶液、3.3ml的甲叉双丙烯酰胺溶液、1.2ml的水、60μl过硫酸铵溶液以及6μl四甲基乙二胺;混合均匀后加入bio-rad垂直灌胶架,在25℃条件下静置2小时。

所得聚丙烯酰胺水凝胶的弹性模量为65.82kpa,具有一定脆性,易于分离和挖去,同时具有良好的透光性,利于观察到凝胶中的细胞。

实例2

一种贴壁细胞提取方法,包括以下步骤:

(1)在细胞培养孔板的底面铺满聚丙烯酰胺水凝胶,铺设厚度为0.75mm;使用磷酸缓冲盐溶液(pbs缓冲液)浸泡聚丙烯酰胺水凝胶15天。

(2)经过步骤(1)处理的聚丙烯酰胺水凝胶在pbs缓冲液浸泡的条件下,在紫外线下照射36分钟,其中:紫外线的波长为340nm,紫外线辐照度为480μw·cm-2

之后吸走pbs缓冲液,采用sulfo-sanpah溶液浸渍处理聚丙烯酰胺水凝胶2.5小时,sulfo-sanpah溶液的用量为铺满培养孔板的底面,将聚丙烯酰胺水凝全部浸渍即可,sulfo-sanpah溶液的浓度为0.75mg/ml;

之后紫外线照射40分钟,再静置2.5小时;

之后吸走sulfo-sanpah溶液,采用无血清培养基孵育水凝胶表面12小时;

最后将细胞种在水凝胶上进行稀释培养,培养条件为37℃,5%co2。

(3)细胞贴壁后,放置在倒置显微镜物镜下观察并选取单个细胞;通过调节三轴支架4,将取样针3移动到选定细胞的位置;将取样针3对准细胞周围的水凝胶插入;通过旋转旋钮5移动取样针3,破坏细胞周围的水凝胶,最终将所述细胞以及粘连在其上的水凝胶整体取出。

(4)将细胞以及附带在其上的水凝胶移动至指定位置;向圆筒状取样针3的中空针尾中注入少量培养液,将细胞以及附带在其上的水凝胶从取样针3上冲洗到指定器皿中;再添加1ml胰蛋白酶在上述器皿中,并放入细胞培养箱消化2分钟;最后将含有细胞的胰蛋白酶移到添加加有血清的完全培养基上,对细胞进行常规培养,完成操作。

其中:步骤(1)中的聚丙烯酰胺水凝胶由以下步骤制成:

a.将丙烯酰胺配置成40wt%的水溶液,将甲叉双丙烯酰胺配置成2wt%的水溶液,将过硫酸铵配置成10wt%的水溶液,备用;

b.称取1.5ml的丙烯酰胺溶液、2.5ml的甲叉双丙烯酰胺溶液、2ml的水、60μl过硫酸铵溶液以及6μl四甲基乙二胺;混合均匀后加入bio-rad垂直灌胶架,在20℃条件下静置6小时。

所得聚丙烯酰胺水凝胶的弹性模量为60.49kpa,具有一定脆性,易于分离和挖去,同时具有良好的透光性,利于观察到凝胶中的细胞。

实例3

本实例与实例2基本相同,不同之处在于:聚丙烯酰胺水凝胶制备步骤略有不同,具体如下:

a.将丙烯酰胺配置成30wt%的水溶液,将甲叉双丙烯酰胺配置成3wt%的水溶液,将过硫酸铵配置成5wt%的水溶液,备用;

b.称取2ml的丙烯酰胺溶液、1.7ml的甲叉双丙烯酰胺溶液、2.3ml的水、120μl过硫酸铵溶液以及6μl四甲基乙二胺;混合均匀后加入bio-rad垂直灌胶架,在30℃条件下静置4小时。

所得聚丙烯酰胺水凝胶的弹性模量为55.02kpa,具有一定脆性,易于分离和挖去,同时具有良好的透光性,利于观察到凝胶中的细胞。

以上依据本发明的理想实施例为启示,通过上述的说明内容,相关人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内,进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容,必须要根据权利要求范围来确定技术性范围。

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