一种微流控芯片的制作方法

本实用新型涉及一种芯片，具体涉及一种微流控芯片。

背景技术：

组织工程的主要挑战在于基于时空分布的细胞分化、转归、形态变化及凋亡等对器官、组织形成的影响，而微流控芯片为解决组织工程的难题提供了平台的支持。微流控技术是一项以细胞或组织为对象的微操作技术，它具有自身体积微小，便于集成，并具有高通量的分析能力的特点，能提供一个稳定的，局部的，可复制的分子浓度梯度微环境。而细胞的迁移、分化很大程度上是依赖于生长因子的分布和浓度梯度的形成。

以往的研究表明，微流控芯片对于模拟器官表面环境，研究细胞代谢产物和环境之间的相互作用关系具有一定的优势。不同类型的微流控技术应用于水凝胶支架材料上，不同的水凝胶结构用来模拟细胞，组织或器官的不同功能单位。

技术实现要素：

鉴于以上所述现有技术的缺点，本实用新型的目的在于提供一种微流控芯片。

为实现上述目的及其他相关目的，本实用新型提供一种微流控芯片，该芯片包括设置于同一平面内的梯度发生层和导流槽层，所述梯度发生层中形成有浓度梯度发生微通道，该浓度梯度发生微通道包括至少两个浓度梯度入口区和多个浓度梯度出口区，所述导流槽层中形成有多个导流通道，每个所述导流通道的一端分别通过一垂直通道连与一个所述浓度梯度出口区连通；所述梯度发生层与导流槽层可拆卸连接。

可选地，该芯片还包括基层，所述梯度发生层与所述导流槽层设置于所述基层上，所述基层上设置有废液排出口，每个所述导流通道的另一端通过一垂直通道与所述废液排出口连通。

可选地，所述浓度梯度发生微通道呈圣诞树形，包括相连通的多层级结构，每级层结构分别包括多个浓度梯度通道，且自浓度梯度入口区至浓度梯度出口区方向的浓度梯度通道的数量逐级递增。

可选地，每个所述浓度梯度通道分别曲线延伸。

可选地，所述浓度梯度发生微通道设置于所述梯度发生层的上表面，多个所述导流通道设置于导流槽层的下表面。

可选地，所述基层的材质为pmma。

可选地，所述梯度发生层和导流槽层的材质为pdms。

可选地，该芯片还包括顶层，所述梯度发生层和导流槽层设置于所述顶层与所述基层之间。

如上所述，本实用新型的一种微流控芯片，具有以下有益效果：

本实用新型将梯度发生层中的浓度梯度发生微通道与导流槽层的导流槽放置在不同的平面和区域，这样不仅使细胞不会通过培养基倒流进入浓度梯度生成器的通道中倒置通道堵塞，也能通过独立的导流槽结构形成一个具有多个凹槽的相互连通又相对独立的微环境当中，从而产生浓度梯度微环境。

附图说明

为了进一步阐述本实用新型所描述的内容，下面结合附图对本实用新型的具体实施方式作进一步详细的说明。应当理解，这些附图仅作为典型示例，而不应看作是对本实用新型的范围的限定。

图1为本实用新型实施例提供的一种微流控芯片的示意图；

图2为微流控芯片浓度梯度测试；

图3为微流控芯片浓度梯度数据分析；

图4为本实用新型实施例提供的一种微流控芯片的结构示意图；

图5为本实用新型实施例提供的一种微流控芯片的结构的剖视图；

图6为本实用新型实施例提供的一种微流控芯片的顶层示意图；

图7为本实用新型实施例提供的一种微流控芯片的基层的正面示意图；

图8为本实用新型实施例提供的一种微流控芯片的基层的反面示意图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本实用新型的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本实用新型的其他优点与功效。本实用新型还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本实用新型的精神下进行各种修饰或改变。需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合。

需要说明的是，以下实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本实用新型的基本构想，遂图式中仅显示与本实用新型中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

如图4所示，本实用新型提供一种微流控芯片，该芯片包括设置于同一平面内的梯度发生层1和导流槽层2，所述梯度发生层中形成有浓度梯度发生微通道6，该浓度梯度发生微通道包括至少两个浓度梯度入口区8和多个浓度梯度出口区5，所述导流槽层中形成有多个导流通道3，每个所述导流通道的一端分别通过一垂直通道4与一个所述浓度梯度出口区连通；所述梯度发生层与导流槽层可拆卸连接。

于本实施例中，每个导流通道的宽度相等，可以为500um，且具有同样的深度；每个浓度梯度发生微通道的宽度相等，具体可以为200um，且也具有相同的深度。

于另一实施例中，浓度梯度发生微通道入口可以为两个，但不限于两个，也可以是3个或多个。

于一实施例中，该芯片还包括基层9，所述梯度发生层与所述导流槽层设置于所述基层上，所述基层上设置有废液排出口，每个所述导流通道的另一端通过一垂直通道与所述废液排出口连通。基层上设置有凹槽91，可以放置导流槽层，其正、反面如图7、8所示。

于一实施例中，所述浓度梯度发生微通道呈圣诞树形，包括相连通的多层级结构，每级层结构分别包括多个浓度梯度通道，且自浓度梯度入口区至浓度梯度出口区方向的浓度梯度通道的数量逐级递增。

于一实施例中，每个所述浓度梯度通道分别曲线延伸。

于一实施例中，所述浓度梯度发生微通道设置于所述梯度发生层的上表面，多个所述导流通道设置于导流槽层的下表面。

于一实施例中，该芯片还包括顶层7，所述梯度发生层和导流槽层设置于所述顶层与所述基层之间。

于本实施例中，该芯片采用顶层和基层作为夹具，梯度发生层和导流曹层设置于夹具之间，整体的设计比较方便，更加具有可操作性。顶层由pmma材料构成，厚度为2mm，梯度发生层和导流槽层由pdms材料构成。中间层的通道宽度为200um，导流槽中每个沟槽的宽度为500um。底层由pmma材料构成，厚度为5mm。

在一具体实施例中，梯度发生层是带有特殊结构的微通道网络。这些特殊的微通道结构可以实现流体的分配与混合从而生成一些浓度呈梯度分布的溶液。本实施例中的浓度生成器的微通道结构中不仅有“一分为二”的结构，也有“一分为三”的结构，通过交替排列“一分为二”和“一分为三”的流体分配通道结构，可以得到许多种类型的浓度梯度生成器，本实施例仅以其中一种为例进行说明。

在一具体实施例中，如图2所示，浓度梯度发生微通道有两个入口a和b，分别通过两个直线形通道60与第一水平直线形通道61相连，第一直线形通道61分出三个分支分别与三个蜿蜒形通道62(浓度梯度通道)相连。上述三个蜿蜒形通道62接着与第二水平直线形通道63相连，第二水平直线形通道63分出四个分支分别与四个蜿蜒形通道64相连。上述四个蜿蜒形通道64接着与第三水平直线形通道65相连，第三水平直线形通道65分出五个分支分别于五个蜿蜒形通道66相连。上述五个蜿蜒形通道66接着与第四水平直线形通道67相连，第四水平直线形通道67分出六个分支分别与六个蜿蜒形通道68相连。上述六个蜿蜒形通道68接着与第五个水平直线形通道69相连，第五水平直线形通道69分出七个分支分别与七个蜿蜒形通道610相连。上述七个蜿蜒形通道610接着与第六水平直线形通道611相连，第六水平直线形通道611分出八个分支分别与八个蜿蜒形通道612相连。上述八个蜿蜒形通道分别与八个出口连接。

两股初始流体分别由两个入口a和b进入上述微通道网络中，当这两股流体进入第一水平直线形通道时，每股流体都一分为二成两股支流，两侧的蜿蜒形通道分别被两股流体的一股支流所充满分别保持两个初始流体的浓度不变，中间的一个蜿蜒通道被两股初始流体的支流所充满并在此完全混合形成一个中间浓度。

同理，当这三股流体进入第二水平直线通道时，每股流体一分为二成两股支流，两侧蜿蜒通道内的流体继续保持初始流体的浓度不变，中间的两个蜿蜒通道分别由两股支流在其中完全混合形成一个中间浓度。

当上述四股流体进入第三水平直线形通道中时，每股流体继续一分为二成两股支流，两侧的蜿蜒形通道保持初始流体的浓度不变，中间的三个蜿蜒通道分别由两股支流在其中完全混合形成一个中间浓度。

当这五股流体进入第四水平直线形通道中时，每股流体继续一分为二成两股支流，两侧的蜿蜒形通道保持初始流体的浓度不变，中间的四个蜿蜒通道分别由两服支流在其中完体混合形成一个中间浓度。

当这六股流体进入第五水平直线形通道中时，每股流体继续一分为二成两股支流，两侧的蜿蜒形通道保持初始流体的浓度不变，中间的五个蜿蜒通道分别由两服支流在其中完体混合形成一个中间浓度。

当这七股流体进入第六水平直线形通道中时，每股流体继续一分为二成两股支流，两侧的蜿蜒形通道保持初始流体的浓度不变，中间的六个蜿蜒通道分别由两服支流在其中完体混合形成一个中间浓度。

本实用新型浓度梯度芯片的设计分为a、b两个入口，两种不同种类的培养基经过a、b两个入口进入，液体流过“圣诞树”结构而互相稀释，最终在导流槽中形成具有八个浓度的培养基的浓度梯度。

微流控芯片对于模拟器官表面环境，研究细胞代谢产物和环境之间的相互作用关系具有一定的优势。本实用新型用一种具有形成浓度梯度功能的微流控芯片材料，达到形成培养基浓度梯度，进而营造所需组织培养微环境的效果，并量化的检测芯片的功能。

本实用新型以pdms为基础材料的“圣诞树”结构和导流槽结构相结合的微环境体系，以此将微流控芯片的结构设计与微流体的控制技术相结合，实现细胞共培养，可以控制和模拟细胞间的相互作用及体内的微环境，利用该体系形成培养基的浓度梯度，从而形成对共培养种子细胞的定向诱导，在organ-on-a-chip层面上来解决问题。

本实用新型能将整个材料作为一个整体，其不同区域(骨区-bone，过渡区-interface，肌腱区-tendon)的微环境不同，能对种子细胞产生不同程度的影响。

本实施例还提供一种微流控芯片的制备方法，包括：

(1)制备芯片(芯片制作过程均在超净间进行)：

1)浓度梯度芯片

模具加工：绘制cad图纸—加工菲林掩膜—清洗基片—匀胶—前烘—曝光—后烘—显影—坚膜—测厚(结构层深度100微米，管道宽200微米)

pdms芯片基片加工：配制pdms—除气泡—使用模具浇注—固化—按照合适尺寸切割、打孔。

2)软组织培养芯片

由solidwork软件来设计模具图纸，根据图纸进行高精度机械加工，不锈钢材料。

pdms芯片加工：配制pdms—除气泡—使用模具浇注(浇注两次为一对)—固化—按照合适尺寸切割、打孔。

3)芯片夹具

由solidwork软件来设计模具图纸，根据图纸进行高精度机械加工，材料pmma。

4)芯片组装

将肌腱组织放入芯片，并用步骤3中未键合的半包裹软组织芯片对准贴合(无需氧等离子键合)，放入夹具中夹紧，使用m3(直径3mm)螺丝固定夹具和芯片。

(2)组装及使用：

1)从芯片进液孔细导管处加入乙醇，操作过程中避免气泡产生，为亲润整个芯片管道。

2)将软组织放入包裹软组织芯片中，用螺丝把夹具与芯片固定

3)将浓度差异大的两种液体通过注射泵，以10ul/min的速度注入，操作过程中避免气泡产生，在高浓度药物组加入食品染料后可观察到浓度芯片内形成8个不同浓度梯度后输入包裹软组织的八个并列通道，并分别浸泡了软组织的不同部位，直到流出芯片进入夹具设计的液体排废孔。

(3)芯片浓度梯度测试

利用imagej软件：

(1)载入待测照片；

(2)image-color-splitchannels，分成红、绿、蓝的灰度图像三张；

(3)对于red灰度图，用方框画出每个通道出口区域，点选analyse-measure，收集此区域的平均red灰度值；

(4)对于green灰度图，用相同方法测得每个通道出口区域的平均green灰度值。

(5)收集数据，将同一通道出口的红色灰度值和绿色灰度值做比值。

通过对微流控芯片通道的浓度梯度测试，可见pdms通道结构完整，通道无变形或堵塞。通过圣诞树结构能够形成一定的浓度梯度。浓度梯度结果显示该芯片能够形成一定的浓度梯度，除8号出口出现边缘效应外，其余出口的平均灰度值均可稳定分布。

本实用新型微流控体系设计能利用“圣诞树”原理，实现导流槽中培养基的浓度梯度，初步实现了”organ-on-a-chip”的理念。浓度梯度测试结果表明，该芯片通过圣诞树结构形成成骨培养基的浓度梯度。由此可以得出以下结论：该芯片体系能实现同一根肌腱上不同区域培养基的不同浓度梯度值，把腱--骨愈合的问题转换为骨--骨愈合的问题。从而达到骨段促进骨化同时肌腱端减少异位骨化发生概率的效果，该部分为下一步支架材料的培养奠定了微环境的基础。

上述实施例仅例示性说明本实用新型的原理及其功效，而非用于限制本实用新型。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本实用新型的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本实用新型所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本实用新型的权利要求所涵盖。