一种叶底红CHS全长基因的克隆方法与流程

本发明属于花卉生物技术领域，具体涉及一种叶底红chs全长基因的克隆方法。

背景技术：

叶底红(phyllagathisfordii(hance)c.chen)为野牡丹科金锦香属常绿直立亚灌木草本植物，植株低矮小巧，叶片下面及花瓣均呈紫红色，植株密披红棕色柔毛和长腺毛，形态优美，色泽艳丽，是盆栽的佳品(蔡坤秀等2010)。但作为观赏类植物，其花色单一，使得观赏效果和商品价值都受到一定限制，随着叶底红脱毒种苗快速繁殖技术的成功，利用基因工程技术进行花色改良指日可待。chs是花色素合成的关键酶，chs在植物中的表达量可能影响花的颜色。因此本研究拟克隆得到叶底红的chs基因全长，通过分析其结构和功能预测为今后靶标花色改良提供参考。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种叶底红chs全长基因的克隆方法。

本发明的技术方案如下：

一种叶底红chs全长基因的克隆方法，包括如下步骤：

(1)通过正向扩增引物chs-f96和反向扩增引物chs-r908，对提取的叶底红叶片总dna进行pcr扩增，获得扩增产物，其中，正向扩增引物chs-f96和反向扩增引物chs-r908分别如seqidno01和seqidno02所示；

(2)将上述扩增产物经纯化后连接至pmd19-t上，通过测序获得叶底红chs片段；

(3)根据上述叶底红chs片段，采用genomewalking试剂盒对上述叶底红chs片段扩增全长，所用引物为sp1、sp2、sp3和ap1，其中sp1、sp2和sp3的序列依次如seqidno03～05所示，ap1为genomewalking试剂盒自带的兼并引物；

(4)将步骤(3)所得的产物转化至大肠杆菌dh5α中，阳性克隆子经测序得到完整的叶底红chs全长基因。

在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)为：以0.1μg步骤(2)所得的叶底红chs片段为模板，ap1和sp1分别为上下游引物进行第一次pcr反应，获得第一反应产物；将第一反应产物稀释1000倍后，取1μl作为模板，ap1和sp2分别为上下游引物进行第二次pcr反应，获得第二反应产物；将第二反应产物稀释1000倍后，取1μl作为模板，ap1和sp3分别为上下游引物进行第三次pcr反应，获得第三反应产物；将第三反应产物进行凝胶电泳，切胶回收目的条带，即得步骤(3)所得的产物；上述genomewalking试剂盒提供ap1、ap2、ap3和ap4与特异性引物sp(系列)间利用退火温度的差异进行热不对称pcr反应，通过三次巢式pcr反应即可获得已知序列的侧翼序列。若使用ap1进行第一步实验，则后续步骤均需使用ap1。此外，若使用ap1引物未能得到理想结果，则需使用ap2、ap3或ap4进行反应，理论上至少会有一种以上的ap引物能够得到理想结果。

进一步优选的，所述第一次pcr反应的退火温度为65℃。

进一步优选的，所述第二次pcr反应的退火温度为65℃。

进一步优选的，所述第三次pcr反应的退火温度为65℃。

本发明的有益效果是：本发明可以完整克隆叶底红chs全长基因，为后期花色改良奠定基础。

附图说明

图1为本发明实施例中chs片段的pcr扩增结果。

具体实施方式

以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。

实施例1

(1)通过正向扩增引物chs-f96和反向扩增引物chs-r908，对提取的叶底红叶片总dna进行pcr扩增，获得扩增产物(图1所示，900bp左右的片段)，其中，正向扩增引物chs-f96和反向扩增引物chs-r908分别如seqidno01和seqidno02所示；pcr反应的体系组成为2.5ul10×pcrbuffer(含mg²⁺)，2.5mmdntp2ul，chs-f96/r908(均为10mm)各1ul，extaq0.5u，dna50ng，用ddh2o补足至25ul。反应程序为94℃2min；94℃30s，55℃1min，72℃1min，共35个循环；72℃最后延伸10min。

(2)将上述扩增产物经纯化后连接至pmd20-t上(若pcr扩增产物为单一条带可直接进行连接)，通过测序获得叶底红chs片段；采用takaramightyta-cloningkit(codeno.6028)，将1ulpmd20-tvector和4ulpcr产物加入新的microtube，混匀，加入5ulligationmightymix，轻轻混匀后于16℃反应30min。全量加入100ul感受态细胞中进行转化，并涂布于含有amp的lb培养基平板上，37℃培养过夜。次日，挑取长出的单克隆，采用菌液pcr方法进行验证，反应体系和程序与前面一致。选取验证正确的克隆子送上海生工生物工程有限公司进行测序，获得chs片段的序列。

(3)根据上述叶底红chs片段，采用购自takara公司的genomewalking试剂盒(codeno.6108)对上述叶底红chs片段扩增两侧侧翼序列，所用引物为sp1、sp2、sp3和ap1，其中，sp1、sp2和sp3的序列依次如seqidno03～05所示；具体为：以0.1μg步骤(2)所得的叶底红dna为模板，ap1(100pmol/ul)和sp1(10pmol/ul)分别为上下游引物(均加入1ul)进行第一次pcr反应，其中，dntpmix(2.5mm)8ul，10×lapcrbufferii(mg²⁺plus)5ul，lataq2.5u，总体积50ul的反应体系，经94℃1min，98℃1min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，后三步循环5次，进而再94℃30s，25℃3min，72℃2min；继而94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，重复15个循环。再最终72℃延伸10min。得到第一反应产物；

将第一次pcr反应产物稀释1000倍后，取1μl作为模板，ap1和sp2分别为上下游引物进行第二次pcr反应，获得第二反应产物；反应体系与第一次反应一致，反应程序为94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，65℃1min，72℃2min，94℃30s，44℃1min，72℃2min，重复15个循环。再最终72℃延伸10min。

将第二反应产物稀释1000倍后，取1μl作为模板，ap1和sp3分别为上下游引物进行第三次pcr反应，获得第三反应产物；pcr反应体系和程序均与第二次pcr一致。将三次反应产物进行凝胶电泳，切胶回收目的条带，即得步骤(3)所得的产物(以sp3引物进行测序验证)；所述第一至第三次pcr反应的退火温度均为65℃

(4)将步骤(3)所得的产物转化至大肠杆菌dh5α中，阳性克隆子经测序得到完整的叶底红chs全长基因。连接转化采用takaramightyta-cloningkit(codeno.6028)，步骤如前。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。

序列表

<110>福建省热带作物科学研究所

<120>一种叶底红chs全长基因的克隆方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ccagagcacctaccctgact20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgagcgatccagaagaggga20

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tctcccgttgctgttatttgtctgg25

<210>4

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

accaaggacctcaccgagaacaac24

<210>5

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cctgggctcatttccaagaacatcg25