多奈必利作为治疗神经退行性疾病中的神经保护剂

本发明涉及神经退行性疾病的治疗。神经退行性疾病是指由于神经细胞的系统性变性和蜕膜脱落而导致的神经回路神经网络崩溃而引起的疾病，它们被称为各种顽固性疾病，例如阿尔茨海默病(ad)；帕金森病；路易斯体痴呆；血管性痴呆以及包括(i)非认知神经变性、(ii)非认知神经肌肉变性和(iii)运动感觉神经变性的与衰老相关的问题；亨廷顿病；运动神经元疾病；包括肌萎缩性侧索硬化症(als)；唐氏综合征；皮质基底神经节变性；多系统萎缩；脑萎缩；少突性小脑萎缩；核上性麻痹；弗里德里希共济失调；2型脊髓小脑共济失调；额颞叶变性(ftd)和原发性进行性失语症。神经退行性疾病的临床症状根据疾病的不同，从轻度到重度不等。它们包括震颤、僵硬、运动障碍、运动功能减退、动作迟缓、态度反射衰竭、自主神经失调、搏动、步态障碍、抑郁症、冷漠、精神错乱、学习障碍、记忆力减退、认知障碍、肌萎缩症、肌肉萎缩、肩带失调、关节运动障碍、吞咽困难、呼吸障碍、麻木、瘫痪和痴呆，这是进行日常活动的主要障碍。神经退行性死亡是一个复杂的机制，可能是由于当表达、活性和/或调节出现问题时会触发神经退行性疾病的多个分子基团所致。这可以解释为什么到目前为止尚未建立抑制或逆转神经变性的有效方法。除了消除此类疾病的病因外，重建神经网络也很重要。例如，已经说过，在淀粉样β肽的细胞毒性被认为是病因的阿尔茨海默病中，神经突的萎缩和突触的减少都触发了神经功能的恶化，反之，即使在触发后，如果可能被活化以延伸神经突以恢复突触，则可以恢复未完全变性或在没有变性的情况下存活的神经细胞。因此，迫切需要能够保护神经突但还能够增加神经突生长并促进新突触形成的新药剂，以预防和治疗神经退行性疾病。本发明满足了这一需求。实际上，本发明是由于发明人的以下出乎意料的发现而产生的，即国际申请wo2014195593中公开的多奈必利(donecopride)化合物具有神经保护活性，因为它不仅能够减少tau的过度磷酸化、增加神经突的生长、维持突触率，而且最重要和出乎意料的是促进新突触的形成。由于这种对神经突的一般有效保护作用，多奈必利化合物是一种非常有前景的神经保护剂，可用于预防和/或治疗任何涉及神经突变性的神经退行性疾病。在许多神经退行性疾病模型中，尤其是在阿尔茨海默病模型、帕金森病模型、肌萎缩性侧索硬化模型、亨廷顿病模型和由缺血或脑外伤引起的神经退行性疾病模型中，大量的下述通式(i)的化合物进一步证实了这种作用。因此，本发明涉及下式(i)的化合物以及其对映异构体或非对映异构体及其外消旋体、其酸盐、其水合物或其溶剂化产物，在预防和/或治疗神经退行性疾病中用作神经保护剂的用途：其中：x代表氢原子，或卤素原子(hal)，其中(hal)为氟、氯、溴或碘，或直链或支链的cp(hal)2p+1多卤代烷基，其中p＝1、2、3或4，(hal)具有与上述相同的含义；y代表氧原子，或硫原子，或n-r″基团，其中r″表示氢原子，-oh基团，-o-a基团，其中a表示直链或支链的c1-c6烷基，特别是其中a表示甲基；或直链或支链的cq(hal)2q+1烷基，其中q＝1、2、3或4；m是选自1、2和3的整数；n是选自0、1、2和3的整数；r和s是整数，其值为：r＝s＝0；或r＝s＝1；或r＝s＝2；或r＝0且s＝1；或最后r＝0且s＝2；r代表氢原子，或能够带有一个或多个f原子的直链或支链的c1-c5烷基；r'代表支链的c1-c6烷基，或c3-c10环烷基或c5-c13双环基团，其能够带有一个或多个r基团，并具有氧原子、或可以被r取代的氮原子、或硫原子或基团-so2-或–so-。技术实现要素：化合物在本发明的上下文中使用的化合物是下式(i)的化合物以及其对映异构体或非对映异构体及其外消旋体、其酸盐、其水合物或其溶剂化产物：其中：x代表氢原子，或卤素原子(hal)，其中(hal)为氟、氯、溴或碘，或直链或支链的cp(hal)2p+1多卤代烷基，其中p＝1、2、3或4，(hal)具有与上述相同的含义；y代表氧原子，或硫原子，或n-r″基团，其中r″表示氢原子、-oh基团、-o-a基团，其中a表示直链或支链的c1-c6烷基，特别是其中a表示甲基；或直链或支链cq(hal)2q+1烷基，其中q＝1、2、3或4；m是选自1、2和3的整数；n是选自0、1、2和3的整数；r和s是整数，其值为：r＝s＝0；或r＝s＝1；或r＝s＝2；或r＝0且s＝1；或最后r＝0且s＝2；r代表氢原子，或能够带有一个或多个f原子的直链或支链的c1-c5烷基；r'代表支链的c1-c6烷基，或c3-c10环烷基或c5-c13双环基团，其能够带有一个或多个r基团，并具有氧原子、或可以被r取代的氮原子、或硫原子或基团-so2-或–so-。在特定实施方式中，在式(i)中，y表示氧原子，或硫原子，或n-r″基团，其中r″代表氢原子，-oh基团或直链或支链的cqh2q+1烷基，其中q＝1、2、3或4。在特定实施方式中，在式(i)中，x表示卤素原子，特别是氯或氟，更特别是氯，最特别是氟。在另一特定实施方式中，在式(i)中，y表示氧原子。在另一特定实施方式中，在式(i)中，m，n，r和s的值均为1。在另一特定实施方式中，在式(i)中，r代表h、ch3、ch2ch3或ch2-ch2f。优选地，r代表ch3。在另一特定实施方式中，在式(i)中，r'表示选自由以下基团组成的组中的基团：环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基，4-哌啶和-ch2nhso2ch3。在另一特定实施方式中，在式(i)中，r'表示选自由以下基团组成的组中的基团：环丙基，环丁基，环戊基，环己基，4-哌啶和-ch2nhso2ch3。优选地，在式(i)中，r'表示选自由以下基团组成的组中的基团：环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和4-哌啶基。优选地，在式(i)中，r'表示选自由以下基团组成的组中的基团：环丙基，环丁基，环戊基，环己基和4-哌啶基。仍优选地，r'代表c4-c7环烷基。仍优选地，r'代表环戊基，环己基，环庚基或2-哌啶基。更优选地，r'代表环戊基。仍优选地，r'代表环己基。仍优选地，r'代表2-哌啶基。最优选地，r'代表环庚基。在另一特定实施方式中，在式(i)中，r代表ch3且r'代表c4-c7环烷基，特别是环己基。在另一特定实施方式中，在式(i)中，r代表ch3且r'代表c4-c7环烷基，特别是环戊基。在另一特定实施方式中，在式(i)中，r代表ch3且r'代表c4-c7环烷基，特别是2-哌啶基。在另一特定实施方式中，在式(i)中，r代表ch3且r'代表c4-c7环烷基，特别是环庚基。在特别优选的实施方式中，在式(i)中，x代表氯，y代表氧原子，m、n、r和s的值均为1，r代表ch3且r'代表环己基。换句话说，在特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是下式(ii)的多奈必利化合物：在另一特别优选的实施方式中，在式(i)中，x代表氟，y代表氧原子，m、n、r和s的值均为1，r代表ch3且r'代表环己基。换句话说，在特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是下式(iii)的氟哌利德化合物：在另一特别优选的实施方式中，在式(i)中，x表示氯，y表示氧原子，m、n、r和s的值均为1，r表示ch3且r'表示2-哌啶基。换句话说，在特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是下式(iv)的mr31176化合物：在另一特别优选的实施方式中，在式(i)中，x代表氟，y代表氧原子，m、n、r和s的值均为1，r代表ch3且r'代表环戊基。换句话说，在特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是下式(v)的mr33583化合物：在另一特别优选的实施方式中，在式(i)中，x代表氯，y代表氧原子，m、n、r和s的值均为1，r代表ch3且r'代表环戊基。换句话说，在特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是下式(vi)的mr31172化合物：在另一特别优选的实施方式中，在式(i)中，x代表氟，y代表氧原子，m、n、r和s的值均为1，r代表ch3且r'代表环庚基。换句话说，在特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是下式(vii)的mr36014化合物：在另一最优选的实施方式中，在式(i)中，x代表氯，y代表氧原子，m、n、r和s的值均为1，r代表ch3且r'代表环庚基。换句话说，在特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是下式(viii)的mr31192化合物：在另一特定的实施方式中，x代表氯，y代表n-r”基，其中r”代表-o-a基，其中a代表甲基，m、n、r和s的值均为1，r代表ch3且r'代表环己基。换句话说，在特定的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是2-氯-4-[[2-[1-(环己基甲基)-4-哌啶基]乙基]-n-甲氧基碳亚氨基]-5-甲氧基苯胺化合物。在特定的实施方式中，使用上述定义的化合物的酸盐。在更具体的实施方式中，所述酸盐是富马酸盐或二盐酸盐。更特别地，在特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是富马酸多奈哌利德(donecopridefumarate)(具有以上式(ii))，特别是富马酸多奈哌利德水合物。在另一特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是富马酸氟必利(fluocopridefumarate)(具有以上式(iii))。在另一特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是二盐酸盐mr31176(具有以上式(iv))，特别是二盐酸盐mr31176二水合物。在另一特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是富马酸mr33583(具有以上式(v))。在另一特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是富马酸mr31172(具有以上式(vi))。在另一特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是富马酸mr36014(具有以上式(vii))。在另一个特别优选的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是富马酸mr31192(具有以上式(viii))。神经退行性疾病“神经退行性疾病”在本文中是指基于神经细胞的系统性变性和蜕膜脱落而由神经回路神经网络的崩溃引起的疾病。如上所述，本发明人证明了多奈必利对神经突显示出一般有效的保护作用。由于这种一般的神经保护作用，多奈必利可用作预防和/或治疗任何神经退行性疾病的神经保护剂。发明人进一步在许多神经退行性疾病模型中用大量的上述通式(i)的化合物，尤其是以上“化合物”部分中具体定义的化合物，证实了这种作用，所述神经退行性疾病模型特别是阿尔茨海默病模型、帕金森病模型、肌萎缩性侧索硬化模型、亨廷顿病模型以及由局部缺血或脑外伤引起的神经退行性疾病模型。神经退行性疾病的实例包括阿尔茨海默病(ad)；帕金森病；路易斯体痴呆；血管性痴呆；以及包括(i)非认知神经变性，(ii)非认知神经肌肉变性和(iii)运动感觉神经变性的与衰老相关的问题；亨廷顿病；包括肌萎缩性侧索硬化症(als)的运动神经元疾病；唐氏综合征；皮质基底神经节变性；多系统萎缩；脑萎缩；少脑小脑萎缩；核上性麻痹；腓特烈共济失调；脊髓小脑2型；额颞叶变性(ftd)和原发性进行性失语症。在特定的实施方式中，神经退行性疾病选自由阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、多系统萎缩、包括肌萎缩性侧索硬化的运动神经元疾病、唐氏综合征和额颞叶变性组成的组。在更具体的实施方式中，神经退行性疾病选自由阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化症组成的组。在另一实施方式中，神经退行性疾病是阿尔茨海默病。在替代实施方式中，神经退行性疾病是不是阿尔茨海默病的神经退行性疾病。在所述替代实施方式中，神经退行性疾病选自由帕金森病、亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化症组成的组。医学适应症本发明涉及如上文“化合物”部分所定义的化合物在预防和/或治疗上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病中用作神经保护剂。本发明还涉及如上文“化合物”部分所定义的化合物在制备用于预防和/或治疗如上文“神经退行性疾病”所定义的神经退行性疾病的神经保护剂中的用途。本发明还涉及一种预防和/或治疗上述“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病的方法，包括向有需要的受试者给药治疗有效量的如上文“化合物”部分中所定义的作为神经保护剂的化合物。本发明进一步涉及一种对患有如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病或有遭受如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病风险的受试者进行神经保护的方法，其包括向所述受试者给药治疗有效量的上文“化合物”部分所定义的化合物。根据本发明，术语“受试者”或“有需要的受试者”旨在用于受到或可能受到如上文“神经退行性疾病”部分中所定义的神经退行性疾病影响的人类或非人类哺乳动物。在本发明的上下文中，术语“治疗(treating/treatment)”是指逆转、减轻或抑制该术语所适用的失调或病症，或该失调或病症的一种或多种症状的进展。在本发明的上下文中，术语“预防(preventing/prevention)”是指延迟或预防该术语所适用的失调或病症，或该失调或病症的一种或多种症状的发作。“神经保护”在本文中是指预防或抑制中枢神经系统中的变性作用和神经元完整性的恢复，特别是预防或抑制神经元变性。“神经保护剂”在本文中是指能够进行如上文所定义的神经保护的药剂。发明人更具体地证明，在本发明的上下文中使用的化合物能够增加神经突生长，维持突触率，减少tau过度磷酸化和/或促进新突触的形成。因此，在特定的实施方式中，如上文“化合物”部分所定义的化合物用于增加神经突生长。本发明还涉及一种用于增加患有如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病或有遭受如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病风险的受试者的神经突生长的方法，包括向所述受试者给药治疗有效量的如上文“化合物”部分所定义的化合物。“神经突生长”在本文中是指从神经元的细胞体和相关的突触发生进行的任何突起的延伸过程。“增加神经突生长”在本文中是指与在相同条件下但未给药目的化合物观察到的神经突生长相比，给药目的化合物时，神经突的生长是更高的(即更有效，更快或更长时间)，优选地统计学意义上显著更高。优选地，与在相同条件下但未给药目的化合物观察到的神经突的生长相比，神经突的生长增加至少120％。在另一特定的实施方式中，如上文“化合物”部分所定义的化合物用于维持突触率。本发明的另一目的涉及一种用于针对患有如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病或有遭受如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病风险的受试者维持突触率的方法，包括向所述受试者给药治疗有效量的如上文“化合物”部分所定义的化合物。“突触率”在本文中是指突触数量与神经元数量之比。“维持突触率”在本文中是指与在对照条件下观察到的突触率相比，当给药目的化合物时，突触率是相似的(即，统计学上没有显著不同)，所述对照条件例如相同的但不给药目的化合物的条件，或神经元不面对神经退行性条件的条件。在另一特定的实施方式中，如上文“化合物”部分所定义的化合物用于促进新突触的形成。本发明的另一目的涉及一种用于针对患有如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病或有遭受如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病风险的受试者促进新突触形成的方法，包括向所述受试者给药治疗有效量的如上文“化合物”部分所定义的化合物。“促进新突触的形成”在本文中是指与在相同条件下但未给药目的化合物观察到的新形成的突触的数量相比，当给药目的化合物时，新形成的突触的数量更高，优选统计学意义上显著更高。优选地，与在相同条件下但未给药目的化合物观察到的新突触的形成相比，新突触的形成增加了至少120％。在另一特定的实施方式中，如上文“化合物”部分所定义的化合物用于减少tau过度磷酸化。本发明的另一个目的涉及一种用于针对患有如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病或有遭受如上文“神经退行性疾病”部分所定义的神经退行性疾病风险的受试者减少tau磷酸化的方法，包括向所述受试者给药治疗有效量的如上文“化合物”部分所定义的化合物。“tau过度磷酸化”在本文中是指tau蛋白的磷酸化异常高，特别是thr39、ser46、thr50、ser68、thr69、thr71、ser113、thr153、thr175、thr181、ser184、ser185、ser191、ser198、ser199、ser202、thr205、ser208、ser210、thr212、ser214、thr217、thr231、ser235、ser237、ser238、ser241、ser258、ser262、ser285、ser289、ser305、ser324、ser352、ser356、tyr394、ser396、ser400、thr403、ser404、ser409、ser412、ser413、thr414、ser416、ser422、ser433和ser435残基中的至少一种的tau蛋白的磷酸化异常。“减少tau过度磷酸化”在本文中是指tau蛋白的thr39，ser46，thr50，ser68，thr69，thr71，ser113，thr153，thr175，thr181，ser184，ser185，ser191，ser198，ser199，ser202，thr205，ser208，ser210，thr212，ser214，thr217，thr231，ser235，ser237，ser238，ser241，ser258，ser262，ser285，ser289，ser305，ser324，ser352，ser356，tyr394，ser396，ser400，thr403，ser404，ser409，ser412，ser413，thr414，ser416，ser422，ser433和ser435残基中的至少一种，特别是ser212和thr214残基中的一种在给药目的化合物时是未异常磷酸化的，而所述残基在相同条件但不给药目的化合物时是异常磷酸化的。“治疗有效量”在本文中是指足够量的化合物以适用于任何医学治疗的合理获益/风险比作为治疗和/或预防神经退行性疾病的神经保护剂。但是，应该理解，本发明化合物的每日总用量将由主治医师在合理的医学判断范围内决定。任何特定受试者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括正在治疗的疾病和疾病的严重程度，所用特定化合物的活性，受试者的年龄、体重、总体健康状况、性别和饮食，给药时间，给药途径和所用特定化合物的排泄率，治疗的持续时间，与所使用的特定化合物联合使用或同时使用的药物，以及医学领域众所周知的类似因素。例如，以低于获得所需治疗效果所需的剂量开始所述化合物的剂量，并逐渐增加剂量直至获得所需效果，这在本领域技术范围内是知晓的。在本发明的上下文中使用的化合物可以以药物组合物的形式给药，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和任选的持续释放基质，例如可生物降解的聚合物，以形成治疗组合物。“药学上”或“药学上可接受的”是指在适当地给药于哺乳动物，特别是人时，不会产生不良反应、过敏反应或其他不想要的反应的分子实体和组合物。药学上可接受的载体或载体是指任何类型的无毒固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或制剂助剂。包括在本发明的上下文中使用的化合物的药物组合物的形式和给药途径自然取决于待治疗的病症、疾病的严重程度、患者的年龄、体重和性别等。可将本发明上下文中使用的化合物配制成用于局部、口服、肠胃外、鼻内、静脉内、肌内、皮下或眼内给药等。在具体的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物是口服给药的。供选择地，包括在本发明的上下文中使用的化合物的药物组合物可以包含对于能够被注射的制剂而言是药学上可接受的载体。这些尤其可以是等渗的无菌盐溶液(磷酸二氢钠或磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或此类盐的混合物)，或干燥的、特别是冷冻干燥的组合物，其根据情况添加灭菌水或生理盐水后，可以构成可注射溶液。为了制备药物组合物，可以将有效量的本发明上下文中使用的化合物溶解或分散在药学上可接受的载体或水性介质中。适用于注射用途的药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉剂。在所有情况下，该形式都必须是无菌的，并且必须具有一定的流动性，以达到易于注射的目的。它必须在生产和储存条件下保持稳定，并且必须进行防腐以防微生物(例如细菌和真菌)的污染。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适的混合物。在分散的情况下，可以例如通过使用包衣(例如卵磷脂)，通过维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂、稳定剂、防冻剂或抗氧化剂来维持适当的流动性。可以通过抗细菌剂和抗真菌剂来预防微生物的作用。在许多情况下，最好包括等渗剂，例如糖或氯化钠。通过将所需量的活性化合物与所需的上述几种其他成分掺入适当的溶剂中，然后过滤灭菌来制备无菌注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分掺入无菌载体中来制备分散液，所述无菌载体包含基本分散介质和以上列举的那些所需的其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。配制后，将以与剂型相容的方式和治疗有效量给药溶液。所述制剂易于以多种剂型给药，例如上述可注射溶液的类型，但是也可以使用药物释放胶囊等。例如，对于在水溶液中的肠胃外给药，如果需要，溶液应该适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。就此而言，根据本发明，本领域技术人员将知道可以使用的无菌水性介质。例如，一种剂量可以溶解在1ml等渗nacl溶液中，或者添加到1000ml皮下注射液中，或者在建议的输注部位注射(例如，参见“雷明登氏药学全书(remington'spharmaceuticalsciences)”第15版，第1035-1038页)和1570-1580)。剂量的某些变化将必然发生，这取决于要治疗的受试者的状况。在任何情况下，负责给药的人员将确定适用于个体受试者的适当剂量。在本发明的上下文中使用的化合物通常可以被口服给药，例如通过口服或舌下途径服用的片剂、胶囊剂、微胶囊剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、溶液剂或混悬剂形式。在具体的实施方式中，在本发明的上下文中使用的化合物适合以1至20mg/kg体重的日剂量，特别是以2mg/kg的日剂量口服给药。在另一具体的实施方式中，本发明上下文中使用的化合物适合每周两次以1至20mg/kg体重的剂量口服给药，特别是每周两次以1mg/kg体重的剂量口服给药。根据另一特定的实施方式，在本发明的上下文中使用的化合物以每天10至1000mg的剂量给药，优选以每天5次以0.2至2mg的剂量给药。下面的附图和实施例将进一步说明本发明。附图说明图1：mr31193对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元的存活(a)，总神经突网络(b)，通过神经元数量归一化的神经突长度(c)，以及tau(at100)的磷酸化(d)的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图2：mr31193对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元突触保存的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图3：mr31176对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元的存活(a)，总神经突网络(b)，通过神经元数量归一化的神经突长度(c)，以及tau(at100)的磷酸化(d)的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图4：mr31176对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元突触保存的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图5：mr31192对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元的存活(a)，总神经突网络(b)，通过神经元数量归一化的神经突长度(c)，以及tau(at100)的磷酸化(d)的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图6：mr31192对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元突触保存的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图7：mr33583对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元的存活(a)，总神经突网络(b)，通过神经元数量归一化的神经突长度(c)，以及tau(at100)的磷酸化(d)的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图8：mr33583对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元突触保存的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图9：mr31192或多奈哌齐对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元的存活(a)，总神经突网络(b)，通过神经元数量归一化的神经突长度(c)，以及tau(at100)的磷酸化(d)的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图10：mr31192或多奈哌齐对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元突触保存的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图11：mr36014或多奈哌齐对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元的存活(a)，总神经突网络(b)，通过神经元数量归一化的神经突长度(c)，以及tau(at100)的磷酸化(d)的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图12：mr36014或多奈哌齐对aβ1-42损伤的海马神经元原代培养物中map-2神经元突触保存的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图13：mr36014对受mpp+损伤的中脑神经元原代培养中th神经元的存活(a)，th神经元的总神经突网络(b)和th神经元中asyn的聚集(c)的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图14：mr33583对受mpp+损伤的中脑神经元原代培养物中th神经元的存活(a)，th神经元的总神经突网络(b)和th神经元中asyn的聚集的影响(c)。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图15：mr36014(a-b)和mr33583(c-d)对谷氨酸盐损伤的皮质神经元原代培养物中map-2神经元(a-c)的存活和总神经元网络(b-d)的保护的影响。结果表示为占对照的百分比，以平均值±sem表示(n＝4-6/组)。单因素方差分析，然后进行lsdfisher检验。*p<0.05被认为是显著的。图16：mr36014对谷氨酸盐损伤后脊髓运动神经元的存活(a)和神经突网络(b，c)的影响。结果表示为占对照的百分比，显示为平均值±sem(100％＝ct，无化合物)。单因素方差分析，然后进行fisherlsd检验，n＝4-6。p<0.05被认为是显著的。图17：mr33583对谷氨酸盐损伤后脊髓运动神经元的存活(a)，神经突网络(b，c)和tdp-43的胞质易位(d)的影响。结果表示为占对照的百分比，显示为平均值±sem(100％＝ct，无化合物)。单因素方差分析，然后进行fisherlsd检验，n＝4-6。p＜0.05被认为是显著的。图18：mr33583对剥夺生长因子后的中脑细胞原代培养物中gaba能神经元存活的影响。结果表示为占对照的百分比，显示为平均值±sem(100％＝ct，无化合物)。单因素方差分析，然后进行fisherlsd检验，n＝4-6。p＜0.05被认为是显著的。实施例实施例1本实施例显示了多奈必利对aβ损伤的大鼠原代海马神经元的作用(24h暴露)。阿尔茨海默病(ad)是一种神经退行性疾病，主要影响65岁以上的人，患有不同的临床症状，例如思维、语言和学习能力的逐步下降。来自各种来源的越来越多的证据表明，a患低聚物(a聚物)/原纤维是ad发病机理中的推定毒性物种。通过产生aβo溶液并利用aβo的浓度和暴露时间，可以再现早期效应(氧化应激)和结构改变的长期发展(神经元死亡)。本实施例中使用的模型使用含有aβo的aβ肽溶液(通过自动蛋白质印记(westernblot)精确测量)，再现了ad的基本神经病理学特征。这项研究的目的是评估一种测试化合物(富马酸多奈必利，在几种浓度下)对aβ损伤的大鼠原代海马神经元(24h暴露)的影响。下式的多奈哌齐：(一种浓度)被用作参考测试化合物。材料和方法海马神经元的原代培养如callizot等人(2013)神经系统科学杂志(j.neurosci.res.)91706-716.所描述的培养大鼠海马神经元。将妊娠17天的雌性妊娠大鼠(wistar大鼠；janvier实验室，法国)在co2室中深度麻醉，然后颈脱位法处死。然后，将胎儿从子宫中取出，并立即置于冰冷的l15leibovitz培养基中，该培养基中含有2％青霉素(10,000u/ml)和链霉素(10mg/ml)溶液(ps)，和1％牛血清白蛋白(bsa)。将海马神经元在37℃下用终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％edta的胰蛋白酶-edta溶液处理20分钟。加入含4.5g/l葡萄糖的杜氏改良的伊格尔培养基(dmem)终止解离，该培养基含有ii级dna酶i(终浓度为0.5mg/ml)和10％的胎牛血清(fcs)。通过10ml移液枪头的吹打三次将细胞机械解离，然后在515xg下于4℃离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于限定的培养基中，该培养基由含有2％的b27补充剂溶液、2mmol/ll-谷氨酰胺、2％的ps溶液和10ng/ml的脑源性神经营养因子(bdnf)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排斥试验，在neubauer细胞仪中对活细胞进行计数。将细胞以每孔20,000的密度接种在预涂有聚l-赖氨酸的96孔板中，并在空气(95％)-co2(5％)培养箱中于37℃下培养。每2天更换一次培养基。多奈必利和人类aβ1-42暴露培养17天后，将海马神经元暴露于aβ溶液(见下文)。按照callizot等人在(2013)神经系统科学杂志(j.neurosci.res.)91706-716.描述的方法完成aβ1-42的制备。简而言之，将aβ1-42肽以40μm的初始浓度溶解在上述的限定培养基中。将该溶液在黑暗中于37℃轻轻搅拌3天，并在培养基中适当稀释至所用浓度后立即使用(分别对应于2μm或0.25μm的低聚物(aβo)的20μm(板1)或2.5μm(板2))。将富马酸多奈必利溶解在培养基中，并在aβ给药前预培养1小时。添加aβ1-42制剂使其在多奈必利存在下在对照培养基中稀释至终浓度为20或2.5μm(＝2μm或0.25μm的aβo，通过自动蛋白质印记评估)稀释。组织培养板在一种培养物的96孔板(每种条件6孔)中测试了富马酸多奈必利(多奈必利)。在给药aβ之前一小时对化合物进行预培养。评估了以下条件：板1(map-2/tau)板2(psd95/syn)对照(载体)对照(载体)+aβ(20μm24h)/载体+aβ(2.5μm24h)/载体+aβ(20μm24h)/多奈必利(1μm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(1μm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(500nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(500nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(100nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(100nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(50nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(50nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(10nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(10nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(5nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(5nm)+aβ(20μm24h)/多奈必利(1nm)+aβ(2.5μm24h)/多奈必利(1nm)+aβ(20μm24h)/多奈哌齐(1μm)+aβ(2.5μm24h)/多奈哌齐(1μm)终点评估板1：存活、神经突网络和磷酸tau评价中毒后24小时，将海马神经元在-20℃下用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定5分钟。用0.1％的皂苷透化后，将细胞与以下物质培养2小时：a)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/1000稀释的鸡多克隆抗体抗微管相关蛋白2(map-2)(该抗体允许对神经元细胞体和神经突进行特异性染色；并允许研究神经元细胞的死亡和神经突网络)。b)在含1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/400稀释的小鼠单克隆抗体抗磷酸tau(at100)。在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中用1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗鸡igg在室温下处理1小时来显示这些抗体。对于每种条件，使用imagexpress(分子仪器(moleculardevices))以20倍放大率拍摄每孔30张照片(代表整个孔区域)。使用相同的采集参数拍摄所有图像。使用“自定义模块编辑器”(分子仪器)自动执行分析。评估了以下终点：-神经元总数(神经元存活，map-2阳性神经元数量)-神经突网络(以map-2阳性神经元的μm为单位)-神经元中tau的面积(μ面2，与map-2阳性神经元重叠)。板2：突触评估中毒后24小时，将海马神经元在-20℃下用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定5分钟。用0.1％的皂苷透化后，将细胞与以下物质培养2小时：a)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的小鼠单克隆抗体抗突触后致密物95kda(psd95)。b)在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的兔多克隆抗体抗突触小泡蛋白(syn)。在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中用1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗兔igg在室温下处理1小时来显示这些抗体。对于每种情况，使用imagexpress(分子仪器)以40倍的放大倍率拍摄每孔40张照片。使用相同的采集参数拍摄所有图像。通过使用自定义模块编辑器(分子仪器)自动执行突触评估。评估了以下终点：-突触的总数(在psd95/syn之间重叠)。统计分析所有值均表示为平均值+/-sem。通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行plsdfisher检验，p<0.05被认为是显著的。使用graphpadprism软件版本7.04进行不同条件下的图形和统计分析。*p<0.05被认为是显著的。结果多奈必利对map-2海马神经元存活和神经突网络以及tau过度磷酸化的影响。神经元存活下表1显示了多奈必利对海马神经元原代培养物中map-2神经元存活的影响。表1：map-2神经元(占对照的％)*：与aβ1-42相比p<0.05，通过单因素方差分析和fisherlsd检验确定。map-2神经元的重要损失是aβ肽的连续给药。多奈哌齐在这里用作阳性对照，能够显著保护神经元免于死亡。两种剂量的多奈必利(100nm和500nm)发挥的神经保护作用与多奈哌齐相似。神经突网络下表2显示了多奈必利对海马神经元原代培养物中map-2神经元神经突网络的影响。表2：map-2神经突网络(占对照的％)*：与aβ1-42相比p<0.05，通过单因素方差分析和fisherlsd检验确定。在aβ1-42损伤后，总神经突网络严重收缩。多奈哌齐显著保留了几乎所有的神经突网络。四种剂量的多奈必利(50nm，100nm，500nm和1μm)对神经突网络也具有保护作用。神经突网络与培养物中神经元的数量成比例。为了确定每个神经元的平均神经突长度，用神经元的数量对总的神经突网络进行了归一化处理。相应的结果示于下表3中。表3：神经突网络/map-2神经元(占对照的％)*：与aβ1-42相比，p<0.05，通过单因素方差分析和fisherlsd检验确定。这项调查表明，在多奈哌齐和多奈必利(1μm)的存在下，每个神经元的神经突长度更长，表明这两种化合物对神经突的长出有影响。tau磷酸化下表4显示了多奈必利对海马神经元原代培养物中map-2神经元中tau(at100)磷酸化的影响。表4：tau(at100)/神经元面积(占对照的％)*：与aβ1-42相比p<0.05，通过单因素方差分析和fisherlsd检验确定。在给药aβ1-42下，观察到tau(在at100上)的过度磷酸化。多奈哌齐能够显著减轻这种过度磷酸化。类似地，多奈必利(50nm，100nm，500nm)以剂量依赖的方式显著降低了tau的过度磷酸化。多奈必利对海马神经元原代培养物中突触的影响为了评估突触的形成，研究了突触后标志物psd-95和突触前标志物突触小泡蛋白的分布。psd-95和突触素染色均呈阳性的结构被认为是突触。下表5显示了多奈必利对这些突触的作用。表5：突触数量(占对照的％)*：与aβ1-42相比p<0.05，通过单因素方差分析和fisherlsd检验确定。由施用aβ1-42引起的应激引起突触数量的减少(如先前由callizot等人(2013)神经系统科学杂志(j.neurosci.res.)91：706-716)所示)。多奈哌齐减轻了突触的损失。同样，多奈必利也能够以剂量依赖性(5nm至1μm)保留突触的数量。有趣的是，观察到低剂量的化合物(5nm)的这种作用。该作用随剂量增加。由于aβ1-42肽引起的损伤，在实验条件下减少了神经元的数量，这导致突触数量的减少。因此，为了估计每个神经元的突触数量，将突触数量通过对照组、aβ1-42、多奈必利(500nm，该状态显示最高突触数量)和多奈哌齐组的神经元数量进行规一化。这项调查表明，仅多奈必利显著促进了新突触的形成，而多奈哌齐没有作用。结论本研究表明，多奈必利对阿尔茨海默病体外模型aβ1-42肽损伤的海马神经元的神经元存活和神经突网络具有有益作用。此外，多奈必利能够减少at100部位tau的过度磷酸化，并能够显著刺激新突触的形成。多奈必利的作用大于多奈哌齐的作用，这表明该化合物作为神经保护剂是一种有趣的候选药物，特别是用于治疗神经退行性疾病。实施例2本实施例证实了本发明的化合物可以改善ad/s体内模型中小鼠的认知能力。为此，使用脑室内注射aβ1-42低聚物(aβo)攻击的野生型c57bl6/j小鼠研究了两种化合物(富马酸多奈必利和富马酸氟必利)的功效。化合物以三种不同剂量经口服给药(通过口服管饲)。使用y迷宫测试、新颖物体识别测定和莫里斯(morris)水迷宫测试来评估认知能力。在认知试验结束时，将所有动物处死，取血和取脑进行进一步的离体分析。实验示意图简而言之，在7天或更长时间内，接受了144只c57bl6/j雄性小鼠(3月龄)并隔离圈养(每笼4至5只)。从第-1天到第+17天，以不同的浓度每天一次口服(经口服管饲)给药测试项目。在第0天，小鼠接受单次icv注射的载体或aβo。在第4天(即疾病诱发后四天)，使用y迷宫测试评估空间工作记忆。从第3天到第14天，在mwm测定中研究了学习能力和长期记忆。在第+15/+16天，使用新颖物体识别测试(nor)对识别记忆进行了研究。在第+17天处死动物，并准备组织用于进一步的离体分析。实验组说明该研究涉及总共144只小鼠，分为12个实验组，每个实验组12只小鼠。所有动物均接受总体积为1μl的载体或aβo的单次(单侧)icv注射。不同的实验组定义如下：·a组(载体对照)：po载体和icv注射载体(n＝12)·b组(aβo对照)：po载体和icv注射aβo(n＝12)·c组(阳性对照)：po多奈哌齐亚慢性和icv注射aβo(n＝12)·d组(多奈必利对照)：po多奈必利(9mg/kg)和icv注射载体(n＝12)·e组(氟必利对照)：po氟必利(9mg/kg)和icv注射载体(n＝12)·f组(多奈必利处理)：po多奈必利(1mg/kg)和icv注射aβo(n＝12)·g组(多奈必利处理)：po多奈必利(3mg/kg)和icv注射aβo(n＝12)·h组(多奈必利处理)：po多奈必利(9mg/kg)和icv注射aβo(n＝12)·i组(氟必利处理)：po氟必利(1mg/kg)和icv注射aβo(n＝12)·j组(氟必利处理)：po氟必利(3mg/kg)和icv注射aβo(n＝12)·k组(氟必利处理)：po氟必利(9mg/kg)和icvaβo注射(n＝12)·l组(阳性对照)：ip多奈哌齐急性试验日和icv注射aβo(n＝12)因为每天最多可以icv注射24只小鼠，所以该研究以六次独立的试验进行。每次试验中包括来自所有组的两只小鼠。实验步骤动物圈舍接受144只c57bl6/j雄性(来自janvier，法国)小鼠(3月龄)。收到后，将动物隔离7天或更长时间。将小鼠圈养在标准温度(22±2℃)下，在光和湿度受控的环境中(灯光：上午8点至晚上8点；湿度55±10％)，随意取食食物和水。将小鼠分组圈养，并由实验室人员每天两次(上午8点和下午4点)进行监测。如果总体健康状况出现2个或更多个重大问题，则将患病小鼠处死。不可接受的健康状况的定义如下：在24小时观察期内无自发运动，不能饮水或进食，体重减轻超过12％，大量出血，自发炎症(对小鼠皮肤和眼睛的一般观察)或解剖结构缺失。在整个过程中，将小鼠称重3次(即，在处理前、第+8和+17天)。化合物的储存、配制和给药对于口服给药，多奈必利和氟必利通过在0.9％nacl中溶解来配制。在诱发疾病之前的一天(通过icv注射aβo)开始化合物给药(总体积为200μl)，并连续19天进行。立体定向注射144只小鼠的脑室内单次注射载体或aβo(每天最多24只小鼠，所有小鼠随机分组)：在麻醉下(分别以110和15mg/kg的剂量腹膜内注射氯胺酮/甲苯噻嗪的混合物)将aβo(1μl)或载体(1μl)注入右心室。使用配备有26号针头的10μlhamilton微型注射器进行注射。该过程通过皮下注射5mg/kg剂量的美达佳(metacam)(镇痛)而终止。然后将动物分别放在其笼中，并将笼子放在加热的柜子中，直到动物完全康复为止。仔细监测动物以控制麻醉后的恢复。制备aβo：aβ1-42获自bachem(refh1368)(批号：1053201)。稳定的aβ1-42低聚物的制备按garcia等人(2010)神经科学杂志(j.neurosci.)30：7516-7527.中所述进行。寡聚制剂(标识为批号2016-14)包含aβ1-42的稳定的三聚体和四聚体以及肽的单体形式的混合物。先前使用的所有低聚物制剂均已根据低聚物组成和体外神经毒性进行了表征。认知测验、y迷宫测验在第+4-天时，每24只小鼠进行6项独立试验(即每个实验组2只小鼠)，总共144只小鼠在给药后1小时进行行为测试。该测试评估主要由前额叶皮质(工作记忆)和海马(空间成分)介导的空间工作记忆。对于不同的化合物，参见yoon等(2008)学习记忆(learnmem.)15：97-105和spellman等(2015)自然(nature)522：309-314。前额叶皮质介导啮齿动物、灵长类动物和人类的工作记忆。自发交替行为的测量已被行为药理学家广泛用于评估空间工作记忆，这是短期记忆的一个组成部分。以其最简单的形式，自发的交替行为包括小鼠倾向于在连续的机会上交替选择其常规的非加强型手臂。该测试已成功通过icv注射aβo诱发认知缺陷而得以实施(garcia等(2010)神经科学杂志(j.neurosci.)30：7516-7527).详细方案：通过在y型迷宫中记录自发交替行为来评估即时空间工作记忆性能。迷宫由不透明的有机玻璃制成，三个臂中的每个臂长40厘米，高14厘米，宽10厘米，并以相等的角度放置。将该设备放置在光线均匀的测试室中，以在所有臂以及中心区域获得12-15lux的光通量。将小鼠放在一只手臂的中间，并允许它们在5分钟内自由探索迷宫。手臂记录的一系列视频(smartv3.0软件，bioseb)被记录下来，并且当小鼠的后爪完全放在手臂上时，手臂记录被认为是完整的。交替定义为在重叠的三联体集合上成功进入3个臂中。交替的百分比计算为实际总交替与可能交替的比率，定义为手臂进入数减去2，再乘以100。在此阶段，还通过监视平均速度和总距离来记录和评估运动能力(例如动机指数)。数据分析：graphpad/prism计算机软件用于统计分析。进行非参数方差分析(克鲁斯卡尔-沃利斯(kruskalwallis)检验)，然后进行非参数曼-惠特尼u(mann-whitneyu)检验以比较各组之间的差异。p<0.05的值被认为具有统计学意义。数据表示为平均值±sem。认知测试、nor分析在第+4-天时，每24只小鼠(即每个实验组2只小鼠)进行6项独立试验，总共144只小鼠在给药后1小时进行行为测试。该测试评估项目的识别记忆，其人类等效性是视觉上的成对比较(vpc)(wallace等(2015)实验药理学手册(handb.exp.pharmacol.)228：27-57)。对物体的识别是由啮齿类动物(albasser等(2009)行为神经科学(behav.neurosci.)123：115-124)、灵长类动物(zeamer等(2015)发展认知神经科学(dev.cogn.neurosci.)11：31-41)和人类(watson&lee(2013)神经科学杂志(j.neurosci.)33：4192-4200)的周围皮质介导的。先前已证明向小鼠脑室内注射aβo会导致新的物体识别任务受损，并且可被乙酰胆碱酯酶抑制剂多奈哌齐逆转，并在细胞保护和神经保护的线粒体衍生肽中显示出对人的保护作用。详细方案：在进行认知测试的前一天(即+15天)，在10分钟的试验过程中将小鼠习惯化，然后将它们放在空旷的场地中。进行认知测试的当天(即第+16天)，将动物放在相同的开放场地中，并允许它们自由探索两个相同的物体，进行为期五分钟的试验(获取试验)。然后将动物放回笼子中，进行五分钟的内试验时间。在保留试验期间，允许动物探索两种不同的物体：一种熟悉的物体和一种新颖的物体。在这段时间内，实验者对处理视而不见，记录小鼠积极探索每个物体的时间。所有试验均已录像(smartv3.0软件，bioseb)。然后生成一个辨别指数：辨别指数＝(探索新物体的时间–探索熟悉物体的时间)/总探索时间。数据分析：graphpad/prism计算机软件用于统计分析。进行非参数方差分析(kruskalwallis检验)，然后进行非参数mann-whitneyu检验，以便在组之间进行比较。p<0.05的值被认为具有统计学意义。数据表示为平均值±sem。认知测试、mwm测定在第+4天，有6个独立的试验，每个涉及24只小鼠(即每个实验组2只小鼠)，共144只小鼠。空间参考记忆是一个过程，该过程测试记住空间线索以识别位置的能力。它利用虚拟水迷宫任务由啮齿类动物(broadbent等(2006)学习记忆(learnmem.)13：187-191)和人类(bartsch等(2010)科学(science)328：1412-1415)的海马介导。该测试还涉及学习组件。在小鼠中icv注射aβo导致莫里斯水迷宫的空间参考记忆不足(garcia等(2010)神经科学杂志(j.neurosci.)30：7516-7527)。详细方案：适应性试验(可见平台)-莫里斯水迷宫(mwm)按garcia等(2010)神经科学杂志(j.neurosci.)30：7516-7527中所述进行。实验装置由圆形的水箱(直径＝100cm；高度＝50cm)组成，该水箱含有21℃、深度为25cm的水，并通过添加水性丙烯酸乳液使之变得不透明以遮挡水面的视线。使用平台(直径＝10厘米)并将其放置在象限的中点。泳池位于测试室中，均匀照明100lux。使用视频跟踪系统记录动物的游泳路径。在测试之前，将小鼠带入实验室至少30分钟，以使其适应实验室条件。在进行位置导航之前，先导航到可见平台，以评估所有小鼠的视觉和运动能力。小鼠接受每天60秒(持续2天)的4次试验，两次试验的间隔至少为1小时。一旦小鼠找到平台，就将它们单独留在平台上保持另外30s的时间。房间中没有其他提示。平台位置和起点随机分布在泳池的所有四个象限中。60秒后未能找到平台的小鼠被引导到其位置，并在平台上放置30秒。记忆获取试验(使用隐藏平台的学习试验)-它们持续进行5天，用于达到逃生潜伏期的稳定状态。在测试之前，将小鼠带入实验室至少30分钟，以使其适应实验室条件。隐藏的平台浸没在水面以下1厘米处，并放置在一个象限的中点。泳池位于测试室中，以100lux的光均匀照明，并包含各种醒目的视觉提示。使用视频跟踪系统记录游泳路径、游泳距离、游泳速度和横轴运动。小鼠接受每天60s的4次试验，试验间隔至少1h。允许小鼠自由游泳60s，在隐蔽平台上单独呆30s，然后在两次试验间隔期间将它们放回圈养笼中。为每只动物随机选择起始位置(位于象限的边界)。在每个试验中，记录逃脱到隐藏平台所需的时间。在60秒后未能找到平台的小鼠被引导到平台上并放置30秒，然后才返回圈养笼中。记忆保留试验(探针试验，无平台)-在上次训练后两天进行。在测试之前，使小鼠再次适应实验室至少30分钟。移除平台，让每只动物自由游泳60秒钟。在试验过程中，通过视频跟踪来测量和监视在目标象限中花费的时间，在相对象限中花费的时间以及对前平台位置的穿越。数据分析：graphpad/prism计算机软件用于统计分析。进行非参数方差分析(kruskalwallis检验)，然后进行非参数mann-whitneyu检验，以便在组之间进行比较。p<0.05的值被认为具有统计学意义。数据表示为平均值±sem。组织取样在第+17天处死小鼠。血液样本采集：在麻醉下，将小鼠放血。用1ml注射器从腔静脉中抽取约600μl全血。在bdmicrotainerk2e管(参考365975)或sarstedtlihe微管(参考41.1503.005)中收集血液。将试管轻轻倒置，并将样品置于冰上。将微容器在4℃，8600g下离心5分钟。将约250μl血浆转移到eppendorf管中，在-80℃冷冻用于进行进一步分析。脑样本采集：采血后，对小鼠进行0.9％生理盐水的心内快速灌注。取出整个脑，分离半球。将对侧的左半球在液氮中速冻，并储存在-80℃以便进一步分析(即暴露于化合物中)。同侧右半球用于隔离海马、前额叶皮质和皮质。在冷却的支持物上分离所有脑结构，并在液氮中速冻。结果本发明化合物对空间工作记忆的作用为了确定多奈必利和氟必利对小鼠空间工作记忆的影响，在icv注射载体或aβo后四天进行了y迷宫测试。在5分钟的试验过程中，允许动物探索y-迷宫装置，并如实验程序中所述对交替行为进行评分。载体对照组(a组)的小鼠在探索y迷宫时表现出正常行为，交替行为为68.0±3.0％。这些结果与类似对照组的先前观察结果一致(见garcia等(2010)神经科学杂志(j.neurosci.)30：7516-7527)。如所预期的，与载体对照小鼠相比，单次icv注射aβo(b组)在y迷宫测试中导致认知能力的显著损害(p＝0.0026)，只有54.0±2.0％的交替。口服给予多奈哌齐和icv注射aβo的阳性对照小鼠(c组)与对照小鼠没有差异(交替行为为66.1±1.8％)，与注射aβo的小鼠有统计学差异(p＝0.0011)。阳性对照小鼠经腹膜内注射多奈哌齐和icv注射aβo(急性给药)(l组)，与对照组相比有统计学差异(p＝0.0278；交替行为为60.8±1.9％)，与注射aβo的小鼠在统计学上也有差异(p＝0.0421)。给予多奈必利(9mg/kg/day)和icv注射载体(d组)的小鼠表现出59.3±4.0％的交替行为，与对照小鼠(p＝0.2640)没有差异，与aβo注射的小鼠(p＝0.5371)没有差异。给予氟必利(9mg/kg/天)和icv注射载体(e组)的小鼠表现出63.1±2.3％的交替行为，与对照小鼠没有差异(p＝0.1166)，与aβo注射的小鼠具有差异(p＝0.0111)。给予小鼠递增剂量的多奈必利(1、3和9mg/kg/day)，并icv注射aβo(分别为f，g和h组)。在3mg/kg/day的剂量下，多奈必利抑制aβo诱导的空间工作记忆障碍。实际上，来自g组的小鼠表现出65.5±4.4％的交替行为，与对照小鼠没有差异(p＝0.5543)，与注射aβo的小鼠具有差异(p＝0.0137)。在1mg/kg/day的剂量下，多奈必利对aβo诱导的空间工作记忆障碍无影响，因为这些小鼠表现出56.6±3.7％的交替行为，与对照小鼠具有差异(p＝0.0488)，与注射aβo的小鼠没有差异(p＝0.6859)。由于更高的异质性，h组小鼠(以9mg/kg/day的剂量给予多奈必利)表现出具有64.3±5.1％的交替行为的中间表型，与对照小鼠没有差异(p＝0.5994)，与注射aβo的小鼠也没有差异(p＝0.1316)。给小鼠递增剂量的氟必利(1、3和9mg/kg/day)，并icv注射aβo(分别为i，j和k组)。在1和3mg/kg/day的剂量下，氟必利抑制aβo诱导的空间工作记忆障碍。实际上，来自i组和j组的小鼠表现出67.1±2.7％和65.3±4.1％的交替行为，分别与对照小鼠(对于i和j组分别为p＝0.9754和p＝0.6936)没有差异，与注射aβo的小鼠(对于i和j组分别为p＝0.0029和p＝0.0454)具有差异。相反，以9mg/kg/day的剂量，氟必利不能保护小鼠免受aβo诱导的空间工作记忆损害。实际上，来自k组的小鼠表现出59.1±3.0％的交替行为，与对照小鼠不同(p＝0.0290)，但与注射aβo的小鼠没有差异(p＝0.2346)。本发明化合物对学习能力和长期记忆的影响为了确定本发明化合物对学习能力和长期记忆的作用，在icv注射载体或aβo后的第+3天至+14天进行了mwm测试。适应性试验第一步(在icv注入载体或aβo后第+3和+4天进行适应性试验)，训练小鼠在没有其他视觉提示的情况下从水中逃逸到可见平台。在这些试验中，记录了逃生潜伏期、游泳距离和游泳速度。两组之间的逃避潜伏期没有显著差异。没有检测到游泳速度或游泳距离的差异。总而言之，这些数据表明该处理既不影响小鼠的身体能力也不影响其逃离水的动力。学习试验在连续五天(从icv注入载体或aβo后的第+7天到第+11天)期间监测小鼠的学习能力。动物每天进行4次试验，并通过视觉提示进行训练以定位隐藏平台。在这些学习试验中，记录了逃生潜伏期、游泳距离和游泳速度。在试验开始时，各组之间的平均逃避潜伏期没有统计学上的显著差异。然后所有组似乎都表现出一定程度的学习。载体对照组(a组)的小鼠有效地学习了平台定位，经过5天的训练(第5天)，它们的平均逃避潜伏期为11.7±1.5s(与第1天相比，p＝0.00031)。相比之下，注射aβo的小鼠(b组)在训练5天后表现出行为受损，导致平均逃避潜伏期为17.3±2.0s(与第1天没有差异，p＝0.4537；与对照小鼠显著不同，p＝0.00293)。小鼠用多奈哌齐(po)亚慢性给药和icv注射aβo(c组)有效地学习了平台定位。经过五天的训练(第5天)，它们的平均逃避潜伏期为14.7±1.9s(与第1天相比，p＝0.09593)。在第5天，它们的表现与对照小鼠没有差异(p＝0.2188)，与注射aβo的小鼠也没有差异(p＝0.3477)。急性(试验日)给予多奈哌齐(ip)和icv注射aβo(l组)的小鼠有效地学习了平台定位。经过五天的训练(第5天)，它们的平均逃避潜伏期为13.4±1.5s(与第1天相比，p＝0.01573)。在第5天，它们的表现与对照小鼠没有差异(p＝0.4187)，与注射aβo的小鼠也没有差异(p＝0.1272)。给予多奈必利(9mg/kg/day)或氟必利(9mg/kg/day)和icv注射载体(分别为d组和e组)的小鼠表现出正常的认知能力。经过五天的训练(第5天)，给予多奈必利的小鼠平均逃避潜伏期为13.0±1.7s(与第1天相比，p＝0.01778)。在第5天，它们的表现与对照小鼠没有差异(p＝0.5476)，并且与注射aβo的小鼠(p＝0.10731)没有差异。经过五天的训练(第5天)，给予氟必利的小鼠平均逃避潜伏期为16.3±2.0s(与第1天相比，p＝0.04439)。在第5天，它们的表现(由于未知原因)与对照小鼠具有差异(p＝0.06709)，与注射aβo的小鼠没有差异(p＝0.7235)。值得注意的是，在第4天，氟必利表现出14.2±1.9s的平均逃避潜伏期，与对照组小鼠没有差异(p＝0.7933)，与注射aβo的小鼠没有差异(p＝0.1225)。给予小鼠递增剂量的多奈必利和icv注射aβo(f，g和h组)。与注射aβo的小鼠相比，多奈必利(3mg/kg/天的剂量)的存在导致小鼠学习能力的提高。实际上，在训练五天后，g组小鼠的平均逃避潜伏期为12.7±1.5s(与第1天相比，p＝0.02933)。它们的表现与对照小鼠没有差异(p＝0.6284)，但与注射aβo的小鼠具有差异(p＝0.07381)。给予小鼠递增剂量的氟必利和icv注射aβo(i，j和k组)。与注射aβo的小鼠相比，氟必利(1和3mg/kg/天的剂量)的存在导致小鼠的学习能力提高，而9mg/kg/天剂量的化合物没有影响。训练5天后，以1mg/kg/天的剂量给予氟必利的小鼠表现出平均逃避潜伏期为13.1±1.1s(与第1天相比，p＝0.03759)。它们的表现与对照小鼠没有差异(p＝0.4367)，但与注射aβo的小鼠具有差异(p＝0.07422)。相似地，在训练5天后，以3mg/kg/天的剂量给予氟必利的小鼠表现出12.5±1.1s的平均逃避潜伏期(与第1天相比，p＝0.00146)。它们的表现与对照小鼠没有差异(p＝0.6477)，但与注射aβo的小鼠不同(p＝0.04328)。探查试验在最后一次训练后四天和icv注射载体或aβo后14天，确定长期记忆表现。移去平台，让每只动物自由游泳60秒。在探查试验期间，确定了在泳池的各个象限中花费的时间、在先前平台位置上的穿越数以及第一次穿越的时间(即到达目标的潜伏期)。在探查试验期间，两组之间没有观察到游泳速度的差异，显示出正常的身体能力和动力。穿越数-载体对照组(a组)的小鼠表现出正常行为，平均穿越数为5.3±0.6(图3)。这些结果与类似对照组的先前观察结果一致。如所预期的，与载体对照小鼠相比，单次icv注射aβo(b组)导致认知能力的显著损害，平均穿越数减少了2.2±0.4(与对照小鼠相比，p＝0.0010)。用多奈哌齐(po)亚慢性给药和icv注射aβo(c组)的小鼠表现出改善的行为，平均穿越数为3.7±0.4。这些小鼠与载体对照小鼠没有差异(p＝0.0502)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0214)。类似地，对小鼠(在试验日)给予多奈哌齐(ip)和icv注射aβo(l组)进行急性给药的小鼠表现出改善的行为，平均穿越数为3.8±0.4。这些小鼠与载体对照小鼠没有差异(p＝0.0857)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0159)。在存在载体的情况下分别给予多奈必利(9mg/kg/day)或氟必利(9mg/kg/day)(d组和e组)的小鼠表现出正常的认知能力，平均穿越数为4.6±0.5和4.6±0.7。这些小鼠与载体对照小鼠没有差异(多奈必利和氟必利分别为p＝0.4003和p＝0.3945)，与aβo注射的小鼠有显著差异(多奈必利和氟必利分别为p＝0.0026和p＝0.0077)。给予小鼠递增剂量的多奈必利和icv注射aβo(f，g和h组)。使用穿越数评估多奈必利(所有剂量)的存在导致aβo诱导的长期记忆受损的抑制作用。3mg/kg/天的剂量达到最大效果(g组)。实际上，这些小鼠表现出正常的行为，其平均穿越数为5.1±0.6，与载体对照小鼠没有差异(p＝0.6575)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0018)。给予小鼠递增剂量的氟必利和icv注射aβo(i，j和k组)。使用穿越数评估，氟必利(所有剂量)的存在均导致了aβo诱导的长期记忆损害的抑制作用。3mg/kg/天的剂量达到最大效果(j组)。实际上，这些小鼠表现出正常的行为，其平均穿越数为4.1±0.6，与载体对照小鼠没有差异(p＝0.1668)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0242)。目标潜伏期-载体对照组(a组)的小鼠表现出正常行为，平均目标潜伏期为12.0±1.9s。这些结果与类似对照组的先前观察结果一致。如所预期的，与载体对照小鼠相比，单次icv注射aβo(b组)导致认知能力明显受损，对目标的平均潜伏期增加24.4±4.7s(与对照小鼠相比，p＝0.0074)。给予多奈哌齐(po)亚慢性给药和icv注射aβo(c组)的小鼠表现出改善的行为，对目标的平均潜伏期为14.6±2.7s。这些小鼠与载体对照小鼠没有差异(p＝0.6860)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0272)。类似地，给予多奈哌齐(ip)急性给药和icv注射aβo(l组)的小鼠(在试验日)表现出改善的行为，对目标的平均潜伏期为13.3±2.3s。这些小鼠与载体对照小鼠没有差异(p＝0.9264)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0028)。发现在载体存在下分别给予多奈必利(9mg/kg/天)或氟必利(9mg/kg/天)的小鼠(分别为d组和e组)表现出正常的认知能力，平均对目标的潜伏期为7.2±1.5s和12.0±2.1s。这些小鼠与载体对照小鼠没有差异(多奈必利和氟必利分别为p＝0.0524和p＝0.7582)，与aβo注射的小鼠有显著差异(多奈必利和氟必利分别为p＝0.0017和p＝0.0082)。给予小鼠递增剂量的多奈必利和icv注射aβo(f，g和h组)。使用目标潜伏期评估，多奈必利(所有剂量)的存在均导致aβo诱导的长期记忆受损的抑制作用。1mg/kg/天的剂量达到最大效果(f组)。实际上，这些小鼠表现出正常的行为，对目标的平均潜伏期为9.3±1.4s，与载体对照小鼠没有差异(p＝0.2548)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0005)。给予小鼠递增剂量的氟必利和icv注射aβo(i，j和k组)。使用针对目标的潜伏期评估，氟必利(仅以9mg/kg的剂量)的存在导致aβo诱导的长期记忆损害的抑制作用。实际上，来自k组的小鼠表现出正常的行为，其对目标的平均潜伏期为10.7±1.9s，与载体对照小鼠没有差异(p＝0.6891)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0031)。象限中的时间-载体对照组(a组)的小鼠在目标象限中花费的时间明显更多(与在相对象限中花费的时间相比，p<0.0001)。这些结果与类似对照组的先前观察结果一致。如所预期的，与载体对照小鼠相比，单次icv注射aβo(b组)导致认知能力显著受损，而在相对象限中所花费的时间比目标象限中所花费的时间多(当将目标象限与相对象限中所花费的时间比较时，p＝0.0779)。使用在不同象限中花费的时间作为读数，多奈哌齐的亚慢性或急性给药(c组和l组)未能改善aβo诱导的长期记忆障碍。同样，多奈必利和氟必利不能在探查测试期间改善象限频率。本发明化合物对识别记忆的作用为了确定测试项目对识别记忆的影响，在icv注射载体或aβo后16天进行了nor测试。如实验程序中所述进行行为试验。载体对照组(a组)的小鼠表现出正常行为，平均辨别指数为0.35±0.04。这些结果与类似对照组的先前观察结果一致。如所预期的，与载体对照小鼠相比，单次icv注射aβo(b组)导致认知能力显著受损(p<0.0001)；平均辨别指数为-0.01±0.03，注射aβo的小鼠无法辨别新颖物体和熟悉物体。给予多奈哌齐(po)亚慢性给药和icv注射aβo(c组)的小鼠表现出正常行为，平均辨别指数为0.29±0.09。这些小鼠与载体对照小鼠没有差异(p＝0.7439)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0192)。急性(试验日)给予多奈哌齐(ip)和icv注射aβo(l组)的小鼠表现出正常行为，平均辨别指数为0.30±0.07。这些小鼠与载体对照小鼠没有差异(p＝0.9158)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0030)。发现在载体存在下分别给予多奈必利(9mg/kg/day)或氟必利(9mg/kg/day)(d组和e组)的小鼠表现出正常的认知能力，平均辨别指数为0.29±0.04和0.36±0.06。这些小鼠与载体对照小鼠没有差异(多奈必利和氟必利分别为p＝0.3071和p＝0.8205)，与aβo注射的小鼠有显著差异(多奈必利和氟必利分别为p＝0.0007和p＝0.0003)。给予小鼠递增剂量的多奈必利和icv注射aβo(f，g和h组)。多奈必利(所有剂量)的存在导致剂量依赖性抑制aβo引起的识别记忆损伤。9mg/kg/天的剂量达到最高效果(h组)。实际上，这些小鼠表现出正常行为，平均辨别指数为0.43±0.06，与载体对照小鼠没有差异(p＝0.3440)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0003)。给小鼠递增剂量的氟必利和icv注射aβo(i，j和k组)。氟必利(所有剂量)的存在导致剂量依赖性抑制aβo引起的识别记忆损伤(钟形曲线)。3mg/kg/天的剂量达到最大效果(j组)。实际上，这些小鼠表现出正常行为，平均辨别指数为0.46±0.05，与载体对照小鼠没有差异(p＝0.1039)，与注射aβo的小鼠有显著差异(p＝0.0003)。结论总之，这些数据强烈表明，多奈必利和氟必利均可改善aβo攻击的小鼠认知能力。实施例3该实施例显示了在长期给予阿尔茨海默病的5xfad小鼠模型中，多奈必利和氟必利的抗遗忘、抗淀粉样蛋白和抗炎作用。研究基本原理这项研究的目的是评估在阿尔茨海默病的小鼠模型中，长期给予多奈必利和氟必利的潜在抗遗忘、抗淀粉样蛋白和抗炎作用。使用的小鼠模型是5xfad品系(在杰克逊实验室称为“b6sjl-tg(appswfllon,psen1*m146l*l286v)6799vas/mmjax”,mmrrcstock编号：34840-jax或"b6.cg-tg(appswfllon,psen1*m146l*l286v)6799vas/mmjax,mmrrcstock编号：34848-jax)。这些5xfad转基因小鼠过表达瑞典(k670n，m671l)、佛罗里达(i716v)和伦敦(v717i)家族性阿尔茨海默病(fad)突变的突变体人app(695)和携带两种fad突变体(m146l和l286v)的人ps1。两种转基因均受小鼠thy1启动子调控，以驱动脑中的过表达。5xfad小鼠概括了阿尔茨海默病淀粉样蛋白病理学的主要特征，是神经内aβ42诱导的神经变性和淀粉样斑块形成的有效模型。方法和实验设计小鼠根据1986年11月24日欧洲共同体理事会的指令(86/609/eec)进行了动物实验。尽一切努力使动物的痛苦最小化，并减少了使用的小鼠数量。oakley等人在(2006)神经科学杂志(j.neurosci.)26：10129-10140.中描述了5xfad小鼠的产生。这些转基因小鼠过表达具有瑞典(k670n，m671l)、佛罗里达(i716v)和伦敦(v717i)家族ad(fad)突变的人app(695)和具有两种fad突变m146l和l286v的人早老素1(ps1)。两种转基因的表达均受小鼠thy1启动子的神经元特异性元件调控。通过将半合子转基因小鼠与b6/sjlf1种鼠杂交来维持5xfad品系(b6/sjl遗传背景)。通过将半合子转基因小鼠与c57bl/6jf1种鼠杂交来维持5xfad品系(c57bl/6j遗传背景)。使用尾部基因组dna通过pcr对所有动物进行基因分型。转基因和野生型小鼠在我们的动物设施中饲养，可以随意获得食物和水，并在22-24℃下以12小时的明暗循环饲养。在该研究中使用了雌性5xfad小鼠。对于每个实验，小鼠的年龄均以月龄计(有两周的范围)。药物在法国卡昂卡曼(cermn)合成了多奈必利(富马酸多奈必利，mr31155)和氟必利(富马酸氟必利，mr31193)。rs67333(1-(4-氨基-5-氯-2-甲氧基-苯基)-3-(1-丁基-4-哌啶基)-1-丙酮)用作参考5-ht4受体激动剂，从托克里斯生物科学(tocrisbioscience)(r&dsystemseurope，里尔，法国)购买。将化合物重悬于dmso中(37.5μg/μl，在-20℃下储存)，并在给药前在0.9％nacl中按1：250的比例新鲜稀释。载体溶液(0.9％nacl，0.4％dmso)用作对照。动物处理5xfad小鼠根据2种不同的方案接受了药物或载体的长期处理。在每个实验中，药物或载体溶液经腹膜内给药，每周两次(1mg/kg)。在“方案1”中，将小鼠(每组n＝6-7只小鼠)用化合物处理2个月，从2月龄到4月龄。在“方案2”中，将小鼠(n＝7)用化合物处理三个月，从1月龄到4月龄。在每个方案结束时，用盐溶液中的100mg/kg氯胺酮和10mg/kg甲苯噻嗪的混合物麻醉小鼠，并用pbs进行心内灌注。在冰上迅速隔离脑，去除嗅球和小脑，两个半球分开。将一个半球冷冻在干冰上，并保存在-80℃进行生化分析，将另一个半球后固定在4％pfa中进行免疫组织化学(ihc)。脑脊液(csf)收集麻醉小鼠并将其安放在立体定位仪上。借助微型牵开器(精细科学工具(finesciencetools)，海德堡，德国)切割颈部皮肤并分离皮下组织和肌肉。然后放下小鼠，使头部与身体形成约135°的角度(liu和duff(2008)可视化实验杂志(j.vis.exp.)10：960)。使用毛细管(硼硅酸盐玻璃，b100-75-10，萨特仪器(sutterinstruments)，诺瓦托，美国加利福尼亚州)来冲压水罐的硬脑膜。通过毛细作用收集csf，并将其转移到0.5ml微管中，立即在干冰上冷冻并保存在-80℃直至使用。一旦融化，就如国际申请wo2008/009868中所述将样品在60℃下加热5分钟，并且在没有进一步的冻融循环的情况下进行分析。脑提取物准备将5xfad小鼠和对照组的脑半球、额叶皮质和海马融化，称重，并在4体积的具有蛋白酶抑制剂混合物(罗氏应用科学(rocheappliedscience)，梅兰，法国)的tris-盐水(50mmtris-hclph＝7.4，150mmnacl)中均质。将得到的匀浆液以54,000×g离心20分钟，收集上清液(“可溶部分”)，等分并在-80℃下储存。通过短暂的超声处理将沉淀物重悬于10体积的6m盐酸胍的50mmtris-hcl(ph＝7.6)溶液中，并再次以26,500×g离心20分钟。将上清液(“不溶部分”)等分并储存在-80℃下(morishima-kawashima等(2000)美国病理学杂志(am.j.pathol.)157：2093-2099)。aβ40和aβ42的定量ibl国际的elisa试剂盒(德国汉堡)用于aβ40(人淀粉样β(1-40)检测试剂盒，#27713)或aβ42(人淀粉样β(1-42)检测试剂盒，#27719)的剂量根据制造商的说明使用。使用infinite2000发光计数器在620nm和450nm读取反应。使用bca蛋白测定法(sigma-aldrich)测量，将获得的值归一化为每个样品的蛋白浓度。免疫组织化学使用振动切片机(micromhm650v，赛默飞世尔(thermoscientific)，圣赫伯伦，法国)切割30微米厚的切片，并在-20℃下在冷冻保护介质中保存。为了标记淀粉样斑块，将额叶皮质、海马和内嗅皮质(前囟(bregma)点的坐标：额叶皮质＝1.98mm，海马＝1.94mm，内嗅皮质＝-3.08mm)的自由漂浮组织切片在pbs中广泛地清洗，然后在封闭溶液(pbs；3％bsa；0.1％tritonx-100)中培养1小时。将切片用hoechst染料(生命技术(lifetechnologies)，圣奥宾，法国，1：1000)染色15分钟以检测细胞核，然后用新鲜制备的硫黄素t溶液(#t3516-5g，sigma-aldrich)(终浓度：在封闭缓冲液中为0.01mg/ml)处理15分钟。在70％乙醇中洗涤5分钟后，将样品固定在带有盖玻片的聚赖氨酸载玻片上。对于gfap(胶质纤维酸性蛋白)染色，如前所述封闭自由漂浮的脑切片，并与多克隆兔抗gfap(1：1000，z0334，达科(dako)，莱乌利斯，法国)在4℃培养过夜。硫黄素t染色并用70％乙醇洗涤后，添加alexafluor594山羊抗兔二抗(1：1000，a11012，生命技术)2h。如前所述进行pbs洗涤和安装。图像采集与分析图像使用axioimagerz1显微镜(卡尔·蔡司(carlzeisss.a.s.)，马里·勒罗伊(marlyleroi)，法国)采集。盲目进行硫黄素t染色分析，数据表示为来自同一脑区域/动物的2至3个组织切片中每mm2的平均颗粒数(imagej软件)。使用imagej软件对gfap表达进行定量，结果表示为面积分数。新颖物体识别测试使用新颖物体体识别(nor)测试(bevins和besheer(2006)自然议定书(nat.protoc.)1：1306-1311)来测试小鼠的认知能力。在测试开始之前，在药物治疗期间对动物进行广泛处理。每天，让小鼠至少在测试前1小时熟悉测试室。在放置在光线昏暗的房间中的plexiglas盒子(宽度：35厘米，长度：20厘米，高度：20厘米)中进行测试。在第1天和第2天，每只小鼠习惯于空盒10分钟/天。在第3天，将两个物体(用塑料玩具制成)放置在笼子中，离相对壁5厘米。在训练期间，将每只动物面对墙壁放置在两个物体之间，然后让它们探索物体5分钟。然后将小鼠放回它们的笼中，并在24小时后进行5分钟的测试，其中两个(熟悉的)物体之一被新的(新颖的)物体代替。整个实验都进行了录像，并盲目地测量了物体的探索[小鼠鼻子与物体接触或闻到物体的距离为≤1cm所花费的时间]。考虑了两个参数：1)在训练过程中动物与两个熟悉的物体互动所花费的探索时间(秒)，以及2)相对于总探索时间，动物与新颖物体互动所花费的探索时间([新颖/((熟悉+新颖)]×100)。还计算了辨别指数([新颖-熟悉]/[熟悉+新颖])。统计分析所有值均表示为平均值±sem。在多个比较组的情况下，通过anova分析和随后的图基(tukey)事后检验确定了处理的显著效果。在所有其他情况下，均使用未配对的学生t检验。对于所有统计检验，p<0.05被认为是显著的。使用graphpadprism7(graphpad软件，拉霍亚，加利福尼亚)进行分析。结果多奈必利和氟必利对5xfad脑中的淀粉样蛋白负荷的影响本研究使用27只雌性5xfad小鼠(b6/sjl遗传背景)。从2到4月龄，小鼠每周两次接受(腹腔注射)载体或化合物(1mg/kg)两个月。从脑提取物中可溶和不可溶部分中定量aβ40和aβ42。结果以载体的％表示。下表6列出了获得的结果：表6：aβ40和aβ42水平(占对照的％)*：与载体相比，p<0.05，通过单因素方差分析和tukey检验确定。表6中列出的载体组的值如下：o可溶部分：■aβ40＝9.48±1.08μg/mg的蛋白质，■aβ42＝0.24±0.03μg/mg的蛋白质；o不溶部分：■aβ40＝0.68±0.10μg/mg的蛋白质，■aβ42＝10.84±0.73μg/mg的蛋白质。抗淀粉样蛋白作用。在5xfad小鼠脑的可溶部分中，长期给药多奈必利和氟必利(1mg/kg，每周两次)能够显著降低aβ42水平(对于多奈必利，与载体相比*p<0.05，对于氟必利，与载体相比****p<0.0001，通过单因素方差分析和tukey检验确定)，在aβ40水平上没有任何变化。同样，在不溶部分中，多奈必利降低了小鼠脑中aβ40的负荷(与载体相比，*p<0.05，通过单向anova和随后的tukey检验确定)。两种药物均不影响不溶aβ40的水平。多奈必利和氟必利对5xfad小鼠的记忆、csf中淀粉样蛋白负荷、淀粉样斑块和星形胶质细胞增生的影响本研究使用了28只雌性5xfad小鼠(c57bl/6j遗传背景)。从1到4月龄，小鼠每周两次接受(腹腔注射)载体或化合物(1mg/kg)三个月。在处理结束时，在新颖物体识别测试(nor)中评估了小鼠的长期记忆性能。期间间隔24小时。由于在训练期间，没有小鼠未能探索两个物体中的任何一个或探索两个物体两者的时间少于10秒，因此所有小鼠都被包括在数据分析中。抗健忘作用。将一月龄的5xfad雌性和野生型同窝仔用rs67333、载体，多奈必利或氟必利(1mg/kg，每周两次，共3个月)进行处理，然后通过新颖物体识别(nor)测试评估识别记忆力。处理结束后三天开始进行习惯化训练，以避免干扰急性效应。训练期与测试之间的间隔为24小时。载体处理的小鼠表现出记忆力受损，无法区分新颖物体与熟悉的物体，如相似的探索时间和非显著的辨别指数所显示。rs67333处理可逆转认知障碍，如与用载体处理的小鼠相比，用于探索新颖物体的时间所占比例更高(与熟悉的物体相比，**p<0.01，由双因素anova和sidak检验确定)。同样，多奈必利和氟必利的长期处理也可以防止记忆改变(对于多奈必利，与熟悉的物体相比，**p<0.01，对于氟必利，与熟悉的物体相比，*p<0.05，通过双因素anova和sidak检验确定)。3个化合物处理组的辨别指数不同于零，即机会水平(由未配对的学生t检验确定)。训练过程中的总探索时间在四个组中没有显著差异，这表明用多奈必利或氟必利处理的5xfad小鼠的识别记忆改善并不是探索活动的增加所致。csf中的淀粉样蛋白负荷。与对照组相比，经rs67333、多奈必利或氟必利处理的5xfad小鼠的脑脊液(csf)中aβ40的浓度(1mg/kg，每周两次，持续3个月)无显著差异，提示长期5-ht4受体刺激不会影响csf中的淀粉样蛋白水平(由单因素anova和随后的tukey检验确定)。抗淀粉样蛋白作用。额叶皮质、海马和内嗅皮质被分析为5xfad小鼠脑(额叶、正中和尾巴部分)以及受阿尔茨海默病早期影响且高度富集淀粉样蛋白沉积物的人脑区域的代表性面积。多奈必利处理(1mg/kg，每周两次，持续3个月)与额叶皮质中的载体(减少了16±3％，与载体相比，**p<0.01)和内嗅皮质中的载体(减少了24±4％，与载体相比，**p<0.01)相比，显著减少了淀粉样斑块的数量。与对照相比，氟必利处理(1mg/kg，每周两次，持续3个月)后，内嗅皮质中的斑块数量也显著减少，减少了28±6％(**与载体相比，p<0.01)。rs67333处理(1mg/kg，每周两次，持续3个月)额皮质和内嗅皮质均未见明显效果。与对照组相比，用rs67333、多奈必利或氟必利(1mg/kg，每周两次，持续3个月)处理的5xfad小鼠海马中的淀粉样斑块数量没有显著差异。统计信息由单因素方差分析(anova)和图基检验确定。抗炎作用。星形胶质细胞的免疫组织化学评估(抗gfap抗体，神经胶质纤维酸性蛋白)显示，多奈必利和rs67333长期处理(1mg/kg，每周两次，持续3个月)显著减少了星形胶质细胞增生(与接受载体的对照组相比，处理动物的内脏脑切片中gfap染色降低了54±10％和62±6％，与载体相比*p<0.01)。在内嗅皮质中，氟必利处理(1mg/kg，每周两次，持续3个月)可减少gfap染色的51±5％，接近显著水平(p＝0.06)。但是，与对照组相比，经rs67333、多奈必利或氟必利(1mg/kg，每周两次，持续3个月)处理的5xfad小鼠的额叶皮质或海马中gfap染色没有显著差异。统计信息由单因素方差分析(anova)和图基检验(tukey'stest)确定。结论这项研究表明，对5xfad小鼠(阿尔茨海默病的转基因小鼠)进行长期给药后，多奈必利和氟必利可以发挥抗淀粉样作用(降低aβ42水平和淀粉样蛋白斑)和抗炎作用(减少星形胶质细胞增生)。这些作用在内嗅皮质和额叶皮质中最明显。此外，长期给药多奈必利和氟必利能够发挥抗遗忘作用并防止5xfad小鼠出现记忆力减退。所有这些作用与rs67333(作为参考选择的5-ht4受体激动剂)具有可比性，有时甚至更大，指出多奈必利和氟必利是对抗阿尔茨海默病的有前景的药物。实施例4该实施例公开了如上定义的通式(i)的多种化合物对淀粉样肽寡聚体中毒的海马神经元的神经保护作用。材料和方法海马神经元的原代培养按callizot等人(2013)神经科学杂志(j.neurosci.res.)91：706-716所述培养大鼠海马神经元。简而言之，将妊娠17天的妊娠雌性大鼠(wistar大鼠；扬维耶实验室(janvierlabs)，法国)在co2室使用深度麻醉和颈脱位处死。然后，将胎儿从子宫中取出，并立即放入含2％青霉素(10,000u/ml)、链霉素(10mg/ml)溶液(ps)和1％牛血清白蛋白(bsa)的冰冷l15leibovitz培养基中。将海马在37℃下用终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％edta的胰蛋白酶-edta溶液处理20分钟。加入含4.5g/l葡萄糖的杜氏改良的伊格尔培养基(dmem)终止解离，该培养基含有ii级dna酶i(终浓度为0.5mg/ml)和10％胎牛血清(fcs)。通过10ml移液枪头的吹打三次将细胞机械解离。然后将细胞在4℃以515×g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬在限定的培养基中，该培养基由含有2％的b27补充剂溶液、2mmol/ll-谷氨酰胺、2％ps溶液和10ng/ml脑源性神经营养因子(bdnf)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排斥试验，在neubauer细胞仪中对活细胞进行计数。将细胞以每孔20,000的密度接种在预先涂有聚l-赖氨酸的96孔板中，并在37℃的空气(95％)-co2(5％)培养箱中培养。每2天更换一次培养基。对于96孔板，仅使用60孔。不使用第一行和列及最后一行和列的孔(以避免任何边缘效应)，并用无菌水填充。测试化合物和人类aβ1-42暴露测试化合物：测试了以下化合物：-mr31193-mr31176-mr31192，和-mr33583预培养：在培养的第17天，将化合物溶解在培养基中，并在暴露于aβ1-42之前与原代海马神经元预培养1小时。损伤：培养17天后，海马神经元暴露于aβ溶液(见下文)。按照callizot等人(2013)神经科学杂志(j.neurosci.res.)91：706-716.中描述的方法完成aβ1-42的制备。本研究中使用的aβ1-42批号包含10％的低聚物(如combes等人(2015)神经科学杂志(j.neurosci.res.)93：633-643中所述，通过wb进行定量)。简而言之，将aβ1-42肽以40μmol/l的初始浓度溶解在上述限定的培养基中。将该溶液在黑暗中于37℃轻轻搅拌3天，并在培养基中适当稀释至所用浓度(20μmol/l或2.5μmol/l，分别对应于低聚物(aβo)的2μmol/l或0.25μmol/l)后立即使用。加入aβ1-42制剂，使其在化合物存在下在对照培养基中稀释至终浓度为20或2.5μmol/l(分别为2μmol/l或0.25μmol/l的aβo，通过自动wb测定)。终点评估中毒后24小时，将上清液取出并立即冷冻以用于将来的分析。将它们在-20℃下保存长达6个月。然后，在-20℃下，用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定海马神经元5分钟。将它们在pbs中再次洗涤两次，然后透化，并使用含有0.1％皂苷和1％fcs的pbs溶液在室温下封闭非特异性位点15分钟。免疫染色：map-2/at100-固定和透化后，将细胞与以下物质培养2小时：-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/1000的比例稀释的鸡多克隆抗体抗微管相关蛋白2(map-2)(该抗体特异性染色细胞体和神经突，允许研究神经元细胞死亡和神经突网络)；和-在含1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的小鼠单克隆抗体抗磷酸tau(at100)。在含1％fcs、0.1％皂苷的pbs中用1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗鸡igg在室温下处理1小时以显示这些抗体。对于每种情况，使用(分子仪器)以20倍的放大倍率拍摄每孔30张照片(代表整个孔区域)。所有图像均使用相同的采集参数生成。根据图像，分析是由自定义模块编辑程序(custommodule)(分子仪器)直接自动进行的。研究了以下读数：-神经元总数(神经元存活，map-2阳性神经元的数量)-神经突网络(以μm的map-2阳性神经元表示)-at100的面积(μm2，与map-2阳性神经元重叠)。免疫染色：psd95和syn-固定和透化后，将细胞与以下物质培养2小时：-在含1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/200稀释的小鼠单克隆抗体抗突触后致密物95kda(psd95)；-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的兔多克隆抗体抗突触小泡蛋白(syn)。在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中用1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗兔igg在室温下处理1小时以显示这些抗体。对于每种情况，使用(分子仪器)以40倍的放大倍率拍摄每孔40张照片(代表整个孔区域)。所有图像均使用相同的条件生成。突触评估是使用自定义模块编辑程序(custommodule)(分子仪器)直接自动进行的。评估了以下终点：-突触数量(psd95/syn之间重叠)统计分析所有值均表示为平均值+/-sem(平均值的标准误差)。通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行dunnett或lsdfisher检验。p<0.05被认为是显著的。结果获得了以下结果。-mr31193显示出强大的神经保护作用(存活、神经突和突触网络)。如图1和2所示，该效果遵循钟形曲线，在存活和神经突网络中，浓度为100nm时观察到最大效果(图1a-c)。在较低浓度(5nm至100nm之间，图2)获得了对突触网络的最大作用。还观察到了对tau过度磷酸化的显著影响，在50nm时产生了最大作用(见图1d)。-从图3和图4中可以看出，mr31176在高浓度时(存活、神经突和突触网络)显示出神经保护作用。在高浓度时也观察到对tau过度磷酸化的显著影响(见图3d)。-从图5和图6中可以看出，mr31192在非常低的剂量下显示出非常强的神经保护作用(例如对于存活期为1-5nm，见图5a)。在每个测试剂量下，神经突网络也观察到非常大的作用(见图5b)。如图5c所示，该化合物甚至显示出神经营养作用(它诱导了神经突生长)。在低剂量(1-5nm，见图6)下，突触的数量也增加了。还观察到了对tau过度磷酸化的重要作用(见图5d)。-mr33583还观察到了钟形曲线的神经保护作用(见图7和图8)。活性浓度高于50-500nm。在几乎每个测试剂量下都观察到对神经突网络的强烈影响(见图7b)。还观察到了对tau过度磷酸化的钟形效应，在50-100nm时具有最大效应(见图7d)。这些结果证实，所有测试的通式(i)的化合物都是神经保护剂，化合物mr31193、mr31192和mr33583是特别有效的。实施例5该实施例显示了化合物mr31192和mr36014的神经保护作用。材料和方法海马神经元的原代培养按callizot等人(2013)神经科学杂志(j.neurosci.res.)91：706-716所述培养大鼠海马神经元。简而言之，将妊娠17天的雌性妊娠大鼠(wistar大鼠；扬维耶实验室(janvierlabs)，法国)在co2室使用深度麻醉和颈脱位处死。然后，将胎儿从子宫中取出，并立即放入含2％青霉素(10,000u/ml)、链霉素(10mg/ml)溶液(ps)和1％牛血清白蛋白(bsa)的冰冷l15leibovitz培养基中。将海马在37℃下用终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％edta的胰蛋白酶-edta溶液处理20分钟。加入含4.5g/l葡萄糖的杜氏改良的伊格尔培养基(dmem)终止解离，该培养基含有ii级dna酶i(终浓度为0.5mg/ml)和10％胎牛血清(fcs)。通过10ml移液枪头的吹打三次将细胞机械解离。然后将细胞在4℃以515×g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬在限定的培养基中，该培养基由含有2％的b27补充剂溶液、2mmol/ll-谷氨酰胺、2％ps溶液和10ng/ml脑源性神经营养因子(bdnf)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排斥试验，在neubauer细胞仪中对活细胞进行计数。将细胞以每孔20,000的密度接种在预先涂有聚l-赖氨酸的96孔板中，并在37℃的空气(95％)-co2(5％)培养箱中培养。每2天更换一次培养基。对于96孔板，仅使用60孔。不使用第一行和列及最后一行和列的孔(以避免任何边缘效应)，并用无菌水填充。测试化合物和人类aβ1-42暴露测试化合物：测试了以下化合物：-mr31192，-mr36014，和-多奈哌齐预培养：在培养的第17天，将化合物溶解在培养基中，并在暴露于aβ1-42之前与原代海马神经元预培养1小时。损伤：培养17天后，海马神经元暴露于aβ溶液(见下文)。按照callizot等人(2013)神经科学杂志(j.neurosci.res.)91：706-716.中描述的方法完成aβ1-42的制备。本研究中使用的aβ1-42批号包含10％的低聚物(如combes等人(2015)神经科学杂志(j.neurosci.res.)93：633-643中所述，通过wb进行定量)。简而言之，将aβ1-42肽以40μmol/l的初始浓度溶解在上述限定的培养基中。将该溶液在黑暗中于37℃轻轻搅拌3天，并在培养基中适当稀释至所用浓度(20μmol/l或2.5μmol/l，分别对应于低聚物(aβo)的2μmol/l或0.25μmol/l)后立即使用。加入aβ1-42制剂，使其在化合物存在下在对照培养基中稀释至终浓度为20或2.5μmol/l(分别为2μmol/l或0.25μmol/l的aβo，通过自动wb测定)。终点评估中毒后24小时，将上清液取出并立即冷冻以用于将来的分析。将它们在-20℃下保存长达6个月。然后，在-20℃下，用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定海马神经元5分钟。将它们在pbs中再次洗涤两次，然后透化，并使用含有0.1％皂苷和1％fcs的pbs溶液在室温下封闭非特异性位点15分钟。免疫染色：map-2/at100-固定和透化后，将细胞与以下物质培养2小时：-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/1000的比例稀释的鸡多克隆抗体抗微管相关蛋白2(map-2)(该抗体可特异性染色细胞体和神经突，允许研究神经元细胞死亡和神经突网络)；和-在含1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的小鼠单克隆抗体抗磷酸tau(at100)。在含1％fcs、0.1％皂苷的pbs中以用1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗鸡igg在室温下处理1小时以显示这些抗体。对于每种情况，使用(分子仪器)以20倍的放大倍率拍摄每孔30张照片(代表整个孔区域)。所有图像均使用相同的采集参数生成。根据图像，分析是由自定义模块编辑程序(custommodule)(分子仪器)直接自动进行的。测量了以下读数：-神经元总数(神经元存活，map-2阳性神经元的数量)-神经突网络(以μm的map-2阳性神经元表示)-at100的面积(μm2，与map-2阳性神经元重叠)。免疫染色：psd95和syn-固定和透化后，将细胞与以下物质培养2小时：-在含1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/200稀释的小鼠单克隆抗体抗突触后致密物95kda(psd95)；-在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的兔多克隆抗体抗突触小泡蛋白(syn)。在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中以1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和alexafluor568山羊抗兔igg在室温下处理1小时以显示这些抗体。对于每种情况，使用(分子仪器)以40倍的放大倍率拍摄每孔40张照片(代表整个孔区域)。所有图像均使用相同的采集参数生成。突触评估是使用自定义模块编辑程序(custommodule)(分子仪器)直接自动进行的。评估了以下终点：-突触数量(psd95/syn之间重叠)统计分析所有值均表示为平均值+/-sem(平均值的标准误差)。通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行dunnett或lsdfisher检验。p<0.05被认为是显著的。结果从图9和图10可以看出，化合物mr31192在高达500pm的浓度是有活性的(存活和神经突网络，见图9a，b，c)，在100pm处还观察到tau过度磷酸化(见图9d)也明显减少。在500pm时进一步观察到了对突触的神经保护作用(见图10)。因此，化合物mr31192在非常低的剂量下，特别是在低于100nm的剂量(在100pm和500pm之间)下是有效的。在非常低的剂量下，mr31192的神经保护作用与多奈哌齐相似，但浓度为1μm。从图11和12可以看出，化合物mr36014(mr31192的氟类似物)显示出与mr31192在nm剂量相似的神经保护作用。在pm剂量下也观察到了神经保护作用。这种作用对于存活和神经突网络(见图11a，b，c)以及tau过度磷酸化(见图11d)特别重要。浓度高达50pm时，对突触的影响非常明显(见图12)。在非常低的剂量下，mr36014的神经保护作用几乎与多奈哌齐所观察到的相同，但为1μm。因此，两种化合物都在非常低的剂量(nm剂量和pm剂量)下具有活性，这对于避免潜在的毒性和/或副作用尤为令人关注。实施例6本实施例显示了mr36014和mr33583对mpp+损伤的多巴胺能th阳性神经元的神经保护作用。帕金森病(pd)是一种常见的神经退行性运动障碍，可影响70岁以上的约1％的人。这是仅次于阿尔茨海默病的第二大常见神经退行性疾病。患有pd的患者在70％的病例中表现出运动不稳定的症状，其中以静息性震颤为第一症状。其他临床症状包括僵硬、运动迟缓和姿势不稳，通常包括认知障碍、抑郁和睡眠障碍。尽管导致黑质(sn)变性的病理机制可能有很多种，但仍认为有几种途径很重要：与蛋白酶体损伤、线粒体功能障碍(也由特定的da毒素引起)和多巴胺(da)释放损伤有关的蛋白质聚集。如dauer和przedborski(2003)神经元(neuron)39：889-909所确认的，多巴胺能神经元特异性毒素(da-toxins)，特别是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(mptp，神经毒素mpp+的前药)、6-羟基多巴胺(6-ohda)或鱼藤酮会引起人体帕金森病。这些毒素被科学家们广泛用于通过实验模仿动物的病理学。任何降低da毒素神经毒性的物质都可以用作治疗或预防pd的新治疗剂。本研究的目的是研究mr36014和mr33583(4种浓度)对mpp+损伤的多巴胺能th阳性神经元的神经保护作用。在使用mpp+(4μm，持续48h)之前，将测试化合物预培养1小时。研究了测试化合物的神经保护作用(存活和神经突网络)。此外，研究了对细胞质α-突触核蛋白积累的影响。材料和方法中脑神经元的原代培养所有实验均按照美国国家卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》进行，并遵循欧盟现行法规(指令2010/63/eu)。协议号：a1301310。如callizot等(2019)plosone14：e0215277和visanji等(2008)fasebj.22：2488-2497所述，培养大鼠多巴胺能神经元。简而言之，妊娠15天的雌性妊娠大鼠(wistar)在co2室使用深度麻醉和颈脱位处死。在显微镜下解剖从15日龄的大鼠胚胎(扬维耶，法国)获得的中脑。取出胚胎中脑并将其置于含有2％青霉素-链霉素(ps)和1％牛血清白蛋白(bsa)的leibovitz(l15)的冰冷培养基中。中脑弯曲的腹侧部分是发育中的脑中富集多巴胺能神经元的区域，用于细胞制备。中脑在37℃下通过胰蛋白酶消化20分钟而解离(溶液的终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％edta)。加入杜氏改良的伊格尔培养基(dmem)来终止反应，该培养基含有ii级dnaasei(0.5mg/ml)和10％的胎牛血清(fcs)。然后通过10ml移液枪头的吹打三次将细胞机械解离。随后将细胞在4℃下于l15培养基中的bsa(3.5％)层上以180×g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀物重悬于限定的培养基中，该培养基由补充有b27(2％)、l-谷氨酰胺(2mm)、2％ps溶液、10ng/ml脑源性神经营养因子(bdnf)和1ng/ml胶质细胞衍生的神经营养因子(gdnf)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排斥试验，在neubauer细胞仪中对活细胞进行计数。将细胞以40,000个细胞/孔的密度接种在96孔板(预涂有聚-l-赖氨酸)中，并保持在37℃、5％co2/95％空气气氛的加湿培养箱中。每两天用新鲜培养基更换一半培养基。简而言之，在培养的第6天，除去培养基，并加入新鲜培养基，在有或没有测试化合物的情况下以及有或没有mpp+的情况下，在对照培养基中稀释48小时。每种条件对6个孔进行了评估。测试化合物和mpp+暴露预培养：在培养的第6天，在暴露于mpp+之前，将化合物在培养基中稀释并与初级多巴胺能神经元预培养1小时。损伤：测试化合物培养1小时后，将mpp+加入至终浓度4μm，在化合物存在下于培养基中稀释48小时。组织培养板将测试化合物在96孔板中进行测试(每种条件下n＝6个培养孔)。在mpp+中毒之前，将mr36014和mr33583预培养1小时。评估了以下条件：板1(th/α-syn)对照(载体)+mpp+(4μm,48h)/载体+mpp+(4μm,48h)/mr36014500pm+mpp+(4μm,48h)/mr360141nm+mpp+(4μm,48h)/mr360145nm+mpp+(4μm,48h)/mr3601410nm+mpp+(4μm,48h)/mr33583500pm+mpp+(4μm,48h)/mr335831nm+mpp+(4μm,48h)/mr335835nm+mpp+(4μm,48h)/mr3358310nm终点评估中毒48小时后，取出细胞培养上清液，并立即冷冻以备将来分析。在室温下，将细胞用4％多聚甲醛的pbs(ph＝7.3)溶液固定20分钟。将细胞在pbs中洗涤两次。使用含有0.1％皂苷和1％fcs的pbs溶液在室温下进行细胞膜透化和非特异性位点封闭15分钟。免疫染色：th和α-syn-将培养物与以下物质一起培养：-在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中以1/10,000的稀释度在小鼠中产生的单克隆抗酪氨酸羟化酶(th)抗体，在室温下培养2小时。-在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中以1/200的稀释度在兔中产生的多克隆抗α突触核蛋白(α-syn)抗体，在室温下培养2小时。在含1％fcs、0.1％皂苷的pbs中以1/800稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg和以1/400稀释的alexafluor568山羊抗兔igg在室温下处理1小时，以显示这些抗体。自动计算机分析-对于每种情况，使用相同的采集参数，使用(分子仪器)以10倍的放大倍率(20张图片)自动拍摄20张图片(代表整个孔区)。根据图像，分析是由自定义模块编辑程序(custommodule)(分子仪器)直接自动进行的。测量了以下读数：-分析th神经元总数(th阳性神经元)，-th阳性神经元的总神经突网络(以μm计)-α-syn聚集(th和α-syn染色之间重叠的面积，以μm2计)统计分析所有值均表示为平均值+/-sem(平均值的标准误差)。通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行dunnett或lsdfisher检验。p＜0.05被认为是显著的。结果mr36014对mpp+损伤后th神经元的存活、神经突网络和α-syn聚集的影响。如先前所示，通过降低存活率(图13a)、丧失神经突网络(图13b)和α-syn的病理性聚集(图13c)可以观察到，mpp+的给药对多巴胺能神经元具有明显的神经毒性(如callizot等(2019)plosone14：e0215277)。mr36014的给药对th神经元具有强大的整体神经保护作用，因为该化合物改善th神经元存活(从1nm到10nm)，保护其神经突网络(所有研究剂量)并减少α-syn的积累(所有研究剂量)。mr33583对mpp+损伤后th神经元的存活、神经突网络和α-syn聚集的影响。mpp+损伤后，mr33583改善了神经元存活(100nm，见图14a)并部分保护了神经突网络(从10nm到100nm，见图14b)。还观察到了mr33583对α-syn聚集的积极作用(50nm和100nm，见图14c)。讨论该研究的目的是研究mr36014和mr33583在帕金森病体外模型中的神经保护作用。这项研究表明：-两种化合物均能抵消mpp+对多巴胺能神经元的毒性，-mr36014比mr33583更有效，因为该化合物在促进th神经元存活方面显示出更高的功效。-mr36014具有活性的剂量低于mr33583。总之，这项研究表明mr36014和mr33583是帕金森病的有趣候选药物，并且mr36014比mr33583更具活性。实施例7该实施例公开了对谷氨酸盐损伤后化合物mr36014和mr33583对大鼠原代皮质神经元的神经保护作用的评估。谷氨酸能系统，尤其是nmda受体(谷氨酸能受体)在学习和记忆过程中起主要作用。突触可塑性可通过nmda受体信号传导来调节。然而，nmda受体的过度活化和谷氨酸能兴奋性毒性是神经退行性疾病的常见病理特征(lewerenz和maher(2015)神经科学前沿(frontneurosci.)9:469)。谷氨酸盐兴奋性毒性与阿尔茨海默病(ad)和亨廷顿病(hd)中局部缺血和脑外伤引起的急性神经系统损害以及慢性神经退行性疾病有关。通过过度激活nmdar引起的兴奋性神经元死亡会导致钙(ca2+)过量流入细胞。这会触发一系列反应，导致细胞死亡，包括氧化应激增加、蛋白酶(例如钙蛋白酶)的不适当活化，ca2+-相关途径的失调、线粒体损伤和凋亡级联反应。根据这种观点，早期用降低谷氨酸盐兴奋性毒性的物质进行药物治疗，可能是改善神经元存活率(并改善认知功能)的一个很好的选择，并且可能对诊断为阿尔茨海默病的患者而言是一种有趣的治疗策略(wang和reddy(2017)老年痴呆症(j.alzheimersdis.)57:1041-1048)。本研究评估了谷氨酸盐损伤后mr36014和mr33583(4种浓度)对大鼠原代皮质神经元的神经保护作用。在施用谷氨酸盐(20μm培养20分钟)之前将测试化合物预培养1小时。研究了测试化合物的神经保护作用(存活和神经突网络)。材料和方法皮质神经元的原代培养所有实验均按照美国国家卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》进行，并遵循欧盟现行法规(指令2010/63/eu)。协议号：a1301310。如callizot等人在(2013)神经科学杂志(j.neurosci.res.)91:706-716中所述培养大鼠皮质神经元。妊娠15天的雌性妊娠大鼠(wistar)在co2室使用深度麻醉和颈脱位处死。简而言之，收集胎儿并立即将其置于含2％青霉素(10,000u/ml)和链霉素(10mg/ml)溶液(ps)以及1％牛血清白蛋白(bsa)的冰冷l15leibovitz培养基中。在37℃下用终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％edta的胰蛋白酶-edta溶液处理皮质20分钟。加入含4.5g/l葡萄糖的杜氏改良的伊格尔培养基(dmem)终止解离，该培养基含有ii级dna酶i(终浓度为0.5mg/ml)和10％胎牛血清(fcs)。通过10ml移液枪头的吹打三次将细胞机械解离。然后将细胞在4℃下以515×g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬在限定的培养基中，该培养基由含有2％的b27补充剂溶液、2mmol/ll-谷氨酰胺、2％ps溶液和10ng/ml脑源性神经营养因子(bdnf)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排斥试验，在neubauer细胞仪中对活细胞进行计数。将细胞以每孔25,000的密度接种在预先涂有聚l-赖氨酸的96孔板上，并在37℃的空气(95％)-co2(5％)培养箱中培养。为了避免边缘效应，在研究中未使用板的第一列和第一行以及最后一列和最后一行。空的孔里装满了水。每2天更换一次培养基。培养11天后，皮质神经元被aβ溶液(见下文)损伤。测试化合物和谷氨酸盐暴露预培养：在培养的第13天，将化合物溶解在培养基中，并在暴露谷氨酸盐之前与初级皮质神经元预培养1小时。损伤：在测试化合物培养1小时后，添加谷氨酸盐至终浓度为20μm，在仍然存在有测试化合物的情况下在对照培养基中稀释20分钟。20分钟后，将谷氨酸盐洗出并再添加含有测试化合物的新鲜培养基48小时。组织培养板将测试化合物在96孔板中进行测试(每种条件下n＝6个培养孔)。评估了以下条件：板1(map-2)对照(载体)+谷氨酸盐(20μm,20min)/载体+谷氨酸盐(20μm,20min)/mr36014500pm+谷氨酸盐(20μm,20min)/mr360141nm+谷氨酸盐(20μm,20min)/mr360145nm+谷氨酸盐(20μm,20min)/mr3601410nm+谷氨酸盐(20μm,20min)/mr335831nm+谷氨酸盐(20μm,20min)/mr3358310nm+谷氨酸盐(20μm,20min)/mr3358350nm+谷氨酸盐(20μm,20min)/mr33583100nm终点评估免疫染色：map-2(存活和突触网络)-中毒后48小时，取出细胞培养上清液，并立即冷冻以备将来分析。通过在-20℃下用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定细胞5分钟。将细胞在pbs中洗涤两次。将细胞透化，并在室温下用含有0.1％皂苷和1％fcs的pbs溶液封闭非特异性结合位点15分钟。将培养物与小鼠单克隆抗体抗微管相关蛋白2(map-2)稀释1/400，在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中培养2小时。在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中用alexafluor488山羊抗小鼠igg(1/400稀释液)在室温下1小时以显示该抗体。map-2是存在于神经元细胞体和神经突中的神经元标记物，可用于研究神经元存活和神经突网络的长度。自动计算机分析-对于每种情况，使用(分子仪器)以20倍放大率拍摄每孔30张照片(代表所有孔区域)。所有图像将使用相同的采集参数生成。根据图像，分析是由自定义模块编辑程序(custommodule)(分子仪器)直接自动进行的。将对以下读数进行调查：-总神经元存活(map-2阳性，数量)(数据将表示为每孔30张图片的平均神经元数量)。-总神经突网络(map-2以μm为单位)(数据将表示为每孔30张图片的神经元平均值)。统计分析所有值均表示为平均值+/-sem(平均值的标准误差)。通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行dunnett或lsdfisher检验。p＜0.05被认为是显著的。结果mr36014和mr33583对谷氨酸盐损伤的皮质神经元的影响。谷氨酸能损伤引起皮质神经元的丧失(图15a和15c；32％的神经元死亡)和总神经突网络的萎缩(图15b和15d；38％的神经突丧失)。神经元存活。mr36014，在谷氨酸盐之前1小时添加，并在谷氨酸盐应用后放置48小时，可在1nm时显著保护皮质神经元免于死亡(见图15a)。在相同的实验条件下，mr33583确实在50nm和100nm时显著保护了皮质神经元免于死亡(见图15c)。神经突网络。所有经过mr36014测试的浓度(500pm至10nm)均能有效保护神经突网络，在1nm时发挥最大作用(见图15b)。mr33583可以在1nm到100nm时显著保护神经突网络。该效果遵循钟形曲线，在50nm时具有最大效果(请参见图15d)。讨论该研究的目的是研究mr36014和mr33583在由谷氨酸能兴奋性毒性诱导的神经元应激的体外模型中的神经保护作用。谷氨酸能应激是包括阿尔茨海默病和脑缺血在内的不同神经系统疾病的病理特征。根据研究结果，可以得出以下结论：-两种化合物均能抵消谷氨酸对皮质神经元的毒性，-mr36014和mr33583表现出相似的功效，尽管mr36014在较低剂量下具有活性(在神经元存活方面)。总之，这项研究表明，mr36014和mr33583是涉及谷氨酸能应激的神经系统疾病的有趣药物候选物。实施例8该实施例公开了谷氨酸盐损伤后mr36014和mr33583对大鼠原代皮质神经元的神经保护作用的评估。肌萎缩性侧索硬化症(als)是一种致命疾病，其特征是局灶性肌无力的微弱发作，通常在四肢中，但有时在延髓肌中，发展为几乎所有骨骼肌的瘫痪。als和额颞叶性痴呆(ftld)之间存在重大的临床病理和遗传重叠。在als中，呼吸麻痹导致的死亡通常在五年内发生。细胞病理在发病时是致命的，并以连续的神经元群体连续参与的模式扩散。运动神经元的死亡与运动神经元和少突胶质细胞中聚集蛋白的沉积以及神经发炎有关。als的复杂病理生理学提出了许多潜在的治疗目标。尽管已经研究了各种各样的药剂，但只有利鲁唑(riluzole)(抗谷氨酸能药物)已显示出一致的益处，并且它是唯一被批准用于治疗该疾病的药物。但是，利鲁唑的益处中等-可以将als患者的生存期延长数月(约7％)，而对功能性措施的影响却很小。尽管尚不清楚导致als中运动神经元死亡的确切分子途径，但一些可能的机制包括：a)谷氨酸盐介导的兴奋性毒性；b)减少神经营养因子(bdnf，gdnf…)；c)线粒体改变和氧化损伤；d)细胞骨架蛋白异常导致神经元萎缩和死亡。在大多数als患者中，tdp-43(反式激活响应元件dna结合蛋白43kda)已显示在运动神经元细胞质中蓄积。tdp43是一种涉及rna加工的多个方面的核rna结合蛋白，可在细胞核与细胞质之间主动穿梭。本研究的目的是评估谷氨酸盐损伤后mr36014和mr33583(4种浓度)对原发性脊髓运动神经元(mn)的影响。材料和方法脊髓运动神经元的原代培养所有实验均按照美国国家卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》进行，并遵循欧盟现行法规(指令2010/63/eu)。协议号：a1301310。如martinou等人(1992)神经元(neuron.)8:737-744和wang等(2013)i人体分子遗传学(hum.mol.genet.)22:4706-4719中所述，培养大鼠脊髓运动神经元(mn)。简而言之，妊娠14天的雌性妊娠大鼠(wistar大鼠；扬维耶实验室，法国)在co2室使用深度麻醉和颈脱位处死。然后，将胎儿从子宫中取出，并立即置于冰冷的l15leibovitz培养基中，该培养基中含有2％青霉素(10,000u/ml)和链霉素(10mg/ml)溶液(ps)及1％牛血清白蛋白(bsa)。用终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％edta的胰蛋白酶-edta溶液在37℃处理脊髓20分钟。加入含4.5g/l葡萄糖的杜氏改良的伊格尔培养基(dmem)终止解离，该培养基含有ii级dna酶i(终浓度为0.5mg/ml)和10％胎牛血清(fcs)。通过10ml移液枪头的吹打三次将细胞机械解离。然后将细胞在4℃以515×g离心10分钟。弃去上清液，并将沉淀物重悬在限定的培养基中，该培养基由含有2％的b27补充剂溶液、2mmol/ll-谷氨酰胺、2％ps溶液和10ng/ml脑源性神经营养因子(bdnf)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排斥试验，在neubauer细胞仪中对活细胞进行计数。将细胞以每孔20,000的密度接种在预先涂有聚l-赖氨酸的96孔板中，并在37℃的空气(95％)-co2(5％)培养箱中培养。每2天更换一次培养基。第一行和第一列的孔不用于培养(以避免边缘效应)，并用无菌水填充。培养13天后，运动神经元被谷氨酸盐损伤。测试化合物和谷氨酸盐暴露预培养：在培养的第13天，将化合物溶解在培养基中，并在暴露谷氨酸盐之前与初级皮质神经元预培养1小时。谷氨酸盐损伤：在培养的第13天，以及预培养1小时后，添加谷氨酸盐至终浓度为5μm，在仍存在化合物的情况下在对照培养基中稀释20分钟。20分钟后，将谷氨酸盐洗出，并在24小时内加入含有化合物的新鲜培养基。组织培养板将测试化合物在96孔板中进行测试(每种条件下n＝6个培养孔)。评估了以下条件：板1(map-2/tdp-43)运动神经元对照(载体)+谷氨酸盐(5μm,20min)/载体+谷氨酸盐(5μm,20min)/mr36014(500pm)+谷氨酸盐(5μm,20min)/mr36014(1nm)+谷氨酸盐(5μm,20min)/mr36014(5nm)+谷氨酸盐(5μm,20min)/mr36014(10nm)+谷氨酸盐(5μm,20min)/mr33583(1nm)+谷氨酸盐(5μm,20min)/mr33583(10nm)+谷氨酸盐(5μm,20min)/mr33583(50nm)+谷氨酸盐(5μm,20min)/mr33583(10nm)终点评估中毒后24小时，将上清液取出并立即冷冻以备将来分析。通过在-20℃下用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定细胞5分钟。用0.1％皂苷透化后，将细胞与以下物质培养2小时：-在含1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/400稀释的小鼠单克隆抗体抗微管相关蛋白2(map-2)。在室温下，在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中用1/400稀释的alexafluor488山羊抗小鼠igg处理1小时以显示该抗体。-在含1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/100稀释的兔多克隆抗体抗核tardna结合蛋白43(tdp-43)。在室温下，在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中用1/400稀释的alexafluor568山羊抗兔处理1小时以显示tdp-43抗体。对于每种情况，使用相同的采集参数，使用(分子仪器)以20倍的放大倍率自动拍摄每孔30张照片(代表整个孔区域)。根据图像，分析是由自定义模块编辑程序(custommodule)(分子仪器)直接自动进行的。终点分析自动评估了以下终点：-分析神经元存活(map-2染色，神经元数量)，-分析神经突网络(map-2染色，总神经突长度，以μm计)，-分析神经突网络/神经元(神经突网络/map2神经元数量)，-分析map-2阳性神经元中的细胞质tdp-43(以μm计，map-2和细胞质tdp-43重叠)。统计分析所有值均表示为平均值+/-sem(平均值的标准误差)。通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行fisherlsd测试。p＜0.05被认为是显著的。结果mr36014在谷氨酸盐损伤脊髓运动神经元原代培养中的作用神经元存活给予谷氨酸盐后丧失了大量的map-2脊柱运动神经元(42％的神经元死亡)(图16a)。在500pm和1nm时，mr36014显著提高了脊髓运动神经元的存活率。神经突网络当谷氨酸盐损伤时，神经突网络被严重减少(46％的神经突丧失，图16b)。mr36014在500pm和1nm时显著保护了神经突网络。神经突网络的长度与神经元的数量成比例。计算“神经突网络长度”/“神经元数量”之比，以估计每个神经元中神经突的平均长度。mr36014未修改该比率(图16c)。mr33583在谷氨酸盐损伤脊髓运动神经元原代培养中的作用神经元存活如图17所示，在给予谷氨酸盐之后丧失了大量的map-2脊柱运动神经元(图17a)。mr33583(在谷氨酸盐之前1小时添加，受伤后放置24小时)发挥剂量依赖性的神经保护作用(10至100nm)。神经突网络如图17所示，在谷氨酸盐损伤时神经突网络被严重减少(图17b)。mr33583以剂量依赖性方式从10nm到100nm显著保护了神经突网络。mr36014未修改该比率(图17c)。tdp43在最高剂量下，mr33583(100nm)降低了脊髓运动神经元细胞质中tdp43的信号(图17d)。讨论这项研究的目的是评估基于受谷氨酸盐损伤的脊髓运动神经元的原代培养物的肌萎缩性侧索硬化的体外模型中两种化合物mr36014和mr33583的神经保护作用。这项研究的结果表明：·mr36014在500pm和1nm时具有明显的神经保护作用，因为它改善了神经元的存活并保护了神经突网络。·mr33583对所有参数(神经元存活、神经突网络的保存和细胞质tdp43的积累)均显示出明显的神经保护作用。总之，这些结果表明，mr36014和mr33583能够介导脊髓运动神经元的神经保护，并且它们是肌萎缩性侧索硬化症的潜在候选药物。实施例9该实施例显示了在生长因子剥夺下mr33583对大鼠原代gaba能神经元的神经保护作用的评估。hd(亨廷顿病)是一种常染色体显性遗传的神经退行性疾病，其影响了白种人群中每10000人中的约4至10人。hd脑的特征是纹状体的msn(中棘神经元)丢失、脑室扩大以及相应的上皮皮质萎缩。gaba能细胞(γ-氨基丁酸)细胞是最多数量的纹状体的神经元细胞类型(大鼠中90-95％，人中85％以上)，以及少数量的中间神经元(wictorin(1992)神经生物学研究进展(prog.neurobiol.)38:611-639)。msn以其gad64酶的表达为特征。它们接收纹状体的大量输入，接收皮质、丘脑和中脑的传入神经，并且是纹状体的主要输出神经元，并投射到包括苍白球和黑质的cns(中枢神经系统)的各个区域。因此，它们在基底神经节内形成复杂的神经元回路，这些回路对于控制动作、认知和情绪很重要(nakano等(2000)神经科学杂志(j.neurol.)247(suppl.5):v1-v15).生长因子的重要性及其在神经退行性疾病(例如ad，pd或hd)中的降低通常被视为这些病理的多种原因之一。遗传性和药理性剥夺bdnf或gdnf会损害学习和记忆力，并导致神经元死亡(yamada等(2003)药理学杂志(j.pharmacol.sci.)91:267-270)。生长因子剥夺模型已经在几种神经元细胞类型中进行了表征，例如啮齿类动物神经元的原代培养(atabay等(1996)神经科学研究杂志(j.neurosci.res.)43:465-475)，人sk-n-sh和sh-sy5y神经母细胞瘤细胞(ba等(2003)神经科学方法杂志(j.neurosci.methods)123:11-22；russo等(2004)脑研究(brainres.)1009:40-53)。在这些被剥夺了生长因子的条件下，严重的活力丧失是由于凋亡细胞死亡所致，这是通过凋亡相关参数(包括裂解的胱天蛋白酶-3，parp和h2a.x)的显著上调检测到的。另外，已经显示出抗凋亡bcl-2的基因和蛋白质表达被下调，而促凋亡bax的基因和蛋白质表达被上调。另外，脑源性神经营养因子(bdnf)的剥夺已显示通过增加的p75ntr信号传导激活胱天蛋白酶来触发细胞死亡途径(yu等(2008)神经科学杂志(j.neurosci.)28:7467-7475)。有趣的是，bdnf-/-小鼠还表现出特定结构的神经解剖学改变和行为异常。它们在皮质和海马中显示出降低的树突复杂性和脊柱密度，在纹状体中甚至更大程度上，其中90％的受影响细胞是gaba能的msn(rauskolb等(2010)神经科学杂志(j.neurosci.)30:1739-1749)。这项研究的目的是研究亨廷顿病体外模型生长因子(bdnf和gdnf剥夺)剥夺后mr33583(4种浓度)对纹状体msn存活的神经保护作用。材料和方法gaba能神经元的原代培养所有实验均按照美国国家卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》进行，并遵循欧盟现行法规(指令2010/63/eu)。协议号：a1301310。如ivkovi等(1999)神经科学杂志(j.neurosci.)19:5409-5419和schinelli等(1988)神经化学杂志(j.neurochem.)50:1900-1907中所述，培养大鼠纹状体msn。简而言之，将妊娠15天的雌性妊娠大鼠在co2室使用深度麻醉和颈脱位处死。收集胎儿并立即将其置于冰冷的l15leibovitz培养基中，该培养基中含有2％青霉素(10,000u/ml)和链霉素(10mg/ml)溶液(ps)及1％牛血清白蛋白(bsa)。仅将中脑弯曲的受限腹侧部分用于细胞制备，因为这是发育中的脑中富集msn细胞的区域。将这些区域在37℃下用终浓度为0.05％胰蛋白酶和0.02％edta的胰蛋白酶-edta溶液处理20分钟。加入含4.5g/l葡萄糖的杜氏改良的伊格尔培养基(dmem)终止解离，该培养基含有ii级dna酶i(终浓度为0.5mg/ml)和10％胎牛血清(fcs)。通过10ml移液枪头的吹打三次将细胞机械解离。然后，将细胞在室温下于l15培养基中的bsa(3.5％)层上以180×g离心10分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀物重悬于限定的培养基中，该培养基由补充有b27(2％)、l-谷氨酰胺(2mm)、1％ps溶液、bdnf(10ng/ml)和gdnf(1ng/ml)的神经基础培养基组成。使用台盼蓝排斥试验，在neubauer细胞仪中对活细胞进行计数。将细胞以40,000个细胞/孔的密度接种在96孔板中(孔预先涂有聚l-赖氨酸)，并在37℃的空气(95％)/co2(5％)培养箱中培养。为了避免任何边缘效应，在研究中未使用板的第一列和最后一列以及第一行和最后一行。空的孔里装满了水。每2天更换一次培养基。测试化合物和生长因子剥夺预培养：在培养的第13天，将测试化合物在培养基中稀释并与gaba能神经元预培养1小时，然后剥夺生长因子(bdnf和gdnf)。生长因子剥夺：与测试化合物一起培养1小时后，用不含生长因子的培养基更换一半的培养基。剥夺进行96小时。组织培养板将测试化合物在96孔板中进行测试(每种条件下n＝6个培养孔)。评估了以下条件：板1(gad67)对照(载体)+生长因子剥夺/载体+生长因子剥夺/mr33583(1nm)+生长因子剥夺/mr33583(10nm)+生长因子剥夺/mr33583(50nm)+生长因子剥夺/mr33583(10nm)终点评估剥夺生长因子后96小时，取出细胞培养上清液，并立即冷冻以备将来分析。通过在-20℃下用乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定细胞5分钟。将细胞在pbs中洗涤两次，然后透化。在室温下用含有0.1％皂苷和1％fcs的pbs溶液封闭非特异性位点15分钟。免疫染色：gad67(存活)-将培养物与小鼠单克隆抗gad67抗体在含有1％胎牛血清和0.1％皂苷的pbs中以1/200的稀释度培养2小时(该抗体特异性染色gaba能神经元)。在室温下，在含有1％fcs、0.1％皂苷的pbs中用alexafluor488山羊抗小鼠igg(1/400稀释度)处理1小时以显示该抗体。自动计算机分析-对于每种情况，使用(分子仪器)以20倍的放大倍率拍摄每孔30张照片(代表整个孔区域)。所有图像均使用相同的采集参数生成。根据图像，分析是由自定义模块编辑程序(custommodule)(分子仪器)直接自动进行的。测量了以下读数：msn存活分析(gad67染色，gaba能神经元数量)。统计分析所有值均表示为平均值+/-sem(平均值的标准误差)。通过单因素方差分析进行统计分析，然后进行fisherlsd测试。p＜0.05被认为是显著的。结果mr33583在剥夺生长因子的应激下对gaba能神经元原代培养物的影响神经元存活剥夺生长因子后，大量的gad-67阳性gaba能神经元丧失(图18)。mr33583(50nm)发挥了显著的神经保护作用，显示出gaba能神经元存活的改善。讨论总之，这些结果表明mr33583能够促进gaba能神经元的神经保护作用(50nm)，并且可以是亨廷顿病的潜在候选药物。当前第1页12