一种链霉菌磷脂酶D突变体、改造方法及其应用与流程

文档序号：20371132发布日期：2020-04-14 13:11阅读：282来源：国知局

本发明涉及一种链霉菌磷脂酶d突变体、改造方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术：

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，ps)是一种唯一能够调控细胞膜关键蛋白功能的磷脂，对许多细胞代谢过程有重要的调节作用，其主要功能是可提高脑细胞活力，对治疗脑萎缩、预防老年痴呆症、改善老年人的大脑功能；同时修复大脑损伤、治疗儿童多动症具有非常显著的作用；另外可以促进脑疲劳的恢复，对于平衡情绪、缓解抑郁也有一定的疗效。自然界中天然的磷脂酰丝氨酸含量非常稀少，提取工艺繁杂，不足以满足人们的需求，因此制备纯度高、质量好的磷脂酰丝氨酸产品具有重要意义。

磷脂酰丝氨酸的制备方法比较多，其中以提取法和酶转化法为主。生物酶法主要是指以磷脂酰胆碱(pc)和丝氨酸作为反应底物，在磷脂酶d(pld)或磷脂酰丝氨酸合酶(pss)的催化作用下，发生转磷脂酰基反应生成磷脂酰丝氨酸。相较于传统的溶剂萃取法，微生物发酵生产磷脂酰丝氨酸具有较大的优越性，主要表现为以下两个方面：反应条件温和，不需要高温、高压、金属催化剂等条件，且生产过程容易控制，有利于维持稳定的产品质量；微生物代谢旺盛、生长繁殖较快，短时间内就可以完成一批发酵产品的生产。

几乎所有的磷脂酶d都是磷脂酶d超家族的成员，通过分析一些磷脂酶d蛋白质超家族成员的一级结构，发现“hxkxxxxd(hkd)”域在磷脂酶d的一级结构中以单拷贝或双拷贝的形式存在，且此结构域中含有的组氨酸残基对磷脂酶d的催化反应起关键的作用。来源于streptomycessp.pmf的磷脂酶d的晶体结构已被解析，且催化机理得到了研究，第一步，活性位点的一个组氨酸残基(his170)作为亲核试剂攻击底物磷脂酰胆碱的磷原子，形成一个带负电荷的五价磷的过渡状态；第二步，另一个组氨酸残基(his448)释放一个质子，提供氢给脱去的基团以产生磷脂酰胆碱和磷脂酰基－酶中间体；第三步，his448对进入的第二底物丝氨酸进行去质子化(脱去氢)；第四步，活化的丝氨酸作为攻击磷脂酰基－酶中间体中磷原子的第二亲核体，产生磷脂酰丝氨酸。

现有技术中已有利用pld催化磷脂酰胆碱(pc)和l-丝氨酸制备磷酯酰丝氨酸(ps)，但是野生型pld的转磷脂酰催化活性低，还需要通过蛋白质工程手段对其进行改造，设计满足工业生产需求的工具酶。

技术实现要素：

本发明提供了一种催化活性提高的pld突变体及其改造方法，并利用该突变体蛋白催化磷脂酰胆碱(pc)和l-丝氨酸制备磷酯酰丝氨酸(ps)。本发明获得的pld突变体催化活性高，催化效率较野生型磷脂酶d提高，该方法具有高催化活性，极大提高了工业化生产的生产效率。

本发明提供了一种链霉菌磷脂酶d突变体，所述突变体相对于磷脂酶d亲本，将第357氨基酸残基突变为苯丙氨酸得到突变体q357f，或将第405位氨基酸残基突变为丙氨酸得到突变体y405a，或将第357位和第405位氨基酸残基分别突变为苯丙氨酸和丙氨酸得到突变体q357f/y405a。

在本发明的一种实施方式中，所述链霉菌磷脂酶d亲本的氨基酸序列如seqidno.1所示，核苷酸序列如seqidno.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体q357f、y405a、q357f/y405a的氨基酸序列分别如seqidno.3，seqidno.5，seqidno.7所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体q357f、y405a、q357f/y405a的核苷酸序列分别如seqidno.4，seqidno.6，seqidno.8所示。

本发明提供一种所述的链霉菌磷脂酶d酶突变体的制备方法，所述方法包括以下步骤：

(1)质粒构建：设计突变所用引物，以链霉菌磷脂酶d亲本基因为模板进行突变并构建突变体的质粒载体；

(2)突变菌株构建：将突变质粒转化至大肠杆菌感受态细胞，得到重组突变菌株；

(3)目标蛋白的表达：挑选含有pld突变基因的突变菌株进行发酵培养、诱导，进而获得链霉菌磷脂酶d突变体的蛋白，用于后续转化实验。

在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述引物的序列：构建q357f突变体：如seqidno.9和seqidno.10所示的序列；构建y405a突变体：如seqidno.11和seqidno.12所示的序列；构建q357f/y405a突变体：如seqidno.9和seqidno.10以及如seqidno.11和seqidno.12所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的大肠杆菌为bl21。

在本发明的一种实施方式中，步骤(3)为所述重组菌株37℃培养至od600为0.6～1.0时加入0.4～0.6mmiptg诱导酶的表达，诱导温度为22～30℃，诱导时间1～4h。

本发明提供了一种含有编码所述突变体的核苷酸序列的重组载体，构建重组载体所用的质粒为pet28a(+)。

本发明提供了利用所述突变体催化生产磷酯酰丝氨酸(ps)中的方法，所述方法是将底物和突变体酶投入到反应器中进行催化；所述底物分别为大豆卵磷脂和l-丝氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述大豆卵磷脂终浓度为0.02～0.4mol/l，l-丝氨酸浓度为0.2～2.0mol/l，酶浓度为1g/l～100g/l。

在本发明的一种实施方式中，所述大豆卵磷脂终浓度为0.05～0.2mol，l-丝氨酸浓度为0.3～1mol，酶浓度为10g/l～50g/l。

在本发明的一种实施方式中，将所述重组菌株30～40℃培养至od600为0.4～1.0时加入0.4～0.6mmiptg诱导酶的表达，诱导温度为22～30℃，诱导1～4h。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌株37℃培养至od600为0.6～1.0时加入0.4mmiptg诱导酶的表达，诱导温度为23～26℃，诱导时间1～3h。

在本发明的一种实施方式中，所述应用的转化条件为：反应温度为30～60℃，转化时间为2～8h，转化转速为150～250rpm。

在本发明的一种实施方式中，所述应用的反应温度为35～45℃，转化时间为3～5h，转速为180～240rpm。

本发明提供了一种所述重组菌在食品、药品或保健品领域的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述应用为食品、药品或保健品领域制备磷脂酰丝氨酸制备中的应用。

本发明的有益效果：本发明得到了一系列对于催化大体积底物磷脂酰胆碱活性提高的磷脂酶d突变体，用于催化生产磷酯酰丝氨酸(ps)。本发明的突变体的kcat/km(1.25mm^-¹s^-1)显著增加，较野生型提高了58％，提高了单位催化剂的生产能力和反应效率，降低生产成本，并且反应条件温和、操作简便、收率高的优点，磷脂酰胆碱的转化率为50.8％，ps产量达到38.6g/l。此外，本发明后处理简单，原料利用度比较高，符合绿色化学的要求。应用本发明的方法可以大大降低成本，加快了酶转化法生产磷酯酰丝氨酸的工业化进程。

具体实施方式

基因来源：本专利所涉及到的生物酶pld基因来源于卡特拉链霉菌(streptomyceskatrae)cgmcc41914，该菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；pet28a(+)质粒购自novagen(madison,wi,u.s.a.)，限制性内切酶、t4dna连接酶、primerstar等购自takara(dalian,china)。pld突变体均为分子改造所得，其余反应物及试剂均为市场购买所得。

磷脂酶d比酶活测定方法：采用酶联比色法方法，以大豆卵磷脂为底物进行酶活测定，pld水解磷脂酰胆碱可产生胆碱，生成的胆碱经胆碱氧化酶催化可生成甜菜碱和h2o2，再利用trinder反应测定生成的h2o2，在过氧化物酶催化下，将4-氨基安替比林和苯酚氧化成粉红色的醌亚胺类物质，在500nm下测反应液的吸光度。以bradford法测定pld的蛋白质含量。

磷脂酶d比酶活定义为每毫克蛋白质所含的酶活力单位数(u/mg蛋白)。

磷脂酰丝氨酸含量的测定：反应产物采用高效液相色谱法测定。液相检测条件如下：色谱柱为diol(250mm×4mm，5μm)，流动相为正己烷(n-hexane)/异丙醇(iso-propanol)/1％冰醋酸＝8：8：1(v：v：v)，样品用0.22μm滤膜过滤，柱温为30℃，检测波长为210nm，进样量为20μl，流速为1ml/min。

配制ph7.4的结合液a：取1.19g磷酸二氢钠、1.41g磷酸氢二钠、29.22gnacl、1.36g咪唑、10ml甘油，用hcl调节ph值至7.4，用水稀释至1l。

配制ph7.4的洗脱液b：取0.595g磷酸二氢钠、0.705g磷酸氢二钠、14.61gnacl、17g咪唑，用hcl调节ph值至7.4，用水稀释至500ml。

配制0.1mm氯化钙：加0.11g无水氯化钙溶解于100ml去离子水中。

高效液相色谱法：参照gb_t21493-2008：大豆磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的测定。

配制lb培养基：在1l去离子水中加入10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、5gnacl，用1mol/lnaoh调节ph至7.4，121℃高压下蒸汽灭菌20min。

实施例1：单突突变体的构建和筛选

(1)化学合成核苷酸序列如seqidno.2所示的编码链霉菌磷脂酶d的基因，将编码链霉菌磷脂酶d的基因与pet-28a(+)载体酶切后(酶切位点：ecorι和hindш)连接，得到连接产物；将连接产物通过热激转化法转化至大肠杆菌e.coli.bl21(de3)。得到转化产物；将转化产物涂布在lb固体培养基(含有0.05mg/ml卡那霉素)上，于37℃恒温培养箱中倒置培养8～12h，得到转化子。

热激转化法：

(1)将10μl连接产物导入100μlbl21感受态细胞；

(2)冰浴15-30min；

(3)42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；

(4)加入800μl无抗性lb培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；

(5)5000rpm离心2min收菌；

(6)移去上清，剩余100-200μl吹吸混匀涂布至含0.05mg/ml卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右，得到单克隆菌落。

挑取单克隆菌落接种至含0.05mg/ml卡那霉素抗性lb液体培养基中，于37℃、120～180rpm的条件下摇瓶培养8～12h后提取质粒进行酶切验证以及测序验证，验证正确即获得重组全质粒pet-28a-pld。

设计不同突变位点的引物，以重组质粒pet-28a-pld为模板通过全质粒pcr进行突变体构建。

单突突变体构建：设计不同突变位点的引物如表1所示。

构建pcr反应体系(50μl)：primerstar0.5μl、每个突变位点的两条引物各1μl、二甲亚砜5μl、重组质粒pet-28a-pld4μl、用水补足至50μl。

pcr反应条件：①95℃5min；②95℃30s；③55℃30s；④72℃1min40s；⑤将②～④三个步骤循环34次；⑥72℃5min；⑦12℃保温。

消化体系(20μl)：dpni酶0.5μl、10×tbuffer2μl、pcr产物17.5μl

将上述反应体系在37℃孵育3h以消化质粒模板，消化结束后得到的消化产物通过热激将其转化到大肠杆菌bl21感受态细胞，将转化后的感受态细胞涂布于含0.05mg/ml卡那霉素的lb平板，37℃恒温培养12h，获得单菌落。

(2)单突突变体筛选：将培养皿上长出的单菌落挑至96孔板培养(含有0.05mg/ml卡那霉素，装液量为300μllb培养基)，37℃、转速为800rpm，震荡培养12h后按照装液量体积10％的接种量转接至含有450μl的新鲜培养基中。37℃震荡培养3h(细胞生长)后，此时od600为0.6-1.0，温度降低到25℃，加入0.4mmiptg进行诱导培养16h(蛋白表达)。

将诱导后的细胞经3700rpm、8min离心收集，在96深孔板的每个孔中加入300μl200mm的磷酸盐缓冲液(ph6.0)重悬细胞，吸取10μl细胞重悬液至装有300μl的40g/ll-天冬氨酸转化液的96深孔板中。40℃震荡4h后，将转化液经3700rpm、8min离心，吸取5μl上清液加入到装有13.5μl的10mmol/l的卵磷脂底物溶液和3.5μl的100mmol/lcacl2溶液的pcr反应管中，于50℃反应10min后再于100℃反应1min，反应结束后立即加入1u胆碱氧化酶、1u辣根过氧化物酶、70μl显色液(0.24mg/ml4-氨基安替比林、0.16mg/ml苯酚溶于100mmol/ltris-hcl)，于37℃下反应10min得到最终的反应液。

在500nm下检测反应液的吸光度，每个筛选位点的最高吸光值与wt的最高吸光值的比值>1.05时(为了防止引入测量误差)，并对筛选出的菌株进行测序，测序后得到表达突变体q357f和y405a的重组菌株。

表1突变位点

实施例2：双突突变体的制备

在突变体q357f的基础上，利用如seqidno.11和seqidno.12所示的引物，构建得到表达突变体q357f/y405a的重组菌，具体构建步骤参照实施例1。

实施例3：突变体酶的表达纯化方法

将实施例2和3制备得到的单突和双突重组菌接种至lb培养基，37℃培养至od600为0.6～1.0时加入0.4mmiptg诱导酶的表达，诱导温度为25℃，诱导时间12h，得到发酵液。发酵液于4℃、6000rpm离心10min，取菌体。加入10ml结合液a(20mm磷酸钠、0.5mmnacl、20mm咪唑、1％甘油，用hcl调ph至7.4)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间4s，共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10ml结合液a平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液(500mmol/lnacl，50mmpbs调节ph至6.0)ph值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液a冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液b(20mm磷酸钠、0.5mmnacl、500mm咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，并测定其酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白分别命名为q357f、y405a和q357f/y405a。

实施例4：亲本酶及突变体的动力学参数测定

为了对突变体进行评价，本发明测定了突变亲本wt及突变体q357f、y405a、q357f/y405a在37℃下的动力学参数。kcat/km通过在37℃条件下测定不同浓度的水解卵磷脂底物所产生醌亚胺类物质的初始利率计算，具体实施步骤参见文献c.fedeli,g.carrea,d.monti,ontheeffectsofsite-specificmutationsonactivityandexpressionofthestreptomycespmfphospholipased,j.mol.catal.benzym.41(2006)1–7。

动力学研究结果如表2所示，在37℃下，所有的突变体与wt相比，kcat/km值均提高，其中突变体q357f/y405a的kcat/km值提高58％，导致pld的催化效率变大。与之一致的是各突变体的比酶活与wt相比均得到提高，其中突变体q357f/y405a的比酶活提高25％。

表2pld亲本酶及其突变体的动力学参数

实施例5：突变体q357f转化制备磷酯酰丝氨酸(ps)

将实施例2和3制备得到的单突和双突重组菌株阳性转化子接种至lb培养基，37℃、200rpm培养至od600为0.6～1.0时加入0.4mmiptg诱导酶的表达，诱导温度为25℃，诱导12h，得到发酵液。发酵液于4℃、6000rpm离心10min，去上清收集得到湿菌体。

在10ml的摇瓶内制备4ml底物和磷脂酶d的反应体系，反应体系含有：终浓度为0.1mol/l大豆卵磷脂(将大豆卵磷脂粉末溶解于3ml环戊基甲醚)，终浓度为0.5mol/ll-丝氨酸(溶解于含有0.1mm氯化钙的1ml0.2m醋酸钠缓冲液，ph4.5)，催化剂为表达突变体q357f的重组菌，添加终浓度为30g/l的菌体细胞。将此10ml的摇瓶密闭放入恒温摇床内，200rpm/min、40℃培养4h后反应结束。

反应结束后，通过0.22μm的过滤器进行过滤，并用高效液相色谱法进行分析，突变体q357f的转化率为38.5％，ps产量达到29.3g/l。

实施例6：突变体y405a转化制备磷酯酰丝氨酸(ps)

湿菌体收集步骤参见实施例5。

在10ml的摇瓶内制备4ml底物和磷脂酶d的反应体系，反应体系含有：终浓度为0.1mol/l大豆卵磷脂(将大豆卵磷脂粉末溶解于3ml环戊基甲醚)，终浓度为0.5mol/ll-丝氨酸(溶解于含有0.1mm氯化钙的1ml0.2m醋酸钠缓冲液，ph4.5)，催化剂为表达突变体y405a的重组菌，添加终浓度为30g/l的菌体细胞。将此10ml的摇瓶密闭放入恒温摇床内，200rpm/min、40℃培养4h后反应结束。

反应结束后，通过0.22μm的过滤器进行过滤，并用高效液相色谱法进行分析，突变体y405a的转化率为47.2％，ps产量达到35.9g/l。

实施例7：突变体q357f/y405a转化制备磷酯酰丝氨酸(ps)

湿菌体收集步骤参见实施例5。

在10ml的摇瓶内制备4ml底物和磷脂酶d的反应体系，反应体系含有：终浓度为0.1mol/l大豆卵磷脂(将大豆卵磷脂粉末溶解于3ml环戊基甲醚)，终浓度为0.5mol/ll-丝氨酸(溶解于含有0.1mm氯化钙的1ml0.2m醋酸钠缓冲液，ph4.5)，催化剂为表达突变体q357f/y405a的重组菌，添加终浓度为30g/l的菌体细胞。将此10ml的摇瓶密闭放入恒温摇床内，200rpm/min、40℃培养4h后反应结束。

反应结束后，通过0.22μm的过滤器进行过滤，并用高效液相色谱法进行分析，突变体q357f/y405a的转化率为50.8％，ps产量达到38.6g/l。

对比例1

具体实施方式参见实施例5，区别在于，将其中的催化剂替换为表达亲本磷脂酶d的重组菌，测定亲本磷脂酶d的转化率为34.9％，ps产量为26.5g/l。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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