三七叶中具有抗光损伤活性的三萜皂苷类成分的制作方法

本发明属于天然药物领域，具体而言，涉及一类具有抗光损伤活性的三萜皂苷类成分。

背景技术：

随着生活水平的提高，人们户外运动、晒日光浴的机会也随之增多，导致有时候皮肤过度地暴露于紫外线。紫外线照射、特别是中波紫外线可引起皮肤的损伤，诱发皮肤出现红斑、水疱、炎症、色素沉着、光老化等一系列的反应，对人类健康构成潜在威胁。

为了防止皮肤光损伤，基本的防护是避免过度日晒，或者使用防晒霜等防护措施，但是取得的效果有限。近年来人们非常关注来源于植物的光损伤防护剂，并且发现它们能够预防及减少皮肤光损伤和皮肤癌的发生。常见的来源于植物的光损伤防护剂例如有茶多酚、维生素c、葡萄籽提取物、芦荟提取物、绞股蓝皂苷等。

三七panaxnotoginseng(burk.)f.h.chen为五加科人参属植物，又名田七、血参、田三七、滇三七、参三七，主产于云南文山州，在广西、广东等地亦有分布。作为传统常用名贵药材，三七不仅应用于治疗跌打损伤，民间也常用于预防血栓。

三七的入药部位主要是其根和根茎，然而经过几百年的栽培，三七对环境的适应能力逐渐下降，且连作障碍问题日益凸显，导致三七资源不足。

为了扩大三七的药用资源，有必要对三七的除了根和根茎之外的其它部位(例如，三七叶)的化学成分及药理活性进行研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于通过多种提取、分离手段，从三七叶中提取、分离并鉴定具有抗光损伤活性的化合物。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：利用多种提取、分离手段，包括溶剂提取法、大孔吸附树脂法、正反硅胶柱层析和制备hplc等方法，系统研究了三七叶的化学成分。

具体而言，本发明提供：

1.一种三七(panaxnotoginseng)叶提取物，其包含下述式1至式5所示的化合物中的至少一者。

2.一种药物组合物，包含治疗有效量的上述第1项所述的三七叶提取物、以及药学可接受的赋形剂。

3.一种化妆品组合物，包含上述第1项所述的三七叶提取物、以及至少一种生理学上可接受的赋形剂。

4.上述第1项所述的三七叶提取物的制备方法，包括依次进行下列步骤：

(i)将三七叶用体积浓度为50％～90％的醇溶液提取，提取液浓缩后得到粗提物；

(ii)将步骤(i)中所得到的粗提物混悬于水中，然后在大孔吸附树脂柱上依次用以下溶剂进行梯度洗脱：(a)水或者浓度低于40％的醇溶液、(b)40-75％醇溶液、(c)80-95％醇溶液；

(iii)将步骤(ii)中采用(c)80-95％醇溶液进行洗脱而得到的洗脱液浓缩并干燥，得到三七叶提取物。

5.根据上述第4项所述的三七叶提取物的制备方法，进一步包括：

(iv)采用正相柱色谱法和/或反相柱色谱法对上述步骤(iii)中得到的三七叶提取物进行分离，从而得到上述式1至式5所示的化合物中的至少一者。

6.上述第1项所述的三七叶提取物在制备用于预防或治疗光损伤的药物或化妆品中的用途。

发明的效果

本发明提供的三七叶提取物，特别是其中所包含的上述式1至式5所示的化合物(以下有时简称为“化合物1～5”)能够显著地增强hacat细胞活力，提示三七叶在抗光损伤方面具有极大的潜在利用价值，为临床上有效地预防和/或治疗皮肤光损伤提供新的应用和思路。

附图说明

图1中示出了各化合物1～5对hacat细胞的抗光损伤活性。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述并参照附图对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

本发明提供一种三七叶提取物的制备方法。关于本发明的制备方法，没有特别的限定，可以单独或组合地采用公知的方法。下面对本发明的三七叶提取物制备方法的一个优选实施方式进行描述。

本发明的三七叶提取物制备方法包括下列步骤：

(i)将三七叶用体积浓度为50％～90％的醇溶液提取，提取液浓缩后得到粗提物；

(ii)将步骤(i)中所得到的粗提物混悬于水中，然后在大孔吸附树脂柱上依次用以下溶剂进行梯度洗脱：(a)水或者浓度低于40％的醇溶液、(b)40-75％醇溶液、(c)80-95％醇溶液；

(iii)将步骤(ii)中采用(c)80-95％醇溶液进行洗脱而得到的洗脱液浓缩并干燥，得到三七叶提取物。

在步骤(i)中，将三七叶粉碎，然后用溶剂提取。作为提取用溶剂，可以列举水，甲醇、乙醇、乙二醇、丙醇、异丙醇、丙二醇、正丁醇、异丁醇、叔丁醇、丁二醇等c1-4醇，这些溶剂可以单独地或者组合使用。在这些溶剂中，优选使用甲醇或者乙醇，从容易获得的方面考虑，更优选使用乙醇。

在采用醇/水溶液作为提取溶剂的情况下，可以采用50-95％(v/v)的醇/水溶液，例如，50-95％(v/v)乙醇/水溶液或者甲醇/水溶液，优选为50-90％(v/v)乙醇/水。

提取时，提取用溶剂与三七叶的量的比例可以任意地调整。一般来说，提取用溶剂与三七叶的质量比在大约1:1至大约50:1的范围内，优选在大约5:1至大约20:1的范围内，更优选在大约5:1至大约10:1的范围内。

关于提取方式，可以采用本领域中常用的提取方法，例如，可以列举加热回流法、超声提取法、浸渍法、渗漉法、煎煮法等，但是并不限于这些方法。在这些提取方法中，从提取效率方面考虑，优选加热回流提取法。

提取时的温度通常为80℃至120℃，优选为90℃至100℃。

提取时间通常为至少15分钟，优选至少30分钟，从更有效地提取三萜类组分的方面考虑，提取时间优选为1至3小时。如果提取时间少于15分钟，则有效成分不能够充分地被提取出来；如果提取时间超过3小时，则由于加热时间过长可能会发生有效成分的分解等不利影响。

关于提取次数，只要能够尽可能地提取出三七叶中的活性成分，则没有特别的限制，可以采用相同或不同的提取用溶剂提取1次或重复提取多次，优选重复提取2次或3次。

在步骤(ii)中，将步骤(i)中所得到的粗提物在大孔吸附树脂柱上依次用以下溶剂进行梯度洗脱：(a)水或者浓度低于40％的醇溶液、(b)40-75％醇溶液、(c)80-95％醇溶液。

大孔吸附树脂的型号包括但是不限于x-5、ab-8、nk-2、nka-2、nk-9、d3520、d101、wld等，优选使用d101大孔吸附树脂。

作为洗脱时所使用的醇类，可以列举甲醇、乙醇、乙二醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇等c1-4醇，优选使用甲醇或乙醇，从易于获得以及毒性小的方面考虑，更优选使用乙醇。

在步骤(iii)中，将步骤(ii)中采用(c)80-95％醇溶液进行洗脱而得到的洗脱液浓缩并干燥，得到三七叶提取物。

对浓缩方法并无特别限定。优选的浓缩方法的例子包括：使用离心机分离的方法；在加热或减压条件下进行浓缩的方法；冷冻浓缩；反渗透膜过滤浓缩；管式膜蒸发浓缩等。优选使用这些方法中的两种或多种的组合。本发明中优选采用在加热并且减压的条件下进行浓缩的方法。

本发明的三七叶提取物的制备方法进一步包括：(iv)采用正相柱色谱法和/或反相柱色谱法对上述步骤(iii)中得到的三七叶提取物进行分离，从而得到上述化合物1～5中的至少一者。

正相色谱法是采用极性的固定相、以及非极性的流动相的分离方法，其是根据分子的极性大小将其分开的液相色谱技术。作为正相色谱填料(固定相)，例如可以使用硅胶、三氧化二铝等，但是不限于此。作为流动相，一般使用比固定相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂(例如正己烷)，或者其中加入一定量的极性溶剂(如氯仿、醇、乙腈等)，以调节流动相的洗脱强度。

反相色谱是指利用非极性的介质为固定相、极性溶剂为流动相，根据溶质极性(疏水性)的差别进行分离与纯化的色谱法。反相介质的种类繁多，其中以键合有c18、c8、c2的球形多孔填料最为常见，用途最广。另外，典型的流动相例如包括甲醇和乙腈，但是不限于此。

可以采用¹h-nmr、¹³c-nmr等一维核磁共振谱以及¹h¹hcosy、hsqc、hmbc、hsqc-tocsy、noesy等二维核磁共振谱等波谱技术和化学反应对上述所得到的化合物1～5的结构进行鉴定确证。

上述提取、分离、精制、以及结构鉴定过程中的具体操作对于本领域技术人员来说是公知的，可以参考相应的技术手册或教科书中记载的内容来进行。例如，参见吴继洲主编《天然药物化学》(高等教育出版社)、裴月湖主编《有机化合物波谱解析》(中国医药科技出版社)。本说明书中省略其详细的描述。

本发明还提供一种药物组合物，包含治疗有效量的上述三七叶提取物以及任选的药学可接受的赋形剂。

上述药学可接受的赋形剂可以是药物制剂领域中任何常规的赋形剂，特定赋形剂的选择将取决于用于治疗特定患者的给药方式或疾病类型和状态，用于特定给药模式的合适药物组合物的制备方法完全在药物领域技术人员的知识范围内。例如，可以作为药学可接受的赋形剂包括药学领域常规的稀释剂、载体、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂等。

上述药物组合物可以制成片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、注射乳剂、注射用无菌粉针等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明进一步提供一种化妆品组合物，包含上述三七叶提取物以及任选的至少一种生理学上可接受的赋形剂。术语“生理学上可接受的赋形剂”是指适合于局部或口服使用并且当与哺乳动物(特别是人类)的粘膜、指甲、头皮、头发、体毛和皮肤等接触时不存在任何毒性、不相容性等的风险的物质。根据本发明，生理学上可接受的赋形剂优选是美容上可接受的赋形剂。可适用的这些赋形剂是本领域技术人员熟知的，包括例如润肤剂、有机溶剂、螯合剂、渗透剂、增稠剂、填充剂、乳化剂或表面活性剂、防腐剂、着色剂、芳香剂、和其混合物。

上述化妆品组合物可以呈凝胶、乳液、微乳液、精华、油、面膜、药膏、软膏、化妆水、浓缩液、悬浮液、泡沫、固体棒或气溶胶的形式。

除了上述三七叶提取物以外，根据本发明的化妆品组合物还可以含有一种或多种第二活性剂，所述第二活性剂能够增强上述三七叶提取物的活性并且与其相容，即不易相互反应或者掩盖或限制其作用。特别地，第二活性剂可以例如选自保湿剂、湿润剂、抗氧化剂、皮肤保护剂、抗老化活性剂、防射线剂特别是防uv射线剂、及其混合物。

本发明还提供上述三七叶提取物在制备用于预防或治疗光损伤的药物或化妆品中的用途。

实施例

以下通过例子进一步解释或说明本发明的内容，但是这些例子不应被理解为对本发明保护范围的限制。

需要说明的是，以下实施例中所用的各种试剂、仪器、色谱柱等是本领域已知的，可通过商购得到。

实施例1

三七叶提取物的制备

干燥的三七叶8kg，剪碎，经10倍量50％乙醇溶液依次加热回流提取3次，时间为3小时、2小时、2小时，合并滤液，减压回收溶剂，得浸膏2.69kg。取浸膏2.08kg混悬于20l水中，经d101大孔吸附树脂色谱柱分离，洗脱溶剂为水→95％乙醇，得到水以及95％乙醇洗脱物，分别为760.0g和695.0g。其中，95％乙醇洗脱物作为富含三萜皂苷的三七叶提取物用于后续的实验。

实施例2

三萜皂苷化合物1～5的分离制备及结构鉴定

化合物1～5的分离是同时进行的，因而在一个实施例中进行描述。

1.[化合物1～5的分离制备]

取上述实施例1中所获得的95％乙醇洗脱物150.0g，经硅胶柱层析[ch2cl2→ch2cl2-meoh(100:3→100:7→10:1→8:1→3:1→2:1→1:1，v/v)→meoh]，得到12个组分(fr.1～fr.12)。

fr.7(30.0g)经mcigel柱层析[meoh-h2o(65％→70％→75％→80％→100％，v/v)]，得到12个组分(fr.7-1～fr.7-12)。fr.7-6(800.0mg)经phplc分离[meoh-1％hac(70:30，v/v)]和phplc分离纯化[ch3cn-1％hac(32:68，v/v)]，得到化合物2(62.1mg)。

fr.8(25.0g)经mcigel柱层析[meoh-h2o(40％→60％→70％→80％→100％，v/v)]，得到11个组分(fr.8-1～fr.8-11)。fr.8-6(1.6g)经phplc分离[meoh-1％hac(60:40，v/v)]，得到13个组分(fr.8-6-1～fr.8-6-13)。fr.8-6-8(244.2mg)经phplc分离纯化[ch3cn-1％hac(26:74，v/v)和meoh-1％hac(60:40，v/v)]，得到化合物3(21.8mg)。fr.8-6-9(223.8mg)经phplc分离[ch3cn-1％hac(27:73，v/v)]以及phplc分离纯化[meoh-1％hac(65:35，v/v)]，得到化合物4(32.2mg)。

fr.9(15.0g)经mci柱层析[meoh-h2o(60％→70％→80％→100％，v/v)]以及phplc分离纯化[ch3cn-1％hac(33:67，v/v)]，得到化合物1(133.8mg)。

fr.10(7.0g)经mcigel柱层析[meoh-h2o(60％→70％→80％→100％，v/v)]以及phplc连续分离[ch3cn-1％hac(24:76，v/v)和meoh-1％hac(60:40，v/v]，得到化合物5(11.2mg)。

2.[结构鉴定]

主要利用光谱技术，包括质谱、核磁共振谱(¹h-nmr、¹³c-nmr)，鉴定上述所得到的化合物1～5的结构。

化合物1：三七皂苷fa(notoginsenosidefa)

白色粉末。高分辨esi-q-orbitrapms给出其准分子离子峰m/z1239.63684[m-h]^-(calcdforc59h99o27，1239.63682)，确定其分子式为c59h100o27。

¹hnmr(c5d5n，500mhz)δ：0.81、0.96、0.97、1.11、1.27、1.61(each3h，alls，h3-19，18，30，29，28，26)，1.66(6h，s，h3-21，27)，3.29(1h，dd，j＝4.0，11.5hz，h-3)，4.20(1h，m，h-12)，5.31(1h，t，j＝7.0hz，h-24)，4.93(1h，d，j＝7.5hz，h-1')，5.52(1h，d，j＝8.0hz，h-1”)，5.43(1h，d，j＝6.5hz，h-1”')，5.14(1h，d，j＝8.0hz，h-1””)，5.11(1h，d，j＝7.5hz，h-1””')。

¹³cnmr(c5d5n，125mhz)δ：见表1。

化合物2：西洋参皂甙l3(quinquenosidel3)

白色粉末。高分辨esi-q-orbitrapms给出其准分子离子峰m/z931.52753[m-h]^-(calcdforc47h79o18，931.52609)，确定其分子式为c47h80o18。

¹hnmr(c5d5n，500mhz)δ：0.84、0.92(each3h，alls，h3-19，30)，1.01(6h，s，h3-18，29)，1.33、1.56、1.57、1.61(each3h，alls，h3-28，27，26，21)，3.37(1h，dd，j＝4.0，11.5hz，h-3)，4.06(1h，m，h-12)，6.08(1h，d，j＝15.5hz，h-24)，6.24(1h，m，h-23)，4.96(1h，d，j＝6.0hz，h-1')，5.18(1h，d，j＝8.0hz，h-1”)，4.97(1h，d，j＝7.5hz，h-1”')。

¹³cnmr(c5d5n，125mhz)δ：见表1。

化合物3：floranotoginsenosidea

白色粉末。高分辨esi-q-orbitrapms给出其准分子离子峰m/z1093.57947[m-h]^-(calcdforc53h89o23，1093.57892)，确定其分子式为c53h90o23。

¹hnmr(c5d5n，600mhz)δ：0.82、0.89、1.01、1.10、1.27(each3h，alls，h3-19，30，18，29，28)，1.58(6h，s，h3-26，27)，1.61(3h，s，h3-21)，3.27(1h，dd，j＝4.2，10.8hz，h-3)，4.01(1h，m，h-12)，6.10(1h，d，j＝15.0hz，h-24)，6.21(1h，m，h-23)，4.92(1h，d，j＝7.8hz，h-1')，5.39(1h，d，j＝7.8hz，h-1”)，5.16(1h，d，j＝7.8hz，h-1”')，5.68(1h，br.s，h-1””)。

¹³cnmr(c5d5n，125mhz)δ：见表1。

化合物4：七叶胆皂苷lxix(gypenosidelxix)

白色粉末。高分辨esi-q-orbitrapms给出其准分子离子峰m/z1093.57910[m-h]^-(calcdforc53h89o23，1093.57892)，确定其分子式为c53h90o23。

¹hnmr(c5d5n，500mhz)δ：0.83、0.90、1.01、1.11、1.29、1.55、1.56、1.61(each3h，alls，h3-19，30，18，29，28，27，26，21)，3.27(1h，dd，j＝4.0，12.0hz，h-3)，4.04(1h，m，h-12)，6.08(1h，d，j＝16.5hz，h-24)，6.23(1h，m，h-23)，4.92(1h，d，j＝7.5hz，h-1')，5.37(1h，d，j＝7.5hz，h-1”)，5.17(1h，d，j＝7.5hz，h-1”')，4.96(1h，d，j＝7.5hz，h-1””)。

¹³cnmr(c5d5n，125mhz)δ：见表1。

化合物5：三七皂苷fh5(notoginsenosidefh5)

白色粉末。高分辨esi-q-orbitrapms给出其准分子离子峰m/z1255.63110[m-h]^-(calcdforc59h99o28，1255.63174)，确定其分子式为c59h100o28。

¹hnmr(c5d5n，500mhz)δ：0.84、0.89、1.02、1.12、1.29、1.55、1.56、1.66(each3h，alls，h3-19，30，18，29，28，27，26，21)，3.29(1h，dd，j＝4.0，11.5hz，h-3)，4.04(1h，m，h-12)，6.08(1h，d，j＝15.5hz，h-24)，6.25(1h，m，h-23)，4.95(1h，d，j＝7.5hz，h-1')，5.53(1h，d，j＝7.5hz，h-1”)，5.43(1h，d，j＝7.0hz，h-1”')，5.19(1h，d，j＝8.0hz，h-1””)，5.13(1h，d，j＝8.0hz，h-1””')。

¹³cnmr(c5d5n，125mhz)δ：见表1。

表1化合物1～5的¹³cnmr数据

实施例3

化合物1～5的生物活性测定

hacat细胞，即永生化角质形成细胞，广泛应用于各种皮肤学研究。皮肤光损伤过程主要与氧化应激、dna的突变、炎症反应、细胞周期和凋亡、基质金属蛋白酶、免疫抑制、胶原蛋白降解以及晚期糖基化终末产物等生物学进程有关。

本发明以uvb辐照的hacat细胞作为体外抗光损伤模型，对分离得到的化合物1～5进行活性研究。

i.化合物1～5对hacat细胞毒性研究

取对数生长期的hacat细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10⁵个/ml，接种于96孔板，每孔100μl。培养24小时后所有细胞更换新的培养基，并给药。分为给药组(50μm单体化合物+培养基+细胞)、正常组(培养基+细胞)、以及空白组(培养基)。37℃、5％co2孵育24小时后，弃去培养基，每孔加mtt(5mg/ml)试剂100μl，再次孵育4小时后，取出，弃去废液，每孔加入二甲基亚砜(dmso)100μl，于490nm下检测吸光度值。

细胞存活率＝[(给药组od值-空白组od值)/(正常组od值-空白组od值)]×100％

ii.化合物1～5对hacat细胞的抗光损伤活性研究

取对数生长期的hacat细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，调整细胞浓度为1.0×10⁵个/ml，接种于96孔板，每孔100μl。培养24小时后弃去培养基，每孔加入100μlpbs进行辐照剂量为100mj/cm²的uvb处理。分为阳性对照组(uvb辐照+50μmvc+培养基+细胞)、给药组(uvb辐照+50μm单体化合物+培养基+细胞)、模型组(uvb辐照+培养基+细胞)以及空白对照组(培养基+细胞)。37℃、5％co2孵育24小时后，弃去培养基，加mtt试剂，测定每组的细胞活力。

iii.实验结果

给药组与空白对照组之间以及给药组与模型组之间通过spss14.0软件进行差异性检验，当p<0.05时，认为组间具有显著性差异。

mtt细胞毒性实验结果显示，化合物1～5均未显示出细胞毒性。

另外，如图1所示，在各化合物1～5的浓度为50μm时，能够显著增强hacat细胞活力，甚至强于阳性对照药vc。需要说明的是，图1中，**表示p<0.01，***表示p<0.001；n＝6。

工业实用性

本发明利用多种分离手段，包括正反相硅胶柱层析、大孔吸附树脂柱层析和制备高效液相色谱法等，从三七叶中分离得到了包括化合物1～5的三萜皂苷。这些化合物表现出显著增强hacat细胞活力的作用，为今后开发出疗效确切、毒副作用小的抗光损伤药物奠定了物质基础。