本发明属于生物
技术领域：
：，具体涉及玉米phol特异蛋白及特异分解的鉴定方法。
背景技术：
：：phol为一种重要的淀粉合成相关酶，在植物中广泛分布。报道中有人通过提取甘薯块根中的phol发现phol存在特异降解的特点。水稻、玉米胚乳中提取出的phol也能发生一定程度的特异降解。提取生物体内蛋白常用的是gpc法，按照预计的分子量来分离大分子的蛋白单体或多聚体。玉米phol已证实位于玉米胚乳中的造粉体中，并常与淀粉合酶、淀粉分支酶等其他淀粉合成相关酶形成复合体。现有的技术手段进行检查的一般程序为，利用基因工程利用原核表达蛋白的表达，采用生物方法进行纯化，利用免疫印迹、凝胶渗透色谱gpc(gelpermeationchromatography)最终进行检测。ying等人在2001年(identificationofthemaizeamyloplaststromal112-kdproteinasaplastidicstarchphosphorylase)利用gpc技术成功分离了phol，但是步骤过于复杂，要求研究者熟练掌握gpc仪器操作与样品预处理，实验耗时较长，不利于动态研究玉米phol特异性分解等翻译后修饰过程。phol发生的特异降解位置为其特有的插入结构l80结构域。但是，phol常与淀粉合酶、淀粉分支酶等其他酶类形成“团粒淀粉复合体”，位于造粉体内部，采用常规的分子筛色谱分离法，能够实现phol的分离，但是耗时耗力，不利于快速简便研究phol的特异分解等翻译后修饰过程。技术实现要素：针对以上的缺陷，本发明提供了一种简便的检测玉米phol特异分解的方法，有利于研究玉米phol的翻译后修饰。本发明从实际角度出发，克隆并表达纯化玉米质体型磷酸化酶phol，通过制备造粉体裂解液，在体外模拟phol在造粉体内部的反应条件，利用原核表达蛋白标签抗体、抗phol特异抗体，检测phol在多个温度下的特异分解。实现一种简便、快速检测玉米phol特异分解的方法。本发明的第一个目的在于提供了玉米特异蛋白的表达载体，所述的表达载体含有phol、phom、phol-as、phol-sa中的任意一种。所述的表达载体含有phol特异基因序列，所述的phol的基因序列如seqno：1所示。所述的表达载体含有phom特异基因序列，所述的phom的基因序列如seqno：2所示。phom人工合成去除了第1075至1295的基因序列的phol的cds序列。所述的表达载体含有phol-as特异基因序列，所述的phol-as的基因序列如seqno：3所示。扩增引物如下：1muphol_f:5’tagaggcagaagaagagcgttctgaggatgagtt1muphol_r:5’aactcatcctcagaacgctcttcttctgcctcta。其中，phol-as为将phol中430位的色氨酸突变为丙氨酸，即1290-1292位的序列ttc突变为gcc。所述的表达载体含有phol-sa特异基因序列，所述的phol-sa的基因序列如seqno：4所示。扩增引物如：2muphol_f:5’gaggcagaagaagagaggcctgaggatgagttagat3’2muphol_r:5’atctaactcatcctcaggcctctcttcttctgcctc3’。phol-sa为将phol431位的色氨酸突变为丙氨酸，即1293-1295位的序列突变为gct。扩增：体系和反应程序如下扩增phol-sa/phol-as的pcr体系如下：反应混合体系：5μl10x缓冲液、50ng载体(50ng/μl))、125ng正向引物(125ng/μl)、125ng反向引物(125ng/μl)，1μl50mmmgso4和1μl10mmdntp混合物，补ddh2o水至50μl。扩增phol-sa/phol-as的pcr反应程序如下：将产物每10μlpcr产物加入1μldpni，37℃下处理2小时。dpni核酸内切酶(靶序列：5′-gm6atc-3′)对甲基化和半甲基化dna具有特异性，用于剪切亲本dna模板并选择含有突变的合成dna。在本发明的一实施例中，phol-sa/phol-as的pcr产物的酶切反应体系如下：所述的表达载体的基因序列的5’端加bgli切位点，3’端加xhoi酶切位点。所述的phol的基因序列以及phom的基因序列表达载体的基因序列扩增引物如下：sp-f:5’gcatgcgcgaagtctcccgttgctc3’；sp-r:5’ggatcctggtcgtcgccattgctg3’。phom的基因序列为删除l80后的pholcds序列。本发明的第二个目的提供一种玉米特异蛋白表达载体的表达方法，包括以下步骤：a)玉米cdna的制备；b)玉米phol的cds序列扩增，并将其连入pmd-19载体；c)重组表达载体扩增；d)表达载体的表达、纯化以及浓度的测定。进一步地，当一种含玉米phol特异蛋白载体的表达方法，包括了玉米籽粒rna的提取、cdna的制备与扩增、载体构建与phol特异蛋白表达，具体包括以下步骤：e)玉米cdna的制备；具体包括玉米籽粒rna的提取、cdna的制备与扩。f)玉米phol的cds序列扩增，并将其连入pmd-19载体；g)phol特异蛋白的扩增；h)phol的表达、纯化以及浓度的测定。phol特异蛋白表达的具体制备过程如下：步骤1)原核表达蛋白的表达与纯化a：玉米籽粒rna的提取①、本实验选用玉米骨干自交系b73，于授粉后20d(dap20)收获玉米果穗，超净工作台中，用75％的医用酒精充分消毒果穗，用高温高压灭菌消毒的手术刀和镊子剥取籽粒，于无菌的10ml冻存管中，每管10粒籽粒，迅速用液氮速冻，并放于-80℃冰箱保存。②、取150-200mg籽粒于rnase处理过的液氮预冷的研钵中，加液氮迅速研磨成粉；迅速将约100mg粉末转移至预冷的1.5ml离心管中，并迅速加入1ml预冷的trizol，立即上下颠倒混合，并用涡旋仪快速混合；冰浴10-15min后，加入预冷的200ml氯仿并上下颠倒混合；冰浴5-10min后，4℃，1200rpm/min离心10-15min；小心吸取上清与1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿，上下颠倒混合，室温放置10min，4℃10000rpm/min离心10min；小心吸取上清与1.5ml离心管中，加入登体积预冷的异丙醇(液相色谱级)，上下剧烈颠倒混合，室温静置10min；4℃10000rpm/min离心10min；弃上清，加入1ml75％乙醇，于4℃10000rpm/min离心5min，重复此步骤2次；弃上清，加入1ml无水乙醇(液相色谱级)，于4℃10000rpm/min离心5min；弃上清，真空冷冻干燥乙醇，约10min；加入50-100μl无rnase的ddh2o，充分溶解，用紫外分光光度计测定籽粒rna的质量，a260/a280＝1.6～1.8。b：phol的cdna的制备和扩增制备：首先去除rna中可能存在的基因组dna，在进行cdna的合成，具体做法是使用takara公司的反转录试剂盒制备cdna第一链，根据takara公司的反转录试剂盒(no.drr047s)的操作说明书。扩增：体系和反应程序如下扩增phol全长cds的pcr体系如下：扩增phol全长cds的pcr反应程序如下：回收：反应结束后，向pcr反应产物中添加5×pcrloadingbuffer，1％琼脂糖凝胶电泳检测，并回收大小正确且单一的条带。采用axygene琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段。检测：回收片段连入pmd-19载体进行测序，与genebank公布的b73序列同源性均在98％以上，则可以连入相应的原核表达载体，进行下一步实验。c：pphol载体构建与增殖酶切：用bgli和xhoi分别酶切pet32和连入pmd-19的zmphol全长cds片段。其中pet32质粒，选用omiga小量质粒提取试剂盒提取，回收符合预计大小的片段。连接：将回收产物与t4连接酶混合，连接16℃反应过夜。转入：连接产物用于后续转入大肠杆菌感受态的dh5α菌株。增殖：菌液pcr检测与增殖。d：重组蛋白phol的表达、纯化以及蛋白浓度的测定将成功构建的载体pphol转入原核表达菌株rosetta表达；选用ni-agarose作为纯化固相凝胶；bca法标定样品浓度保证每个蛋白样品的浓度在1.5-2.5ng/μl。步骤2)造粉体裂解液的制备选取10-14dap的b73玉米胚乳籽粒作为材料，取材后6hrs内处理，制备造粉体裂解液，-80℃保存备用。步骤3)蛋白特异分解将步骤2)造粉体裂解液和步骤1)中的纯化后的蛋白充分混合后，按照设定的温度梯度(37、43℃)孵育30min，反应结束后加入5×loadingbuffer终止反应，并沸水浴5min。步骤4)检测样品用于特异抗体anti-1、anti-2和标签抗体anti-s-protein抗体免疫印迹检测。在本发明的实施例中，所述的cdna的制备中去除rna中可能存在的基因组dna的具体步骤如下：按照如下反应体系配制反应混合物。反应混合物配制完成后，按照如上反应程序进行去基因组dna反应：42℃2min，4℃保存。在本发明的实施例中，所述的cdna在去除基因组dna结束后，将反应产物立即冰浴，并按照如下反应体系配制反转录反应体系：反转录反应程序如下：37℃20min，85℃5sec，4℃保存。在本发明的实施例中，cdna的扩增步骤为，选取已经成功全基因组测序的b7320dap的籽粒cdna作为模板，参考报道的玉米zmphol的(genebank登陆号为：eu857640)全长cds，设计引物，扩增phol的cds，所用引物如下：sp-f:5’gcatgcgcgaagtctcccgttgctc3’；sp-r:5’ggatcctggtcgtcgccattgctg3’，划线部分分别为bgli和xhoi酶切位点。在本发明的实施例中，大肠杆菌感受态细胞dh5α的制备步骤如下：取-70℃保存的dh5α菌液于冰上解冻，超净台中用接种针蘸取菌液，于无抗性lb固体平板上划线，37℃倒置培养18h后，有乳白色克隆长出；挑取单克隆于1000μllb液体培养基中，于1.5mlep管中200rpm37℃培养10hrs，全部接种于200mllb液体培养基中，200rpm37℃培养至od260值达到0.3～0.5后，冰上静置30min；超净工作台中将菌液分装于4支50ml离心管中，4000rpm5min离心，弃上清；超净工作台中加入10ml20mmnacl，重悬，4000rpm5min离心，弃上清；超净工作台中加入5ml50mmcacl2+20％甘油，重悬，冰上分装入1.5mlep管，每管50μl；液氮速冻5min，-70°保存。在本发明的实施例中，phol的载体构建中的酶切反应体系如下：37℃反应3hrs。1％琼脂糖电泳检测，回收符合预计大小的片段。在本发明的实施例中，pphol的载体构建中的连接具体操作为：将回收产物按照如下比例混合，连接16℃反应过夜。在本发明的实施例中，phol的载体构建中的转入是连接产物用于后续转入大肠杆菌dh5α菌株。按照如下步骤转入大肠杆菌感受态细胞，并做检测：将-70℃保存的感受态细胞在冰上解冻，加入重组质粒后轻柔混匀，冰浴30min；于42℃水浴中热激30sec，加入700μllb液体培养基，37℃振荡培养1h；将菌液12000rpm，15sec离心后，弃上清，保留约200μl液体，重悬菌体，涂布于lb+100mg/lamp固体培养基平板上，37℃倒置培养13～16hrs；将平板上长出的菌落用接种环刮取至加入1mllb+100mg/lamp液体培养基中，37℃振荡培养4h。在本发明的实施例中，pphol的载体构建中的将得到的菌液进行菌液pcr检测。体系如下：菌液pcr反应程序按照下表进行：在本发明的实施例中，将成功构建的载体pphol转入原核表达菌株rosetta的过程为将-70℃保存的感受态细胞在冰上解冻，加入重组质粒后轻柔混匀，冰浴30min；于42℃水浴中热激30sec，加入700μllb液体培养基，37℃振荡培养1h；将菌液12000rpm，15sec离心后，弃上清，保留约200μl液体，重悬菌体，涂布于lb+100mg/lamp固体培养基平板上，37℃倒置培养13～16hrs；挑取克隆后培养过夜，按照1:10000比例接种到一定体积的加抗lb培养基中，培养到od260/280＝0.8左右时，加入终浓度0.8mmiptg后24℃培养8hrs，吸取100μl菌液，加入5×裂解上样buffer，沸水浴8min，1000g离心10min，吸取上清液，准备点样。sds-page电泳完毕后，考马斯亮蓝染色2hrs，洗脱液洗脱过夜，白板检测条带大小以及与诱导0hour的比较积累量。有明显的、正确大小的蛋白条带出现时，然后选用对应标签的抗进行免疫印迹(immunoblotting)检测。本发明的第三个目的在于，本发明提供了一种重组蛋白phol的纯化的方法，在本发明的实施例中，重组蛋白phol的纯化操作为，选用ni-agarose作为纯化固相凝胶。本研究选用cwbiotechcat.no.cw0894a的ni-agarose纯化系统，纯化步骤按照厂家说明书进行；用300mmol/l咪唑洗脱蛋白后，用半透膜法置换蛋白缓冲液，去除咪唑以免影响后续实验结果。蛋白缓冲液的组成如下：500mmol/lnacl，50mmol/ltris-hcl，ph＝8.0；后用millipore的amicon-ultra-15超滤管(mwco10kd)对各个样品进行浓缩，用bca法标定样品浓度，保证每个蛋白样品的浓度在1.5-2.5ng/μl。重组蛋白phol的bca法标定蛋白浓度的具体做法如下：按照试剂盒说明书做适当改变，根据待测样品浓度范围，采用0-20μg的bsa标准品配制标准品浓度曲线。用试剂盒附带的bsa标准品稀释成预计的浓度组合。按照按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1)配制适量bca工作液，充分混匀；将稀释好的蛋白浓度组合依次加入bca工作液中，每份吸取20μl添加到bca工作液中即可，室温孵育30min后，在562nm测定吸光度，蛋白浓度为。经过计算，选取拟合曲线相关系数大于0.9的作为标准曲线，后续的蛋白浓度测定，根据参与测定含量的样品体积，计算出蛋白浓度。本发明的第四个目的在于，本发明提供了一种玉米造粉体裂解液的制备方法，具体操作步骤与所用试剂如下：(1)大田种植b73自交系，选取10-14dap的玉米果穗，取材后6hrs内超净工作台内剥取胚乳，放置于冰浴的玻璃培养皿中，用预冷的endospermextrabuffer(50mmol/lhepes/koh(ph＝7.5)0.8mokl/lsorbitol1mmol/lkci3mmmgci2)冰上浸泡至少30min。(2)按照100mg胚乳1mlendospermextrabuffer的比例；用一次性剃须刀横向切割胚乳至匀浆状态，用宽口吸头吸取匀浆，并用miracloth小心过滤，避免气泡的混入，重复上述过程2次，按照5:3的比例加入3％的现配iohexolwithinendospermextrabuffer，100×g离心10min；小心去除上清，沉淀富集造粉体。(3)向沉淀中加入2ml的repturingbuffer，含有100mmol/ltricine/koh1mmol/ldtt5mmol/lmgcl2phosphataseinhibitor(piercecat.no.88667)proteaseinhibitor(piercecat.no.88666usedat1tabletper10mlbuffer)并用移液器仔细重悬，避光静置至少1h，利用渗透压使造粉体破裂裂解，形成造粉体匀浆；低温高速(4℃13500×g)离心2min去除淀粉，收集上清液再低温超高速(4℃120000×g)离心15min去除细胞器膜，得到的上清液即为造粉体裂解液。(4)造粉体裂解液利用液氮速冻后，-80℃保存备用，造粉体裂解液需要保证其中的蛋白含量在1.5-2.5ng/μl之间。所述的phol的蛋白与造粉体裂解液质量用量比为1:0.5-3.5。本发明的第四个目的在于，提供了准确的检测phol方法。所述的步骤3)蛋白特异分解按照如下反应体系混合；充分混合后，按照设定的温度30-50℃(优选为37℃，43℃中的一种)孵育30min，反应结束后加入5×loadingbuffer终止反应，并沸水浴5min。在本发明的实施例中，所述的使用anti-s-protein抗体免疫印迹检测用来检测phol的自身稳定性，去除上述体系中的造粉体裂解液和atp，用水补足体积，43℃处理1-6hrs，用5×loadingbuffer终止反应，并沸水浴5min。在本发明的实施例中，所述的步骤4)的特异抗体anti-1和anti-2的抗原表位分别选取l80插入结构中两段不同序列，如图1所示。其中，anti-2的表位包含了一部分预测的pestregion，位于氨基酸残基433-448位，anti-1的抗原表位位于l80插入序列的n端氨基酸残基371-388位；这两个二抗的表位分别位于l80插入序列的n端与c端，anti-2的表位包含了一部分预测的pestregion；采用新快速抗原亲和纯化多抗(polyexpresstm)服务(金斯瑞合成多肽抗原，兔)合成图1中所示的抗原序列偶联至klh蛋白上，抗体生成出后由厂家通过elisa报告，检测到符合预测大小的抗原蛋白即可。与现有技术相比，本发明的优势在于：(1)通过本发明制备的造粉体裂解液与适量的phol蛋白反应，最终的检测结果较好原核表达纯化的phol能够不受玉米生育期的限制。比较直接从胚乳中提取phol蛋白，再检测翻译后修饰、特异性分解，具有操作简便易行的特点。(2)利用特异抗体anti-1和anti-2以及标签抗体anti-s-protein抗体免疫印迹检测，更能准确的完成对玉米中的phol的定性和定量的检测。(3)一般研究玉米phol的翻译后修饰需从胚乳中直接分离提取phol，得到的phol往往已经发生了翻译后修饰，比如已经磷酸化、与其他蛋白、多糖形成复合体、已经发生了特异分解等。为了单独研究phol特异降解与l80插入结构、430、431位氨基酸是否存在关系，本专利设计了一种特殊的实验方法，能够体外模拟玉米胚乳造粉体内部环境，研究phol的特异分解过程。附图说明图1anti-1anti-2抗原表位示意图l80与pestsite均用线框标注，anti-1和anti-2的抗原表位具体如图所示。图2玉米phol重组蛋白的纯化第1泳道为诱导后的菌体裂解后离心上清液，第2泳道为过柱流穿液，第3泳道为洗涤液，第4泳道为用150mm咪唑洗脱结果，第5泳道为用300mm咪唑洗脱结果，第6泳道为用400mm咪唑洗脱结果，第7泳道为用500mm咪唑洗脱结果，黑色框内红色箭头指示为符合分子量预测的纯化后phol条带。图3anti-1anti-2检测纯化后phol的免疫印迹结果a为anti-1检测结果，b为anti-2检测结果。泳道1：为免疫血清按照1：1000的比例稀释，泳道1：过柱流穿液，加入与phol全长蛋白同等量的原核表达蛋白l80多肽片段；泳道2中为加入与phol全长蛋白同等量的原核表达蛋白l80多肽片段；泳道3：纯化后抗体以5μg/ml的比例稀释。图4phol和phom体外降解后用不同一抗做免疫印迹的结果红色箭头标记的是100kda的phol降解带，phom未检测到降解。图5特异抗anti-1和anti-2分别检测phol-as和phol-sa的降解产物红色箭头指示100kda的降解带，phol-sa具有降解带。图6抗s-protin的特异一抗检测phol自身稳定性实验从左至右为不同的处理时长的产物，phol处理于缺少atp与造粉体裂解液的反应体系中，处理时间从1小时到6小时，此处的wb选用s-protein抗体。具体实施例本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。以下实施方式所需试剂无特殊说明均可来自商业途径(市售可得)。实施例1：大肠杆菌感受态细胞制备取-70℃保存的dh5α菌液于冰上解冻，超净台中用接种针蘸取菌液，于无抗性lb固体平板上划线，37℃倒置培养18h后，有乳白色克隆长出；挑取单克隆于1000μllb液体培养基中，于1.5mlep管中200rpm37℃培养10hrs，全部接种于200mllb液体培养基中，200rpm37℃培养至od260值达到0.3～0.5后，冰上静置30min；超净工作台中将菌液分装于4支50ml离心管中，4000rpm5min离心，弃上清；超净工作台中加入10ml20mmnacl，重悬，4000rpm5min离心，弃上清；超净工作台中加入5ml50mmcacl2+20％甘油，重悬，冰上分装入1.5mlep管，每管50μl；液氮速冻5min，-70°保存。实施例2：原核表达蛋白的表达与纯化a：玉米籽粒rna的提取①、本实验选用玉米骨干自交系b73，于授粉后20d(dap20)收获玉米果穗，超净工作台中，用75％的医用酒精充分消毒果穗，用高温高压灭菌消毒的手术刀和镊子剥取籽粒，于无菌的10ml冻存管中，每管10粒籽粒，迅速用液氮速冻，并放于-80℃冰箱保存。②、取150-200mg籽粒于rnase处理过的液氮预冷的研钵中，加液氮迅速研磨成粉；迅速将约100mg粉末转移至预冷的1.5ml离心管中，并迅速加入1ml预冷的trizol，立即上下颠倒混合，并用涡旋仪快速混合；冰浴10-15min后，加入预冷的200ml氯仿并上下颠倒混合；冰浴5-10min后，4℃，1200rpm/min离心10-15min；小心吸取上清与1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿，上下颠倒混合，室温放置10min，4℃10000rpm/min离心10min；小心吸取上清与1.5ml离心管中，加入登体积预冷的异丙醇(液相色谱级)，上下剧烈颠倒混合，室温静置10min；4℃10000rpm/min离心10min；弃上清，加入1ml75％乙醇，于4℃10000rpm/min离心5min，重复此步骤2次；弃上清，加入1ml无水乙醇(液相色谱级)，于4℃10000rpm/min离心5min；弃上清，真空冷冻干燥乙醇，约10min；加入50-100ul无rnase的ddh2o，充分溶解，用紫外分光光度计测定籽粒rna的质量，a260/a280＝1.6～1.8。b：phol的cdna的制备和扩增制备：(1)首先去除rna中可能存在的基因组dna，按照如下反应体系配制反应混合物。反应混合物配制完成后，按照如上反应程序进行去基因组dna反应：42℃2min，4℃保存。(2)所述的cdna在去除基因组dna结束后，将反应产物立即冰浴，并按照如下反应体系配制反转录反应体系：反转录反应程序如下：37℃20min，85℃5sec，4℃保存。(3)cdna的合成，具体做法是使用takara公司的反转录试剂盒制备cdna第一链，根据takara公司的反转录试剂盒(no.drr047s)的操作说明书。扩增：扩增phol全长cds的pcr体系如下：所用引物如下：sp-f:5’gcatgcgcgaagtctcccgttgctc3’；sp-r:5’ggatcctggtcgtcgccattgctg3’，划线部分分别为bgli和xhoi酶切位点。扩增phol全长cds的pcr反应程序如下：回收：反应结束后，向pcr反应产物中添加5×pcrloadingbuffer，1％琼脂糖凝胶电泳检测，并回收大小正确且单一的条带。采用axygene琼脂糖凝胶回收试剂盒回收片段。检测：回收片段连入pmd-19载体进行测序，与genebank公布的b73序列同源性均在98％以上，则可以连入相应的原核表达载体，进行下一步实验。c：pphol载体构建与增殖酶切：用bgli和xhoi分别酶切pet32和连入pmd-19的zmphol全长cds片段。其中pet32质粒，选用omiga小量质粒提取试剂盒提取，pphol的载体构建中的酶切反应体系如下：37℃反应3hrs。1％琼脂糖电泳检测，回收符合预计大小的片段。连接：pphol的载体构建中的连接具体操作为：将回收产物按照如下比例混合，连接16℃反应过夜。转入：pphol的载体构建中的转入是连接产物用于后续转入实施例1的大肠杆菌dh5α菌株。增殖：菌液pcr检测和增殖，具体如下：pphol的载体构建中的将得到的菌液进行菌液pcr检测。体系如下：菌液pcr反应程序按照下表进行：d：重组蛋白phol的纯化以及蛋白浓度的测定(1)重组蛋白phol的纯化：选用ni-agarose作为纯化固相凝胶。本研究选用cwbiotechcat.no.cw0894a的ni-agarose纯化系统，纯化步骤按照厂家说明书进行；用500mmol/l咪唑洗脱蛋白后，用半透膜法置换蛋白缓冲液，去除咪唑以免影响后续实验结果。蛋白缓冲液的组成如下：500mmol/lnacl，50mmol/ltris-hcl，ph＝8.0；后用millipore的amicon-ultra-15超滤管(mwco10kd)对各个样品进行浓缩，用bca法标定样品浓度，保证每个蛋白样品的浓度在1.5-2.5ng/μl。(2)重组蛋白phol的bca法标定蛋白浓度：按照试剂盒说明书做适当改变，根据待测样品浓度范围，采用0-20μg的bsa标准品配制标准品浓度曲线。用试剂盒附带的bsa标准品稀释成预计的浓度组合。按照按50体积bca试剂a加1体积bca试剂b(50:1)配制适量bca工作液，充分混匀；将稀释好的蛋白浓度组合依次加入bca工作液中，每份吸取20μl添加到bca工作液中即可，室温孵育30min后，在562nm测定吸光度。经过计算，选取拟合曲线相关系数大于0.9的作为标准曲线，后续的蛋白浓度测定，根据参与测定含量的样品体积，即可计算出蛋白浓度(μg/μl)。将成功构建的载体pphol转入原核表达菌株rosetta；选用ni-agarose作为纯化固相凝胶；bca法标定样品浓度保证每个蛋白样品的浓度在1.5-2.5ng/μl。实施例2：造粉体裂解液的制备大田种植b73自交系，选取10-14dap的玉米果穗，取材后6hrs内超净工作台内剥取胚乳，放置于冰浴的玻璃培养皿中，用预冷的endospermextrabuffer(50mmol/lhepes/koh(ph＝7.5)0.8mol/lsorbitol1mmol/lkci3mmmgci2)冰上浸泡至少30min，按照100mg胚乳1mlendospermextrabuffer的比例；用一次性剃须刀横向切割胚乳至匀浆状态，用宽口吸头吸取匀浆，并用miracloth小心过滤，避免气泡的混入，重复上述过程2次，按照5:3的比例加入3％的现配iohexolwithinendospermextrabuffer，100×g离心10min；小心去除上清，沉淀富集造粉体，当在沉淀的顶端观察到黄色的指环型结构，说明提取到大量完整的造粉体，如果沉淀全部是白色的，说明造粉体被严重破坏，造粉体中的酶类基本释放到上清中了；向沉淀中加入2ml的repturingbuffer，含有100mmol/ltricine/koh1mmol/ldtt5mmol/lmgcl2phosphataseinhibitor(piercecat.no.88667)proteaseinhibitor(piercecat.no.88666usedat1tabletper10mlbuffer)并用移液器仔细重悬，避光静置至少1h，利用渗透压使造粉体破裂裂解，形成造粉体匀浆；低温高速(4℃13500×g)离心2min去除淀粉，收集上清液再低温超高速(4℃120000×g)离心15min去除细胞器膜，得到的上清液即为造粉体裂解液，液氮速冻后，-80℃保存备用，造粉体裂解液需要保证其中的蛋白含量在1.0-1.5μg/μl之间。实施例4：蛋白特异分解蛋白特异分解按照如下反应体系混合；充分混合后，按照设定的温度30-50℃(优选为37℃，43℃中的一种)孵育30min，反应结束后加入5×loadingbuffer终止反应，并沸水浴5min。实施例5：anti-s-protein抗体免疫印迹检测用来检测phol的自身稳定性去除上述体系中的造粉体裂解液和atp，用水补足体积，43℃处理1-6hrs，用5×loadingbuffer终止反应，并沸水浴5min，wb选用anti-s-protein作为一抗。在附图6中可以看出，1-6h内phol的稳定性均较好，可以进一步试验。实施例6：特异抗体anti-1、anti-2免疫印迹检测。anti-1和anti-2的抗原表位分别选取l80插入结构中两段不同序列。其中，anti-2的表位包含了一部分预测的pestregion，位于氨基酸残基433-448位，anti-1的抗原表位位于l80插入序列的n端氨基酸残基371-388位；这两个二抗的表位分别位于l80插入序列的n端与c端，anti-2的表位包含了一部分预测的pestregion；采用新快速抗原亲和纯化多抗(polyexpresstm)服务(金斯瑞合成多肽抗原，兔)合成附图1中所示的抗原序列偶联至klh蛋白上，抗体生成出后由厂家通过elisa报告，检测到符合预测大小的抗原蛋白。对纯化后的phol进行免疫印迹结果实验，具体见附图3。实施例7：phol、phom体外降解后用不同一抗做免疫印迹检测结合实施例4和实施例5的操作方法，为了比较l80插入序列对于phol分解的影响，在温度37℃和43℃下，将phol、phom以及等体积的水，在设置温度25-37℃的条件下处理30min后，添加适量的5×loadingbuffer终止反应并迅速沸水灭活，sds-page电泳后，wb转膜，分别用多抗anti-1和anti-2检测，得到结果如附图4a所示。phom是缺失了l80的片段，用s-protein-tag作为免疫印迹检测蛋白，anti-s-protein检测同等反应条件下的phom样品，发现在37℃和43℃处理下，没有明显的变化，anti-1和anti-2均不能检测到phom，如图附图4b所示。实施例8：特异抗anti-1和anti-2分别检测phol-as和phol-sa的降解产物结合实施例4和实施例5的操作方法，为了研究ser430、ser431两个残基对于atp存在下phol稳定性的影响，纯化后phol-as和phol-sa进行37、43℃的处理，对上清液用anti-1和anti-2做免疫印迹检测；ser430、ser431位的两个ser残基突变为ala对于phol的atp存在下的体外降解反应的影响相近。具体结果见附图5。序列表<120>玉米phol特异蛋白及特异分解的鉴定方法<160>4<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2550<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1atgaatgtaaaacaagcatattacctgtccatggagtttttacagggaagggctctcaca60aatgctattggcaatctagagattaccggtgaatatgcagaagcattaaaacaacttgga120caaaacctggaggatgtcgctagccaggaaccagatgctgccctgggcaatggtggttta180ggccgcctggcttcttgttttttggattctttagcaacattaaattatccagcatgggga240tatggacttcgctatgaatatggcctctttaagcagatcataacaaaggatggtcaggag300gagattgctgagaattggcttgagatgggatatccttgggaggttgtaagaaatgatgtc360tcttatcctgtgaaattctatggtaaagtggtggaaggcactgatggtaggaagcactgg420attggaggagaaaatatcaaggctgtggcacatgatgtccctattcctggctacaaaact480agaactaccaataatctgcgtctttggtcaacaactgtaccagcacaagattttgacttg540gcagcttttaattctggagatcataccaaggcatatgaagctcatctaaacgctaaaaag600atatgccacatattgtatcctggggatgaatcactagaggggaaagttctccgcttgaag660caacaatatacattgtgttcagcctcactacaggacatcattgctcgttttgagagtaga720gctggcgagtctctcaactgggaggacttcccctccaaagttgcagtgcagatgaatgac780actcatccaacactatgcattcctgagttaatgagaatactgatggatgttaagggatta840agctggagtgaggcatggagtattacagaaagaaccgtggcatacactaaccatacagtg900cttcctgaagctctagagaagtggagcttggacataatgcagaaacttttacctcgacat960gttgagataatagaaacaattgatgaagagctgataaacaacatagtctcaaagtatgga1020accacagatactgaactgttgaaaaagaagctgaaagagatgaggattctggataatgtt1080gaccttccagcttccatttcccaactatttgttaaacccaaagacaaaaaggaatctcct1140gctaaatcaaagcaaaagttacttgttaaatctttggagactattgttgatgttgaggag1200aaaactgagttggaagaggaggcggaggttctatcagagatagaggaggaaaaacttgaa1260tctgaagaagtagaggcagaagaagagagttctgaggatgagttagatccatttgtaaag1320tctgatcctaagttaccaagagttgtccgaatggcaaacctctgtgttgttggtgggcat1380tcagtaaatggtgtagctgaaattcacagtgaaattgtgaaacaggatgtgttcaacagc1440ttctatgagatgtggccaactaaatttcagaataaaacaaatggagtgactcccaggcgt1500tggatccggttttgtaatcctgcattaagtgcattaatttcaaagtggattggttctgat1560gactgggtgcttaatacagacaaactggcagaactgaagaagtttgctgataatgaagat1620ctgcattcagagtggcgtgctgctaagaaggctaacaaaatgaaggttgtttctcttata1680agggagaagacaggatatattgtcagtccagatgcaatgtttgatgtgcaggtgaaaagg1740atacatgaatataagcggcagctgctaaatatccttggaattgtctaccgctacaagaag1800atgaaagaaatgagcacagaagaaagagcaaagagctttgttccaagggtatgcatattc1860ggtgggaaagcatttgccacatatatacaggcaaaaaggatcgttaaatttattacagat1920gtggcagctaccgtgaaccatgattcagacattggagatttgttgaaggtcgtatttgtt1980ccagactataatgttagtgttgccgaggcactaattcctgccagtgaattgtcacagcat2040atcagtactgctggaatggaagctagtgggaccagtaacatgaagtttgcaatgaacggt2100tgcattcttattggaactttagatggtgcaaatgtggagatcagagaggaggttggagaa2160gaaaactttttcctttttggtgcagaggcacatgaaattgctggtttgcggaaagaaaga2220gccgagggaaagtttgtgcctgacccaagatttgaggaggttaaggaatttgtccgcagt2280ggtgtctttgggacttacagctatgatgaattgatgggttctttggaaggaaatgaaggt2340tacggacgtgcagattatttccttgttggcaaggacttccccagctatattgaatgccaa2400gaaaaagttgatgaggcgtaccgagatcagaagttatggacaaggatgtctatcctcaac2460acggctggctcatccaagttcagcagcgataggacgattcatgagtacgccaaggatatc2520tgggatatcagccctgccatccttccctag2550<210>2<211>2329<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2atgaatgtaaaacaagcatattacctgtccatggagtttttacagggaagggctctcaca60aatgctattggcaatctagagattaccggtgaatatgcagaagcattaaaacaacttgga120caaaacctggaggatgtcgctagccaggaaccagatgctgccctgggcaatggtggttta180ggccgcctggcttcttgttttttggattctttagcaacattaaattatccagcatgggga240tatggacttcgctatgaatatggcctctttaagcagatcataacaaaggatggtcaggag300gagattgctgagaattggcttgagatgggatatccttgggaggttgtaagaaatgatgtc360tcttatcctgtgaaattctatggtaaagtggtggaaggcactgatggtaggaagcactgg420attggaggagaaaatatcaaggctgtggcacatgatgtccctattcctggctacaaaact480agaactaccaataatctgcgtctttggtcaacaactgtaccagcacaagattttgacttg540gcagcttttaattctggagatcataccaaggcatatgaagctcatctaaacgctaaaaag600atatgccacatattgtatcctggggatgaatcactagaggggaaagttctccgcttgaag660caacaatatacattgtgttcagcctcactacaggacatcattgctcgttttgagagtaga720gctggcgagtctctcaactgggaggacttcccctccaaagttgcagtgcagatgaatgac780actcatccaacactatgcattcctgagttaatgagaatactgatggatgttaagggatta840agctggagtgaggcatggagtattacagaaagaaccgtggcatacactaaccatacagtg900cttcctgaagctctagagaagtggagcttggacataatgcagaaacttttacctcgacat960gttgagataatagaaacaattgatgaagagctgataaacaacatagtctcaaagtatgga1020accacagatactgaactgttgaaaaagaagctgaaagagatgaggattctggatggatga1080gttagatccatttgtaaagtctgatcctaagttaccaagagttgtccgaatggcaaacct1140ctgtgttgttggtgggcattcagtaaatggtgtagctgaaattcacagtgaaattgtgaa1200acaggatgtgttcaacagcttctatgagatgtggccaactaaatttcagaataaaacaaa1260tggagtgactcccaggcgttggatccggttttgtaatcctgcattaagtgcattaatttc1320aaagtggattggttctgatgactgggtgcttaatacagacaaactggcagaactgaagaa1380gtttgctgataatgaagatctgcattcagagtggcgtgctgctaagaaggctaacaaaat1440gaaggttgtttctcttataagggagaagacaggatatattgtcagtccagatgcaatgtt1500tgatgtgcaggtgaaaaggatacatgaatataagcggcagctgctaaatatccttggaat1560tgtctaccgctacaagaagatgaaagaaatgagcacagaagaaagagcaaagagctttgt1620tccaagggtatgcatattcggtgggaaagcatttgccacatatatacaggcaaaaaggat1680cgttaaatttattacagatgtggcagctaccgtgaaccatgattcagacattggagattt1740gttgaaggtcgtatttgttccagactataatgttagtgttgccgaggcactaattcctgc1800cagtgaattgtcacagcatatcagtactgctggaatggaagctagtgggaccagtaacat1860gaagtttgcaatgaacggttgcattcttattggaactttagatggtgcaaatgtggagat1920cagagaggaggttggagaagaaaactttttcctttttggtgcagaggcacatgaaattgc1980tggtttgcggaaagaaagagccgagggaaagtttgtgcctgacccaagatttgaggaggt2040taaggaatttgtccgcagtggtgtctttgggacttacagctatgatgaattgatgggttc2100tttggaaggaaatgaaggttacggacgtgcagattatttccttgttggcaaggacttccc2160cagctatattgaatgccaagaaaaagttgatgaggcgtaccgagatcagaagttatggac2220aaggatgtctatcctcaacacggctggctcatccaagttcagcagcgataggacgattca2280tgagtacgccaaggatatctgggatatcagccctgccatccttccctag2329<210>3<211>2550<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3atgaatgtaaaacaagcatattacctgtccatggagtttttacagggaagggctctcaca60aatgctattggcaatctagaga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