一种小立碗藓βCAs基因家族在植株生物量和耐渗透压胁迫中的应用的制作方法

本发明涉及基因技术领域，具体涉及一种小立碗藓βcas基因家族在植株生物量和耐渗透压胁迫中的应用。

背景技术：

碳酸酐酶(carbonicanhydrase,ca)是一族含锌的金属酶，含有一条卷曲的蛋白质链和一个锌离子，主要催化co2向hco3^-之间的转化反应，普遍存在于动物、植物、藻类、细菌和真菌中。植物体内所有的ca都是催化co2和hco3^-相互转化的锌金属酶，该酶在自然界中广泛存在，并且已经发现了多种在结构和序列上不同的ca家族。根据ca蛋白质结构以及序列的不同，可将植物ca分为三种类别，分别为αca、βca和γca。目前，植物中ca研究比较多的是βca，这些基因几乎在植物所有的组织中都有表达，并且βca蛋白在多种细胞成份中都能找到，已报导的比如叶绿体、线粒体、质膜和细胞质。不同物种中的βca功能和分布均不相同。藻类中βca一般分布在线粒体、叶绿体类囊体、细胞质以及壁膜间隙中。βca的组织和细胞特异性表达，表明βca的功能多样性。经过几十年的研究发现，植物βca在光合作用，碳浓缩机制，气孔运动和发育，胁迫响应，氨基酸生物合成以及固氮根瘤代谢等生理过程中具有非常重要的作用。

在c3植物叶片中，大部分ca活性部位主要位于m细胞叶绿体中。研究表明ca的意义在于包括hco3^-向co2的转化，以确保被rubisco固定的最大速率；促进co2在叶绿体膜上扩散；缓冲由光照条件变化造成的叶绿体基质中ph值的短期变化；以及参与除co2以外的化合物的水化作用。与c3植物不同，c4植物中的大多数βca活性存在于m细胞的胞质中。

ca能增加1，5-二磷酸核酮糖及磷酸烯醇式丙酮酸的羧化活性，降低rubp的加氧活性，可加速无机碳向羧化酶活性部位的扩散，通过提高羧化酶周围无机碳的浓度增加co2的固定速率。研究表明，ca能够通过识别环境中co2浓度调节自身活性来维持光合速率的相对稳定。植物处在某些胁迫环境，如土壤盐度增加、大气的湿度下降等，使得植物体内水分亏缺，导致气孔开度减小，造成叶肉细胞的co2浓度低于正常水平，影响光合作用的正常进行，在这种情况下，ca的调节功能就可能发挥更为重要的作用。因此，ca活性受底物诱导，是适应胁迫条件的光合碳代谢调节酶，在保持光合碳代谢稳定方面具有重要功能。

目前并没有关于βca与植物登陆过程中耐脱水等能力关系的研究报道。

技术实现要素：

为了克服上述现有技术中的不足之处，本发明的目的是提供一种小立碗藓βcas基因家族在植株生物量和耐渗透压胁迫中的应用。

为了实现上述技术目的，本发明采用的技术方案的如下：本发明的一种小立碗藓βcas基因家族在植株生物量和耐渗透压胁迫中的应用。

进一步地，使用1mm、5mm、10mm、20mm不同浓度的nahco3处理21天的小立碗藓野生型材料连续7天，5mm浓度的nahco3既能增强植物的βca酶活，又较低的损伤c/n平衡和光合效率。

更进一步地，小立碗藓βca基因家族6个突变体，在每一个突变体中分别检测其它5个βca基因表达量，当一个βca基因突变后，其它βca基因表达量明显增加。

进一步地，通过对比所述βca基因家族在小立碗藓不同组织中的表达模式，对βca基因缺失突变体进行分子鉴定，检测其基因表达量变化及耐渗透压性状，ppβca1、ppβca2和ppβca5突变体与野生型相比，在正常培养条件生长较慢，耐渗透压胁迫能力下降；ppβca3、ppβca4和ppβca6突变体与野生型相比，在正常培养条件生长较快，耐渗透压胁迫能力增强。

有益效果：本发明的研究重点主要关注小立碗藓βca在脱水等环境适应及发育过程中的作用并探讨其在植物进化上的意义。

本发明的小立碗藓βca基因家族6个突变体碳含量、氮含量和碳氮比(图2abc)，推测可能存在其它βca基因的补偿效应，为了进一步验证，在每一个突变体中分别检测其它5个βca基因表达量(图2defghi)，结果显示，当一个βca基因突变后，其它βca基因表达量明显增加。在小立碗藓中的研究将有助于我们对βca在植物发育和进化的分子基础的理解。

本发明通过反向遗传学去探索和解决植物生理学和发育生物学中的各种关键问题，在本发明实施例中，通过对比所述βca基因家族在小立碗藓不同组织中的表达模式，对βca基因缺失突变体进行分子鉴定，检测其基因表达量变化及耐渗透压性状等，发现ppβca1、ppβca2和ppβca5突变体与野生型相比，在正常培养条件生长较慢，耐渗透压胁迫能力下降；ppβca3、ppβca4和ppβca6突变体与野生型相比，在正常培养条件生长较快，耐渗透压胁迫能力增强(图3)。

附图说明

为了易于说明，本发明由下述的具体实施例及附图作以详细描述；

图1为所述βca基因在碳酸氢钠处理下调节小立碗藓生长结果图；

图2为本发明βca突变体同源基因表达分析结果图；

图3为本发明βca突变体渗透压胁迫后恢复情况结果图；

图4为本发明小立碗藓βca基因敲除示意图；

图5为本发明βca组织表达谱分析结果图。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明。应该理解的是，这些实施例是本发明的阐释和举例，并不以任何形式限制本发明的范围。

如图1至图5所示，本发明的一种小立碗藓βcas基因家族在植株生物量和耐渗透压胁迫中的应用。

所述的小立碗藓βca基因家族翻译后的氨基酸序列如no.1所示。

使用1mm、5mm、10mm、20mm不同浓度的nahco3处理21天的小立碗藓野生型材料连续7天，5mm浓度的nahco3既能增强植物的βca酶活，又较低的损伤c/n平衡和光合效率。

小立碗藓βca基因家族6个突变体，在每一个突变体中分别检测其它5个βca基因表达量，当一个βca基因突变后，其它βca基因表达量明显增加。

通过对比所述βca基因家族在小立碗藓不同组织中的表达模式，对βca基因缺失突变体进行分子鉴定，检测其基因表达量变化及耐渗透压性状，ppβca1、ppβca2和ppβca5突变体与野生型相比，在正常培养条件生长较慢，耐渗透压胁迫能力下降；ppβca3、ppβca4和ppβca6突变体与野生型相比，在正常培养条件生长较快，耐渗透压胁迫能力增强。

实施例1

在植物基因组数据库中(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)通过已报道的豆科βca蛋白序列进行blastp比对并下载小立碗藓中的同源βca蛋白和基因序列，通过在线结构域分析工具smart(http://smart.embl.de/)和interproscan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)对获得的候选基因进行保守结构域鉴定，其转录翻译后的蛋白质具有三个结构域，分别为位于n端的autophagy_ndomain，位于中间的autophagy_act_cdomain，以及位于c端的autophagy_cdomain。可将其作为候选基因，小立碗藓6个βca基因的编号分别为pp3c7_14450、pp3c2_15140、pp3c16_19250、pp3c20_18640、pp3c1_19190和pp3c24_9430。

实施例2

小立碗藓βca基因家族的表达

将小立碗藓βcas基因家族输入在线分析网站http://bar.utoronto.ca/efp_physcomitrella/cgi-bin/efpweb.cgi，获得βcas基因家族在小立碗藓不同组织中的表达量情况，包括原生质体、绿丝体、轴丝体、配子体、颈卵器、孢子体s1、孢子体s2、孢子体s3、孢子体m、孢子和假根。表达量测定结果如图5所示，在多组织中均有表达。

实施例3

小立碗藓瞬时表达与稳定转化

使用bcd培养基培养苔藓，从培养5～6天的原丝体材料打磨继代后于16h光照/8h黑暗的光周期，500μmol·m^-2·s^-1的光照强度，25℃条件下培养。

peg介导的小立碗藓转化：利用终浓度为2％的崩溃酶(用8％mannitol溶液配制)将生长一周小立碗藓原丝体材料在25℃进行裂解约30min，用8％的mannitol溶液洗涤原生质体3次，溶解于3m溶液(含910mgmannitol、0.15ml的1mmgcl2、1ml的1％mes(ph5.6)，8.85mlh2o)，为制备完成的原生质体溶液；

取20μg带同源重组臂的线性化目的片段于热激管中，加入300μl制备完成的原生质体溶液和300μl的40％的peg(w/v)(用含1ml1mca(no3)2、100μl1mtris-hcl(ph8.0)及9ml8％(w/v)mannitol的溶液配制)，混匀，采用45℃热激5min，20℃10min进行热激处理；再用300μl、600μl、1ml、2ml的8％mannitol梯度复苏热激后产物，低速离心后弃上清，管中再加入5％agar溶液(提前溶解后在45℃温育)混匀后，铺bcd板，在25℃培养箱中培养生长；利用bcd-bcd⁺抗生素-bcd-bcd⁺抗生素(每个阶段约一周)的筛选条件进行筛选；挑取最后一次筛选后长出的配子体移植至新bcd培养基生长，鉴定。

测定结果如图4所示，βca基因家族突变示意图以及突变体dna和rna水平的鉴定情况，以图4第一个βca基因为例，p1/p2和p3/p4分别为用于扩增同源臂的引物对；p5/c1和c2/p6可用于鉴定载体上的nptii基因在小立碗藓βca基因组上是否正确插入而导致靶向突变；ubiquitin用于检测dna模板质量；p7/p8和c3/c4分别为用于鉴定βca转录本缺失和nptiicassette插入的引物对，adeprt用于检测rna模板的质量；m15，m21和m26分别为转化后获得的阳性突变株系。其它βcas基因与第一个βca基因位置对应。

实施例4

βca基因家族基因功能互补性

本发明使用不同浓度的nahco3(1mm、5mm、10mm、20mm)处理21天的小立碗藓野生型材料连续7天，水作为对照处理，如图1所示。经过nahco3处理的材料不仅βcas酶活显著提高，鲜重和干重都较对照组高。然而，低或高浓度nahco3都会影响植株的c/n平衡和光合效率。表达谱分析发现，20mmnahco3处理后所有的βca基因表达都受到抑制。六个βca基因在5mm和10mmnahco3处理下表达量显著增高。综合考虑，5mm浓度的nahco3处理较为合适，既能增强植物的βca酶活，又较低的损伤c/n平衡和光合效率。检测6个基因的单基因突变体植株，发现当某一基因发生突变，其它5个基因相对表达量明显提高，表明小立碗藓βca基因家族6个基因对培养基中hco3^-吸收利用存在相互补偿效应。

实施例5

叶绿素荧光观察

用imaging-pamfluorimager和imagingwin软件测量植物的叶绿素荧光参数。在测量fv/fm之前，植物应暗适应最少30min。观察结果如图3所示，其中a为野生型和βca突变体材料在正常培养条件下随着培养时间的表型观察情况，发现ppβca1、ppβca2和ppβca5突变体与野生型相比出现了拟茎和拟叶发黄的症状，表现了提前衰老的表型性状；ppβca3、ppβca4和ppβca6突变体与野生型相比生长旺盛(图3)。b为对应a中材料的潜在最大光合效率fv/fm图像。bar＝4mm。

实施例6

突变体耐渗透压分析

利用在线网站http://moss.nibb.ac.jp/protocol.html中的bcd培养基在恒温光照培养箱中进行培养(16h光照/8h黑暗的光周期，500μmol·m^-2·s^-1的光照强度，25℃)，在正常bcd培养基中添加终浓度0.9mnannitol进行渗透压胁迫实验，实验结果如图3所示，利用βca突变体和野生型正常生长14天的材料进行渗透压胁迫(nannitol，0.9m)的耐受能力测试，发现ppβca1、ppβca2和ppβca5突变体与野生型相比，在正常βca培养条件生长较慢，耐渗透压胁迫能力下降；ppβca3、ppβca4和ppβca6突变体与野生型相比，在正常培养条件生长较快，耐渗透压胁迫能力增强。

本发明提供了小立碗藓βca基因家族在植株生物量和耐渗透压胁迫中的应用，所述的小立碗藓ppβca1、ppβca2和ppβca5突变体与野生型相比，在正常βca培养条件生长较慢，耐渗透压胁迫能力下降；ppβca3、ppβca4和ppβca6突变体与野生型相比，在正常培养条件生长较快，耐渗透压胁迫能力增强。可用于小立碗藓在植株生物量和耐渗透压胁迫性状方面的研究。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。