多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的制备方法与流程

【
技术领域：
】本发明涉及能够由多不饱和脂肪酸产生多羟基衍生物的酶和使用该酶产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法。
背景技术：
：由于炎症反应作为机体对病原体感染和各种毒性物质的初级防御发挥重要作用，但同时，炎症反应可以作为引起各种慢性疾病的潜在因素，因此炎症反应是需要通过复杂的体内调节机制严格控制的生理现象。前列腺素(prostaglandin)或白三烯(leucotriene)，花生四烯酸(arachidonicacid，c20:4n-6)的衍生物，其对应于ω-6多不饱和脂肪酸，是代表性的炎症反应起始信号物质，并且诱导能够在体内引起各种慢性疾病的炎症反应的失衡。通常，当炎症反应起始信号物质不产生时，炎症反应被认为是自然终止的，并且，已经开发了各种甾体或非甾体抗炎治疗剂来抑制该物质的产生。但是，近年来，炎症反应的终止机制也是通过复杂的调节过程来进行的，而在该过程中已经证实ω-3多不饱和脂肪酸的羟基衍生物，例如二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，dha，c22:6n-3)和二十碳五烯酸(eicosapentaenoicacid，epa，c20:5n-3)，可以作为在炎症反应的终止机制中起作用的信号物质。那些作为炎症反应终止机制的信号物质的羟基衍生物被称为特异性促消退介质(specializedproresolvingmediators(spm)；消退素、保护素、maresins)。已经证实这些羟基衍生物显示出优于现有抗炎治疗剂如皮质类固醇(corticosteroids)和非甾体抗炎药(non-steroidanti-inflammatorydrug，nsaid)、阿司匹林的效果。另外，不同于主要诱导抑制炎症反应起始信号物质产生的常规甾体或非甾体抗炎治疗剂，spm具有在炎症反应的所有阶段都显示功效的优点。因此，对于各种慢性炎症性疾病(血管、心肌梗塞、中风、痴呆、骨关节炎、哮喘等肺病、胃肠炎、牙周炎、干眼综合征、脂肪肝等各种慢性炎症性疾病)、败血症感染、烧伤、创伤恢复、疼痛、癌症、糖尿病等各种疾病，使用spm是否有治疗效果的研究，正在积极进行中。另一方面，体内炎症反应终止信号物质spm具有在ω-3多不饱和脂肪酸中插入两个或三个羟基的结构，并且已知通过两种或多种酶的连续作用产生非常痕量的spm。因此，为了制造对炎症反应终止信号物质的药效和治疗药物充分开发的spm，一直在努力通过有机合成方法制造(参照非专利文献1)，但存在其方法非常复杂的限制。最近，报道了通过使用大豆15-脂肪氧合酶(15-lipoxygenase)、马铃薯脂肪氧合酶或藻类脂肪氧合酶，可以制备ω-3多不饱和脂肪酸的单羟基(mono-hydroxy)或二羟基(di-hydroxy)衍生物(参见非专利文献2至4)。但是，除了上述酶之外，还在继续研究能够产生spm的新酶。(现有技术文献)(非专利文献1)ogawaetal.,j.org.chem.,82(4),2032-2039(2017)(非专利文献2)dobsonetal.,journaloflipidresearch,54,1439-1447(2013)(非专利文献3)butovichetal.,lipids,40(3),249-257(2005)(非专利文献4)zhuetal.,plosone,10(2),e0117351(2015)技术实现要素：【技术问题】本发明的目的是提供一种能够由多不饱和脂肪酸产生多羟基衍生物的酶，以及使用该酶能够在体内(invivo)或体外(invitro)产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法。【技术方案】为了实现该目的，本发明的一个方面提供了一种酶，具有seqidno:1的氨基酸序列，用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物。本发明的另一方面提供了一种酶，具有seqidno:2的氨基酸序列，用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物。本发明的另一方面提供了一种体外制备多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法，包括使得用于制备二羟基衍生物的酶、或用于制备三羟基或四羟基衍生物的酶，与多不饱和脂肪酸，例如二十二碳六烯酸反应。本发明的另一方面提供了一种在体内生产多羟基衍生物的方法，包括在多不饱和脂肪酸例如二十二碳六烯酸的存在下培养转化体，其转导了编码用于产生二羟基衍生物的酶或用于产生三羟基或四羟基衍生物的酶的基因，以及从培养的培养基中分离多羟基衍生物。【有益效果】根据本发明，所述酶可通过使用多不饱和脂肪酸作为底物，在单一反应中产生例如二羟基、三羟基或四羟基的多羟基衍生物，并且可非常有效地用于多羟基衍生物的离体(exvivo)产生。然而，本发明的效果不限于上述效果，并且本领域技术人员从以下描述将清楚地理解未提及的其它效果。【附图说明】图1a示出了通过sds-page确认具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质k9v_a296g过表达的结果，图1b示出通过sds-page确认具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质k9v过表达的结果。图2a示出了对通过使具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质k9v_a296g与亚油酸反应获得的反应产物进行正相hplc分析和手性hplc分析的结果，图2b示出对具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质k9v的反应产物进行正相hplc分析和手性hplc分析的结果。在图2a和图2b中，分别地，9r-hode是指9r-羟基十八碳二烯酸(9r-hydroxy-octadecadienoicacid)，而13s-hode是指13s-羟基十八碳二烯酸(13s-hydroxy-octadecadienoicacid)。图3a示出了通过对由具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应获得的反应产物进行反相hplc和质谱分析来分析存在于反应产物中的羟基衍生物的结果，而图3b表示通过对由具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应获得的反应产物进行反相hplc和质谱分析来分析存在于反应产物中的羟基衍生物的结果。图4a和图4b示出了具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应得到的反应产物的nmr分析结果，图4c至图4e显示了具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应得到的反应产物的nmr分析结果。图5a和图5b示出了对具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应获得的反应产物的结果通过nmr分析所确认的衍生物的化学结构，其中图5a示出了由具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质产生的二羟基衍生物的化学结构式，图5b示出了由具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质产生的单羟基衍生物的化学结构式。另外，图5c至图5e说明了具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质与二十二碳六烯酸反应获得的反应产物的结果通过nmr分析所确认的衍生物的化学结构。其中，图5c示出了由具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质产生的四羟基衍生物的化学结构式，图5d示出了由具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质产生的单羟基衍生物的化学结构式，而图5e示出了由具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质产生的二羟基衍生物的化学结构式。图6示出了对以大豆15-lox酶作为对照与二十二碳六烯酸反应得到的反应生成物进行正相hplc分析来分析反应生成物中存在的羟基衍生物的结果。图7示出了分析系统分析的结果，其基于氨基酸序列与人5lox、人12lox、人15lox、大豆15lox、马铃薯lox和红藻phlox的同源性分析的结果，这些酶是与具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白k9v_a296g和具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白k9vs具有相似活性的脂氧合酶。图8a是示出了确认ph值对具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质的酶活性有所影响的结果的图，图8b是示出了确认ph值对具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质的酶活性有所影响的结果的图。图9a是示出了确认温度对具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质的酶活性有所影响的结果的图，图9b是示出了确认温度对具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质的酶活性有所影响的结果的图。图10a是分析由具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质生成的二羟基衍生物对癌细胞和癌干细胞的增殖的影响的结果的图，图10b是分析由具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质生成的三羟基衍生物对癌细胞和癌干细胞的增殖的影响的结果的图。【具体实施方式】以下，将详细描述本发明。1、用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶本发明的一个方面提供了用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶。本发明的一个实施方式提供了用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶和编码用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的基因。本发明的另一个实施方案提供了用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶和编码用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因。本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶含有seqidno:1所示的氨基酸序列，而用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶含有seqidno:2所示的氨基酸序列，在不影响用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的功能的范围内，所述酶可以是通过氨基酸残基的缺失、插入、取代或组合而具有不同序列的氨基酸的变体或片段。本领域已知，在蛋白质和肽水平上进行的氨基酸交换，不完全改变用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的活性。在一些情况下，氨基酸交换可以通过磷酸化(phosphorylation)、硫酸化(sulfation)、丙烯酸酯化(acrylation)、糖基化(glycosylation)、甲基化(methylation)、法尼基化(farnesylation)等来修饰。因此，本发明包括具有与包括seqidno:1或seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质实质上相同的氨基酸序列的蛋白质，及其变体或活性片段。实质上相同的蛋白质是指与氨基酸序列具有至少90％，优选至少93％，最优选至少95％同源性的蛋白质，但不限于此，与氨基酸序列具有至少90％同源性和相同的酶活性的蛋白质也包括在本发明的范围内。上述用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的基因优选由seqidno:3所示的碱基序列构成，而上述用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因优选由seqidno:4所示的碱基序列构成，但本发明的编码用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因、其变异体或活性片段，在不改变由该编码区域以及其变异体或活性片段表达的酶的氨基酸序列的范围内，可以对编码区域进行各种修饰。在不影响基因表达的范围内，甚至在除了编码区以外的部分中，可以进行各种突变，并且这样的突变基因也包括在本发明的范围内。因此，本发明包括由与seqidno:3或seqidno:4的基因实质上相同的核苷酸序列组成的基因和该基因的片段。由实质上相同的核苷酸序列组成的基因是指具有80％或更高，优选90％或更高，最优选95％或更高的序列同源性的基因，但不限于此，与所编码的蛋白质具有80％或更高的序列同源性且具有相同的酶活性的基因包括在本发明之内。这样，本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶或用于产生本发明的多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因，可以通过至少一个核苷酸的取代、缺失和插入或其组合而突变，只要该基因编码具有与其等同活性的蛋白质，并且这些突变体也包括在本发明中。用于产生二羟基衍生物的酶中包括的seqidno:1的氨基酸序列优选由核苷酸序列seqidno:3组成的基因编码，但本发明不限于此。seqidno:1的氨基酸序列也可以由与seqidno:3的核苷酸序列实质上相同的另一核苷酸序列组成的基因编码，只要该氨基酸序列可以编码具有相同氨基酸序列的本发明的蛋白质。这些核苷酸序列可以是单链或双链的，并可以是dna分子或rna分子。用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶中包括的seqidno:2的氨基酸序列优选由包含seqidno:4的核苷酸序列的基因编码，但是本发明不限于此。seqidno:2的氨基酸序列也可以由与seqidno:4的核苷酸序列实质上相同的另一核苷酸序列组成的基因编码，只要该氨基酸序列可以编码具有相同氨基酸序列的本发明的蛋白质。这些核苷酸序列可以是单链或双链的，并可以是dna分子或rna分子。在本发明的具体实施方案中，本发明人分离和纯化了具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质和具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质，以发现具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质和具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质的功能(参见图1a和1b)，并研究了它们的活性。总之，本发明人证实了具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质具有能够产生，具有两个引入至多不饱和脂肪酸的羟基的，二羟基衍生物的酶活性(参见图3a)，并且具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质具有能够产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶活性(参见图3b)。2、用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶的表达载体和转化体本发明的另一方面提供重组表达载体和导入了该表达载体的转化体，所述重组表达载体包含本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的基因，或者本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因。本发明的重组表达载体包括用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的基因或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因。表达载体包括质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体、病毒载体等，但不限于此。重组表达载体可以根据宿主细胞的种类适当组合启动子(promoter)、终止子(terminator)、增强子(enhancer)等表达调控序列或分泌用序列，制备本发明的用于产生多不饱和脂肪酸二羟基衍生物的酶、或制备用于产生本发明的多不饱和脂肪酸三羟基或四羟基衍生物的酶的基因。表达载体可以进一步包括用于选择载体已经被导入其中的宿主细胞的选择标记，并且在可复制表达载体的情况下可以包括复制起点。另外，重组表达载体可以包括用于促进表达的蛋白质的纯化的序列，并且具体地，可以与编码用于分离和纯化的标签的基因连接，以便对于编码本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的基因、或者本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因，为可操作。此时，分离纯化用标记可以单独使用gst、聚精氨酸(poly-arg)、flag、组氨酸标记(his-tag)、c-myc等，也可以依次连接两个以上。编码用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因，可通过限制性酶切割位点克隆。当编码蛋白质切割酶识别位点的基因用于载体时，该基因与用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的基因或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因在框架内(inframe)连接。当酶被获得并通过蛋白质切割酶切割时，可以产生用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的原始型酶或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的原始型酶。在本发明的具体实施方案中，将本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的基因(包含seqidno:3的核苷酸序列的基因)或本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因(包含seqidno:4的核苷酸序列的基因)分别插入质粒载体prl2(seoetal.,biotechnol.lett.,2009,31:877-881)中，以制备重组克隆载体。除了用于制备克隆载体的prl2之外，已知有各种用于原核细胞或真核细胞的载体(如ppic和ppicz)，因此，根据表达目的，可使用除载体之外的各种表达载体。本发明的重组表达载体，可以有效地用作包含用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的基因或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因的载体，并且能够产生该酶的基因。本发明的转化体被导入了重组表达载体，该重组表达载体用于产生含有多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的基因或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因。根据表达目的，将本发明的重组表达载体转化到选自由细菌、酵母、大肠杆菌、真菌、微藻、藻类(algae)、植物细胞和动物细胞组成的组中的任何一种合适的宿主细胞中，以制备转化体。例如，宿主细胞可以是大肠杆菌(大肠杆菌bl21(de3)、dh5α等)、酵母细胞(酵母属(saccharomyces)、毕赤酵母属(pichia)等)等。此时，本领域技术人员可以根据宿主细胞的类型从本领域已知的技术中容易地选择合适的培养方法和培养基条件等。作为导入重组表达载体以制备本发明转化体的方法，可以使用已知技术，即热休克法、电击法等。在本发明的具体实施方式中，将重组表达载体转化到大肠杆菌中，制备转化体，所述重组表达载体包括编码用于产生本发明的多不饱和脂肪酸二羟基衍生物的酶的基因或用于产生本发明的多不饱和脂肪酸三羟基或四羟基衍生物的酶的基因，其中使用大肠杆菌作为宿主细胞。由于转化体表达的蛋白质是具有用于产生多不饱和脂肪酸二羟基衍生物的酶的活性的新序列蛋白质，或者是具有用于产生多不饱和脂肪酸三羟基衍生物或四羟基衍生物的酶的活性的新序列蛋白质，因此通过大量培养转化体来表达基因，可以容易地大量生产用于产生多不饱和脂肪酸二羟基衍生物的酶或用于产生多不饱和脂肪酸三羟基衍生物或四羟基衍生物的酶。3、体外制备多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法本发明的另一方面提供了一种体外生产多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法，更具体而言，提供了一种体外生产多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的方法和一种体外生产多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的方法。本发明的体外制备多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法，包括使多不饱和脂肪酸与在“1、用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶”中描述的用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶反应。多不饱和脂肪酸是在碳之间含有三个或更多个双键的脂肪酸，优选ω-3脂肪酸，更优选二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸，但不限于此。如上所述，当多不饱和脂肪酸用作产生二羟基衍生物的酶的底物时，底物包括多个双键，可以向其中引入羟基以实现二羟基衍生物的产生。此外，当多不饱和脂肪酸用作产生三羟基或四羟基衍生物的酶的底物时，底物包括多个双键，可将羟基引入所述双键中以实现三羟基或四羟基衍生物的产生。多不饱和脂肪酸与用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的反应可以在0℃至50℃的温度范围内，优选在15℃至35℃的温度范围内进行，但不限于此。另外，反应可以在ph4至ph10的范围内，优选在ph7至ph9的范围内进行，但不限于此。当在所述温度和ph范围内进行反应时，用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的活性被最大化，以更有效地产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物。在本发明的一个具体实施方案中，确认了具有seqidno:1的氨基酸序列，具有作为用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶的活性的蛋白质，在20℃附近、ph8.0的条件下具有最佳的酶活性(参见图8a和9a)。另外，确认了具有seqidno:2的氨基酸序列，具有作为用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的活性的蛋白质，在30℃附近、ph8.0的条件下具有最佳的酶活性(参照图8b和图9b)。本发明的体外制备多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法还包括从酶和多不饱和脂肪酸的反应产物中回收多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物。回收可以通过进行本领域通常进行的方法，例如离心和过滤来实现，并且可以通过另外以一般方式进行纯化过程来实现。例如，纯化过程可以单独进行或与诸如溶剂沉淀、透析、凝胶过滤、离子交换和色谱如反相柱色谱的技术组合进行。4、体内生产多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的方法本发明的另一方面提供了在体内生产多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法，更具体而言，提供了在体内生产多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的方法和在体内生产多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的方法。本发明的体内生长多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的方法包括在多不饱和脂肪酸存在下培养“2、用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶的表达载体和转化体”中所述的转化体，并从培养的培养基中分离多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物、或多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物。在导入了含有编码多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶的基因的重组表达载体的转化体中，用于多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶或用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶可被表达。结果，通过使用该转化体，在含有多不饱和脂肪酸作为底物的培养基中培养该转化体，以产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物，而不需要分离酶的单独过程。关于用于产生转化体中存在的多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶，通过引用“1、用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶”的描述将省略其详细描述。转化体的培养可以根据本领域已知的适当培养基和培养条件进行。本领域技术人员可以根据待选择的转化体的类型容易地调整和使用培养基和培养条件。培养方法可以包括分批型、连续型、补料分批型或其组合。培养基可以含有各种碳源、氮源和微量元素成分。碳源可以包括例如碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、淀粉和纤维素，脂肪如大豆油、向日葵油、蓖麻油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸、硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，有机酸如乙酸，或其组合。可以使用葡萄糖作为碳源进行培养。氮源可以包括有机氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉汤、麦芽提取物、玉米浆(cornsteepliquor，csl)和豆浆，无机氮源例如尿素、硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵，或其组合。作为磷的供给源，培养基可以含有例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和与其对应的含钠盐，以及金属盐如硫酸镁或硫酸铁。此外，培养基中可以包括氨基酸、维生素、合适的前体等。培养基或单独的成分可以分批或连续的方式加入培养基中。此外，在培养过程中，通过使用消泡剂如脂肪酸聚乙二醇酯可以抑制气泡的产生。5、新的二十二碳六烯酸的多羟基衍生物本发明的另一方面提供了新的二十二碳六烯酸的多羟基衍生物。在本发明的一个实施方案中，所述新的二十二碳六烯酸的多羟基衍生物可以是其中羟基被引入到二十二碳六烯酸的13位和20位的新的二羟基衍生物，具体地，具有以下化学式1的化学结构的化合物。【化学式1】特别地，所述新的二十二碳六烯酸的二羟基衍生物可以通过将二十二碳六烯酸与用于产生本发明的多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶反应而获得。在本发明的另一个实施方案中，所述新的二十二碳六烯酸的多羟基衍生物的其它衍生物可以是其中羟基被引入到二十二碳六烯酸的7、15、16和17位的新的四羟基衍生物，具体地，具有以下化学式2的化学结构的化合物。【化学式2】特别地，所述新的二十二碳六烯酸的四羟基衍生物可以通过将二十二碳六烯酸与用于产生本发明的多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶反应而获得。6、抑制癌症干细胞增殖的组合物同时，本发明的另一方面提供了一种用于抑制癌症干细胞增殖的组合物。在本发明的一个实施方案中，用于抑制癌症干细胞增殖的组合物包含多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物作为活性成分，其通过使多不饱和脂肪酸与在“1、用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶”中描述的用于产生二羟基衍生物的酶反应而获得。此外，用于抑制癌症干细胞增殖的组合物可进一步包含单羟基衍生物，其为上述反应过程中产生的中间产物。在本发明的另一个实施方案中，用于抑制癌症干细胞增殖的组合物包含多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物作为活性成分，其通过使多不饱和脂肪酸与在“1、用于产生多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的酶”中描述的用于产生三羟基或四羟基衍生物的酶反应而获得。此外，用于抑制癌症干细胞增殖的组合物可进一步包含四羟基衍生物，其可与单羟基衍生物或二羟基衍生物或三羟基衍生物一起产生，或所述三羟基衍生物是上述反应过程中产生的中间产物。多不饱和脂肪酸是在碳之间含有三个或更多个双键的脂肪酸，优选ω-3脂肪酸，更优选二十二碳六烯酸或二十碳五烯酸，但不限于此。在多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物中，特别地，所述组合物包含通过使本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物的酶与多不饱和脂肪酸反应而获得的二羟基衍生物、通过使本发明的用于产生多不饱和脂肪酸的三羟基或四羟基衍生物的酶与多不饱和脂肪酸反应而获得的三羟基衍生物、或两者的衍生物的组合，通过特异性作用于癌症干细胞而具有抑制增殖的效果。在本发明的一个具体实施方案中，将包含通过二十二碳六烯酸与具有seqidno:1的蛋白质反应而获得的具有化学式1的化学结构的二羟基衍生物的组合物处理人乳腺癌细胞和源自人乳腺癌的癌干细胞，结果证实源自人乳腺癌的癌干细胞的增殖被特异性地抑制(参见图10a)。另外，将包含通过二十二碳六烯酸与具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质反应获得的三羟基衍生物的组合物处理至人乳腺癌细胞和源自人乳腺癌的癌干细胞，结果证实，源自人乳腺癌的癌干细胞的增殖被特异性地抑制(参见图10b)。“癌症”通常是指以细胞生长失控为特征的哺乳动物的生理状态，并且是指细胞的正常分裂、分化和死亡的调节功能发生异常的状态，因此，细胞异常过度增殖并浸润到周围组织和器官中，形成肿块，破坏或改变现有结构。“癌干细胞”可以是具有分化成各种癌细胞能力的未分化细胞，其中癌症可以是结肠直肠癌，包括结肠癌和直肠癌、乳腺癌、子宫癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、脑肿瘤、头颈癌、黑素瘤、骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、胃癌、肺癌、胰腺癌、肝癌、食道癌、小肠癌、肛门附近的癌症、输卵管癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、膀胱癌、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、骨癌、皮肤癌、头癌、颈癌、皮肤黑素瘤、眼内黑素瘤、内分泌癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、中枢神经系统(centralnervoussystem，cns)肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤，但不特别限于此。癌干细胞可以是乳腺癌干细胞，其是具有分化成乳腺癌细胞的能力的未分化细胞。“抑制癌干细胞增殖”是指包括抑制癌干细胞的维持(maintenance)、抑制癌干细胞的恶性化(malignance)、抑制癌干细胞的迁移和侵入(invasion)。同时，用于抑制癌症干细胞增殖的组合物可以用作药物组合物或食品组合物。当组合物用作药物组合物时，除了多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物之外，组合物还可以包含药学上可接受的载体(carrier)或添加剂。“药学上可接受的”是指在不抑制活性成分的活性的情况下，待施用(处方)的对象不具有超出适应性的毒性。“载体”定义为促进化合物加入细胞或组织的化合物。本发明的多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物可以单独施用或与任何方便的载体等组合施用，并且这样的剂量制剂可以是单剂量或重复剂量制剂。药物组合物可以是固体制剂或液体制剂。固体制剂包括粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂和栓剂，但不限于此。固体制剂可以包括载体、调味剂、粘合剂、防腐剂、崩解剂、润滑剂、填充剂等，但不限于此。液体制剂包括溶液，例如水和丙二醇溶液，悬浮液和乳液，但不限于此，并且可以通过加入合适的着色剂、调味剂、稳定剂、增粘剂等来制备。例如，粉剂可以通过简单地将合适的药学上可接受的载体例如乳糖、淀粉、微晶纤维素等与作为本发明活性成分的多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物混合来制备。颗粒剂可以通过将本发明的二羟基衍生物或三羟基衍生物、合适的药学上可接受的载体和合适的药学上可接受的粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基纤维素等混合，然后使用采用溶剂如水、乙醇和异丙醇的湿法制粒法或使用压缩力的干法制粒法来制备。此外，片剂可通过将颗粒与合适的药学上可接受的润滑剂如硬脂酸镁混合，然后使用压片机将混合物压片来制备。本发明的多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物可以根据待治疗的疾病和受试者的状况与口服剂、注射剂(例如，肌内注射、腹膜内注射、静脉内注射、输液(infusion)、皮下注射和植入物)、吸入剂、鼻给药剂、阴道剂、直肠给药剂、舌下剂、透皮剂、局部剂等一起给药，但不限于此。所述衍生物可以配制成合适的剂量单位制剂，包括药学上可接受的载体、添加剂和媒介物，它们根据给药途径是常规使用的并且是无毒的。本发明的药物组合物可以以约0.0001mg/kg至约10g/kg，和约0.001mg/kg至约1g/kg的日剂量给药。然而，剂量可以根据混合物的纯化程度、患者的状况(年龄、性别、体重等)和所治疗的状况的严重程度而变化。如果需要，为了方便起见，总的日剂量可以分开并在一天中给药几次。当本发明的组合物用作药物组合物时，组合物中多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物的浓度可以为30μm或更高，特别地为35μm或更高，更特别地为40μm或更高。此外，当组合物用作食品组合物时，组合物可以含有可接受的食品补充剂添加剂，并且可以进一步包括通常用于食品制造的合适的载体、赋形剂和稀释剂。在本发明中，食品是指含有一种以上营养素的天然物或加工物，具体而言，是指通过某种加工处理可直接食用的状态，作为一般的意思，是指包括各种食品、功能性食品、饮料、食品添加剂、饮料添加剂的所有的意思。食品的实例包括各种食品、饮料、口香糖、茶、维生素复合物、功能性食品等。另外，本发明的食品包括特殊营养食品(例如，配方食品、婴儿食品等)、加工肉制品、鱼肉制品、豆腐、凉粉、面条(例如，拉面、面条等)、健康补充食品、调味食品(例如，酱油、豆瓣酱、红辣椒酱、混合酱油等)、酱汁、糖果(例如，点心)、乳制品(例如，发酵乳、奶酪等)、其它加工食品、泡菜、盐渍食品(各种韩式泡菜、泡菜等)、饮料(例如，水果、蔬菜饮料、豆浆、发酵饮料、冰淇淋等)、天然调味品(例如，拉面汤等)、维生素复合物、酒精饮料、酒类和其它健康补充物，但不限于此。功能性食品、饮料、食品添加剂或饮料添加剂可通过一般的制备方法制备。术语“功能性食品”是指被设计和加工以充分表达关于食物组或食物组合物的生物防御节律控制、疾病预防和恢复等的身体调节功能的食品，其具有通过使用物理、生物化学和生物技术方法等作用和表达用于特定目的相应食品的功能的附加值，并且具体地，可以是健康功能性食品。本发明中使用的术语“健康功能性食品”是指通过使用具有对人体有用的功能性的原料或成分以片剂、胶囊、粉末、颗粒、液体和丸剂的形式制备和加工的食品。这里，“功能”是指调节人体结构和功能的营养，或获得对健康应用有用的效果，如生理作用。本发明的保健功能食品可以通过本领域常用的方法制备，并且可以通过加入制备中本领域常用的原料和成分来制备。此外，保健功能性食品的配方也可以没有限制地制备，只要该配方被认为是保健功能性食品。本发明的食品组合物可以制成各种类型的制剂，并且与一般药物不同，该食品组合物具有的优点是，通过使用该食品作为原料长期服用该药物时不会发生副作用，并且具有优异的便携性，但是本发明的保健功能食品可以作为补充剂用于增强抑制乳腺癌干细胞生长的效果。此外，功能性食品可以包括食品上可接受的食品补充剂添加剂，并且可以进一步包括通常用于功能性食品的制造的合适的载体、赋形剂和稀释剂。此外，在食品组合物中，组合物中多不饱和脂肪酸的二羟基衍生物或多不饱和脂肪酸的三羟基衍生物的浓度可以是30μm或更高，特别是35μm或更高，更特别是40μm或更高。本发明的食品组合物除了活性成分之外，还可以含有甜味剂、调味剂、生理活性成分、矿物质等。甜味剂可以以给予食物合适甜味的量使用，并且可以是天然的或合成的。具体地，当使用天然甜味剂时，天然甜味剂的实例可以包括糖甜味剂，例如玉米糖浆固体、蜂蜜、蔗糖、果糖、乳糖和麦芽糖。调味剂可用于改善味道或风味，并且可使用天然和合成调味剂。具体地，使用天然调味剂。在使用天然调味剂的情况下，除了调味之外，还可以兼顾营养增强的目的。天然调味剂可从苹果、柠檬、红橘、葡萄、草莓、桃等获得，或从绿茶叶、黄精(solomon’sseal)、竹叶、肉桂、菊花叶、茉莉等获得。此外，可以使用从人参(红参)、竹笋、芦荟和银杏中获得的调味剂。天然调味剂可以是液体浓缩物或固体提取物。在一些情况下，可以使用合成调味剂，并且合成调味剂可以使用酯、醇、醛、萜烯等。作为生理活性成分，可以使用儿茶素类，如儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素和表没食子儿茶素，以及维生素如视黄醇、抗坏血酸、生育酚、钙化醇、硫胺素和核黄素。作为矿物质，可以使用钙、镁、铬、钴、铜、氟化物、锗、碘、铁、锂、镁、锰、钼、磷、钾、硒、硅、钠、硫、钒、锌等。另外，本发明的食品组合物中，除了甜味剂等以外，根据需要还可以含有防腐剂、乳化剂、酸味剂、增粘剂等。这些防腐剂、乳化剂等优选以非常痕量添加和使用，只要可以实现待添加的应用即可。当用数字表示时，痕量是指基于食品组合物的总重量的约0.0005wt％至约0.5wt％的范围。可以使用的防腐剂可以包括山梨酸钙钠、山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钙、苯甲酸钠、苯甲酸钾、乙二胺四乙酸(edta)等。作为乳化剂，可以使用例如金合欢胶、羧甲基纤维素、黄原胶、果胶等。可以使用的酸化剂的实例可以包括柠檬酸、苹果酸、富马酸、己二酸、磷酸、葡糖酸、酒石酸、抗坏血酸、乙酸、磷酸等。这些酸化剂可以加入，以使食品组合物具有合适的酸度，以便除了增强味道之外还抑制微生物的增殖。作为可以使用的增稠剂，可以包括悬浮剂、沉降剂、凝胶形成剂、溶胀剂等。以下，通过实施例对本发明进行详细说明。但是，以下实施例仅是对本发明的说明，本发明的内容并不限于以下实施例。【实施例1】含有seqidno:1或seqidno:2所示的氨基酸序列的蛋白质的制备【1-1】蛋白质表达用载体的制备编码seqidno:1的每个氨基酸的seqidno:3的核苷酸序列和编码seqidno:2的每个氨基酸的seqidno:4的核苷酸序列通过要求bioneerco.,ltd.合成。使用合成的核苷酸序列作为模板，使用seqidno:5和6的引物对在95℃进行30秒的预变性(pre-denaturation)，然后通过重复在95℃反应30秒、在55℃反应30秒和在68℃反应5分钟的循环进行pcr以扩增seqidno:2的基因。【表1】将含有如上所述扩增的seqidno:3的核苷酸序列和seqidno:4的核苷酸序列的pcr产物分别插入质粒载体prl2(seoetal.,biotechnol.lett.,2009,31:877-881)以制备重组表达载体。通过碱基序列测定(sequencing)(solgent)确认seqidno:3和seqidno:4的碱基序列正确插入。【1-2】蛋白质的表达和纯化将实施例【1-1】中制备的重组表达载体转化至大肠杆菌dh5a中，将转化体接种到3mllb培养基中，于37℃种子培养直到600nm吸光度为2.0。然后，通过将种子培养的培养基加入到500mllb培养基中，进行24小时的主培养。通过离心如上所述的主培养诱导过表达转化体的培养基，分离上清液，从分离了上清液的沉淀中裂解转化体的细胞，获得转化体的细胞裂解物(celllysate)。对如上所述获得的细胞裂解物进行sds-page的结果，如图1a和1b所示，证实具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质和具有seqidno:2的氨基酸序列、大小为约65kda的蛋白质过表达(参见图1a和1b)。对于证实具有上述seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质过表达的细胞裂解物，使用ni-nta吸附层析分离和纯化具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质。对于证实具有上述seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质过表达的细胞裂解物，使用ni-nta吸附层析分离和纯化具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质。【实施例2】蛋白质活性的确认【2-1】羟基化活性的确认对于实施例【1-2】中纯化和分离的具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质和具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质中的每一者，让10ku/ml的该蛋白质和100μm的亚油酸在ph7、室温下相互反应30分钟，加入1m硼氢化钠(sodiumborohydride)还原反应产物，使最终浓度为50mm，然后加入5μl/ml乙酸终止反应。反应产物用固相柱(spe，c18500mg)纯化后，反应产物中的化合物类型用正相hplc(normalphasehplc)和手性hplc(chiralhplc)分析。具体地，对由具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质产生的反应产物中的化合物进行的正相hplc分析，是通过将20ml由94.8％正庚烷、5％异丙醇、0.1％乙酸和0.1％的2,2-二甲氧基丙烷组成的流动相在supelcosillc-二醇柱(supelco，25cm×3mm，5μm)上以0.5ml/min的流速展开40分钟，并最终使用二极管阵列检测器(diodearraydetector，dad)检测反应产物中的化合物，来进行。手性hplc分析，是通过将40ml由94.9％正庚烷、5％异丙醇、0.1％乙酸和0.1％的2,2-二甲氧基丙烷组成的流动相在supelcosillc-二醇柱(supelco，25cm×3mm，5μm)上以0.5ml/min的流速展开40分钟，最后使用二极管阵列检测器检测反应产物中的化合物，来进行。另外，对由具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质产生的反应产物中的化合物进行的正相hplc分析，是通过将20ml由95％正庚烷、5％异丙醇、0.1％乙酸和0.1％的2,2-二甲氧基丙烷组成的流动相在supelcosillc-二醇柱(supelco，25cm×3mm，5μm)上以0.5ml/min的流速展开40分钟，并且最后使用二极管阵列检测器检测反应产物中的化合物，来进行。手性hplc分析，是通过将20ml由95％正庚烷、5％异丙醇、0.1％乙酸和0.1％的2,2-二甲氧基丙烷组成的流动相在supelcosillc-二醇柱(supelco，25cm×3mm，5μm)上以0.5ml/min的流速展开40分钟，最后使用二极管阵列检测器检测反应产物中的化合物，来进行。结果，如图2a所示，对于由具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质产生的反应产物，在正相hplc和手性hplc中，确认了9r-羟基十八碳二烯酸(9r-hode)和13s-羟基十八碳二烯酸(13s-hode)。另外，如图2b所示，对于由具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质生成的反应产物，在正相hplc和手性hplc中，确认了与13s-羟基-辛二烯酸(13s-hode)相同的峰。从上述结果可以看出，本发明的具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质具有将亚油酸羟基化成9r-羟基十八碳二烯酸和13s-羟基十八碳二烯酸的活性，并且本发明的具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质具有将亚油酸羟基化成13s-羟基十八碳二烯酸的活性。【2-2】多羟基衍生物的制备活性的确认对于在实施例【1-2】中纯化和分离的具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质，让2、6和10ku/ml的该蛋白质和100μm二十二碳六烯酸(dha)在ph7、室温下彼此反应30分钟，加入1m硼氢化钠还原反应产物，使终浓度为50mm，加入5μl/ml乙酸终止反应，然后分析反应产物中的化合物类型。结果，如图3a所示，证实具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质不仅可以产生其中一个羟基被引入dha的单羟基衍生物，而且可以产生其中两个羟基被引入的二羟基衍生物。另外，对反应产物进行nmr分析。具体来说，由二十二碳六烯酸转化的单或二羟基衍生物，是由c、o和h组成的有机物质，而使用800mhznmr(bruker)通过测量这些化学物质之间的化学位移值来分析结构。nmr测定用溶剂使用氢被氘取代的d4-甲醇，在绝对温度298k下进行测定。构成单或二羟基衍生物的氢和碳通过使用1dnmr(1h、13c)和2dnmr(1h-1hcosy、edited-qc、hmbc、tocsy、roesy)测量(图4a和4b)。结果，如图5a和5b所示，证实了具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质在dha的13位和20位引入羟基，产生二羟基衍生物(图5a)。在该过程中，证实了作为中间产物，还存在在13位引入羟基的单羟基衍生物(图5b)。对于在实施例【1-2】中纯化和分离的具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质，让2、6和10ku/ml的该蛋白质和100μm二十二碳六烯酸(dha)在ph7、室温下彼此反应30分钟，加入1m硼氢化钠还原反应产物，使终浓度为50mm，加入5μl/ml乙酸终止反应，然后分析反应产物中的化合物类型。结果，如图3b所示，证实了具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质不仅可以产生引入dha中的一个羟基的单羟基衍生物和引入两个羟基的二羟基衍生物，而且可以产生引入三个羟基的三羟基衍生物和引入四个羟基的四羟基衍生物。另外，对反应产物进行nmr分析。具体来说，由二十二碳六烯酸转化的单、二、三或四羟基衍生物是由c、o和h组成的有机物质，而使用800mhznmr(bruker)通过测量这些化学物质之间的化学位移值来分析结构。nmr测定用溶剂使用氢被氘(deuterium)取代的d4-甲醇，在绝对温度298k下进行测定。构成单或二羟基衍生物的氢和碳通过使用1dnmr(1h，13c)和2dnmr(1h-1hcosy、edited-qc、hmbc、tocsy、roesy)测量(图4c-4e)。结果，如图5c至5e所示，证实了具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质具有引入到dha的7、15、16和17位的羟基，从而产生四羟基衍生物(图5c)。在该过程中，证实了作为中间产物，还存在具有引入17位的羟基的单羟基衍生物(图5d)和具有引入7和17位的羟基的二羟基衍生物(图5e)。相反，在大豆15lox的情况下，如图6所示，证实了仅一个或两个羟基可以被引入二十二碳六烯酸，并且没有产生引入三个或四个羟基的衍生物。【实施例3】蛋白质的氨基酸序列分析对于具有seqidno:1的氨基酸序列和seqidno:2的氨基酸序列的、其中如实施例2中确认了酶的活性的蛋白质，与人12lox、人15lox、人5lox、马铃薯lox、大豆15lox和红藻phlox(其为具有相似活性的脂氧合酶)相比，进行了氨基酸序列的同源性分析和系统分析。结果，确认了具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质与大豆15lox具有21％、与人5lox具有26％、与人12lox具有23％、与人15lox具有25％、与马铃薯lox具有23％、与红藻phlox具有21％，的序列同源性。此外，确认了具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质与大豆15lox具有21％、与人5lox具有26％、与人15lox具有25％、与马铃薯lox具有23％、与红藻phlox具有21％，的序列同源性。另外，作为基于其的系统分析结果，具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质和具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质被分类为与人15lox、人5lox、马铃薯lox、大豆15lox和红藻phlox完全不同的系统，如图7所示。另外，确认了在具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质中，用于结合膜脂的n端区域缺失，而c端区域与一般的脂氧化酶具有高的相似性。确认了存在与铁离子结合的残基，如his,his,his和asn/ser，以及与末端氨基酸结合的残基，并且存在与酶的羟基化特性密切相关的ala。另外，对具有seqinno:1所示的氨基酸序列的蛋白质的二级结构进行分析，结果确认了α螺旋、延伸链和无规卷曲分别以下述表2所示的比例存在。【表2】另一方面，在具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质中，证实了用于结合膜脂的n端区域缺失。另一方面，证实了在c端区域存在结合铁离子的残基，如his,his,his和asn/ser，和与末端氨基酸结合的残基，并且存在与酶的羟基化特性密切相关的ala。另外，对具有seqidno:2所示的氨基酸序列的蛋白质的二级结构进行分析，结果确认了α螺旋、延伸链和无规卷曲分别以下述表3所示的比例存在。【表3】【实施例4】影响蛋白质酶活性的条件的确认对于实施例【1-2】中纯化分离的具有seqidno:1所示的氨基酸序列的蛋白质和具有seqidno:2所示的氨基酸序列的蛋白质，确认了对各蛋白质的酶活性产生影响的条件。【4-1】ph值的影响为了确认ph值的作用，让10ku/ml实施例【1-2】中纯化和分离的具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质和100μm亚油酸在ph7至ph11、温度25℃下彼此反应30分钟，加入1m硼氢化钠还原反应产物，使终浓度为50mm，然后加入5μl/ml乙酸完成反应。此时，分别在ph7.0时使用50mm的磷酸钠缓冲液(sodiumphosphatebuffer)，在ph8.0时使用50mm的tris-hcl缓冲液和在ph9.0至ph11.0时使用50mm的硼酸钠缓冲液(sodiumboratebuffer)。以与实施例【3-1】相同的方式，测量反应产物中13s-羟基十八碳二烯酸的浓度，并将其相对值相互比较。结果，如图8a所示，证实了具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质越接近ph8.0，具有越好的酶活性。另外，让10ku/ml实施例【1-2】中纯化和分离的具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质和100μm亚油酸在ph6至ph11、温度25℃下彼此反应30分钟，加入1m硼氢化钠还原反应产物，使终浓度为50mm，然后加入5μl/ml乙酸完成反应。此时，分别在ph7.0时使用50mm的磷酸钠缓冲液，在ph8.0时使用50mm的tris-hcl缓冲液和在ph9.0至ph11.0时使用50mm的硼酸钠缓冲液。以与实施例【3-1】相同的方式，测量反应产物中13s-羟基十八碳二烯酸的浓度，并将其相对值相互比较。结果，如图8b所示，证实了具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质越接近ph8.0，具有越好的酶活性。【4-2】温度的影响为了证实温度的影响，让50ku/ml实施例【1-2】中纯化和分离的具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质和100μm亚油酸在ph7、20℃至50℃的温度下彼此反应30分钟，加入1m硼氢化钠还原反应产物，使终浓度为50mm，然后加入5μl/ml乙酸完成反应。以与实施例【3-1】相同的方式，测量反应产物中13s-羟基十八碳二烯酸的浓度，并将其相对值相互比较。结果，如图9a所示，证实具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质越接近20℃，具有越好的酶活性。另外，让10ku/ml实施例【1-2】中纯化和分离的具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质和100μm亚油酸在ph7、温度20至50℃下彼此反应30分钟，加入1m硼氢化钠还原反应产物，使终浓度为50mm，然后加入5μl/ml乙酸完成反应。以与实施例【3-1】相同的方式，测量反应产物中13s-羟基十八碳二烯酸的浓度，并将其相对值相互比较。结果，如图9b所示，证实了具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质越接近30℃，具有越好的酶活性。【4-3】最佳条件下的反应速率在上述【4-1】和【4-2】中确认的最佳条件下，研究了具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质和具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质的km和kcat值。即，在ph8.0、20℃的环境中进行具有seqidno:1的氨基酸的蛋白质的反应，在ph7.0和30℃的环境中进行具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质的反应，其结果示于表4中。【表4】蛋白质km(μm)kcat(min-1)具有seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质46.82±1.023.52±1.0具有seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质79.43±0.80.4±0.02【实施例5】通过本发明蛋白质的酶活性产生的多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物抑制癌症干细胞增殖的作用的确认在上述实施例【3-2】中，分别分离和纯化了通过将二十二碳六烯酸羟基化成具有本发明的seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质而获得的二羟基衍生物和通过将二十二碳六烯酸羟基化成具有本发明的seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质而获得的三羟基衍生物。将纯化的衍生物对人乳腺癌细胞和人乳腺癌来源的癌症干细胞进行处理，然后确认其效果。更具体地说，首先，将人乳腺癌细胞mda-mb-231(atcc)以1×106细胞的密度在10cm培养皿中与加入了10％胎牛血清(fbs，hyclone)、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(5％二氧化碳，37℃)的dmem培养基一起培养。人乳腺癌细胞mda-mb-231以0.5至1×104细胞的密度在含有2ml完全mammoculttm培养基(加拿大stemcelltechnologies)的超低附着6孔板(ultra-lowattachment6-wellplate)中培养，所述培养基中加入4μg/ml肝素、0.48μg/ml氢化可的松、100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(5％二氧化碳，37℃)，以形成人乳腺癌衍生的癌症干细胞的乳腺球(mammosphere)。对于如上所述获得的人乳腺癌细胞mda-mb-231和人乳腺癌来源的癌干细胞的乳腺球，分别在0至60μm的浓度下进行处理，所述处理是用实施例【3-2】中的通过具有本发明seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质将二十二碳六烯酸羟基化获得的二羟基衍生物和通过具有本发明seqidno:2的氨基酸序列的蛋白质将二十二碳六烯酸羟基化获得的三羟基衍生物处理。结果，如图10a所示，确认了通过具有本发明的seqidno:1的氨基酸序列的蛋白质将二十二碳六烯酸羟基化获得的二羟基衍生物，抑制了来源于乳腺癌的癌症干细胞的乳腺球的增殖，但即使是相同浓度的二羟基衍生物，对乳腺癌细胞的增殖没有影响。另外，如图10b所示，确认了通过具有本发明的seqidno:2所示的氨基酸序列的蛋白质将二十二碳六烯酸羟基化获得的三羟基衍生物，在浓度40μm或以上，抑制了来源于乳腺癌的癌症干细胞的乳腺球的增殖，但即使是相同浓度的三羟基衍生物，对乳腺癌细胞的增殖没有影响。如上所述，尽管已经示例性地描述了本发明的优选实施例，但是本发明的范围并不仅限于上述特定实施例，并且本领域技术人员将能够在本发明的所附权利要求内适当地修改本发明。<110>韩国生命工学研究院（korearesearchinstituteofbioscience&biotechnology）<120>多不饱和脂肪酸的多羟基衍生物的制备方法（methodforproducingmulti-hydroxyderivativesofpolyunsaturatedfattyacid）<130>2019opa2339pct<150>kr10-2018-0043972<151>2018-04-16<150>kr10-2018-0051695<151>2018-04-06<150>kr10-2018-0142895<151>2018-11-19<150>kr10-2018-0142896<151>2018-11-19<160>6<170>patentin3.0<210>1<211>571<212>prt<213>人工序列<220><223>k9v_a296g<400>1metvalaspasnmetlysproserleuproglnaspaspproasngln151015gluglnarglysaspserleuasnargglnglnglnalatyrglnphe202530asptyrgluserleuserproleualaleuleulysasnvalproala354045valgluasnpheserserlystyrileglygluargileleualathr505560sergluleuproalaasnmetleualaalaaspserargthrpheleu65707580aspproleuaspgluleuglnasptyrgluaspphephethrleuleu859095proleuproalavalalalysiletyrglnthraspargserpheala100105110gluglnargleuserglyalaasnprometvalleuargleuleuasp115120125alaglyaspproargalaglnthrleualaglnileserserphehis130135140proleupheaspleuglyglngluleuglnglnlysasniletyrval145150155160alaasptyrthrglythraspgluhistyrargalaproserlysile165170175glyglyglysertyrglulysglyarglyspheleuprolysproarg180185190alaphephealatrpargtrpthrglyileargaspargglyglumet195200205thrproilealaileglnleuaspprothrproaspserhisvaltyr210215220thrpropheaspproprovalasptrpleuphealalysleucysval225230235240glnvalalaaspalaasnhishisglumetserserhisleuglyarg245250255thrhisleuvalmetgluproilealailevalthralaargglnleu260265270alaglnasnhisproleuserleuleuleulysprohispheargphe275280285metleuthrasnasngluleuglyargsertyrleuilealaprogly290295300glyprovalaspgluleuleuglyglythrleuprogluthrmetglu305310315320ilealaargglualacysserthrtrpserleuaspgluphealaleu325330335proalagluleulysasnargglymetaspaspthrasnglnleupro340345350histyrprotyrargaspaspglyleuleuleutrpaspalaileglu355360365thrphevalserglytyrleulysphephetyrprothrgluileala370375380ilevalglnaspvalgluleuglnthrtrpalaglngluleualaser385390395400aspargglyglylysvallysglymetproproargileasnthrval405410415gluglnleuilelysilevalthrthrileilephethrcysglypro420425430glnhisseralavalasnpheproglntyrglutyrmetserpheala435440445alaasnmetproleualaalatyrargaspileprolysilethrala450455460serglyasnleugluvalilethrglulysaspileleuargleuleu465470475480proprotyrlysargalaalaaspglnleulysileleuphethrleu485490495seralatyrargtyraspargleuglytyrtyrasplysserphearg500505510gluleutyrargmetserpheaspgluvalphealaglythrproile515520525glnleuleualaargglnpheglnglnasnleuasnmetalaglugln530535540lysileaspalaasnasnglnlysargvalileprotyrilealaleu545550555560lysproserleuvalileasnserilesermet565570<210>2<211>571<212>prt<213>人工序列<220><223>酶(k9v)<400>2metvalaspasnmetlysproserleuproglnaspaspproasngln151015gluglnarglysaspserleuasnargglnglnglnalatyrglnphe202530asptyrgluserleuserproleualaleuleulysasnvalproala354045valgluasnpheserserlystyrileglygluargileleualathr505560sergluleuproalaasnmetleualaalaaspserargthrpheleu65707580aspproleuaspgluleuglnasptyrgluaspphephethrleuleu859095proleuproalavalalalysiletyrglnthraspargserpheala100105110gluglnargleuserglyalaasnprometvalleuargleuleuasp115120125alaglyaspproargalaglnthrleualaglnileserserphehis130135140proleupheaspleuglyglngluleuglnglnlysasniletyrval145150155160alaasptyrthrglythraspgluhistyrargalaproserlysile165170175glyglyglysertyrglulysglyarglyspheleuprolysproarg180185190alaphephealatrpargtrpthrglyileargaspargglyglumet195200205thrproilealaileglnleuaspprothrproaspserhisvaltyr210215220thrpropheaspproprovalasptrpleuphealalysleucysval225230235240glnvalalaaspalaasnhishisglumetserserhisleuglyarg245250255thrhisleuvalmetgluproilealailevalthralaargglnleu260265270alaglnasnhisproleuserleuleuleulysprohispheargphe275280285metleuthrasnasngluleualaargsertyrleuilealaprogly290295300glyprovalaspgluleuleuglyglythrleuprogluthrmetglu305310315320ilealaargglualacysserthrtrpserleuaspgluphealaleu325330335proalagluleulysasnargglymetaspaspthrasnglnleupro340345350histyrprotyrargaspaspglyleuleuleutrpaspalaileglu355360365thrphevalserglytyrleulysphephetyrprothrgluileala370375380ilevalglnaspvalgluleuglnthrtrpalaglngluleualaser385390395400aspargglyglylysvallysglymetproproargileasnthrval405410415gluglnleuilelysile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