一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法与应用与流程

本发明涉及有机小分子胺类化合物标记技术领域，特别涉及一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法与应用。

背景技术：

氨基酸是生命有机体的重要组成部分。快速准确地测定氨基酸对生物学、食品学和临床医学都具有重要意义。众所周知，大多数氨基酸既不表现出紫外吸收也不表现出荧光，因此在痕量水平上检测它们是相当困难的。目前借助自动分析仪及新型荧光试剂进行柱前或柱后的衍生化以寻求高灵敏的测定方法仍是一个活泼的研究领域。几种光度法测定氨基酸的衍生化试剂不仅灵敏度低，且衍生时间长，限制了应用。因此开发一种新型的荧光标记试剂用于氨基酸的荧光检测具有重要的意义。理想的衍生化试剂必须具备以下条件：试剂本身必须稳定，且在较大温度范围内能够迅速的衍生化；过量试剂或副产物不影响分离；试剂具有强的紫外吸收或在紫外下发射强的荧光；试剂易合成，衍生物在流动相体系下具有较好的溶解度。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明所要解决的技术问题是，提供一种标记反应速率快、标记产物信号高、荧光检测胺类化合物准确性和灵敏度高的吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法与应用。

本发明为实现上述目的采用的技术方案是：一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂，以吖啶酮为荧光母体环，氯甲酸酯为反应活性基团，其化学名称为：2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯，其化学结构式为：

本发明还包括一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂的合成方法，

(1)将吖啶酮与碳酸乙烯酯进行取代反应，得到中间体2-(9-吖啶酮)乙醇；

(2)将中间体2-(9-吖啶酮)乙醇与固体光气反应，得到目标产物2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯。

进一步的，所述合成方法具体包括以下步骤：

(1)取代反应：将吖啶酮、碳酸乙烯酯溶解到二甲基亚砜中，加入痕量氢氧化钾，油浴150℃反应6h，反应结束，待反应液冷却后，倒入400ml的食盐水溶液中，并不断搅拌，析出淡黄色固体，抽滤，并水洗两次，粗产物晾干后，用乙腈重结晶得淡黄色晶体为中间体2-(9-吖啶酮)乙醇；

(2)氯甲酰化反应：将固体光气溶解于二氯甲烷中，冰浴冷却搅拌条件下，滴加少量三乙胺，逐滴滴加溶有中间体2-(9-吖啶酮)乙醇的二氯甲烷溶液，冰浴下反应4小时，缓慢升到室温反应5小时，反应结束后，抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压蒸干，并用乙腈重结晶，得到目标产物2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯。

进一步的，所述步骤(1)中，

中间体2-(9-吖啶酮)乙醇用乙腈重结晶2次，得到黄色针状结晶产物；

吖啶酮与碳酸乙烯酯摩尔比优选为1:1.5，反应温度优选为150℃，反应时间优选为6h。

进一步的，所述步骤(2)中，

目标产物2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯重结晶3次，得到黄色针状结晶产物；

2-(9-吖啶酮)乙醇与固体光气的摩尔比优选为1:2，三乙胺的加入量为固体光气质量的3％。

本发明还包括一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂的应用，标记试剂具有上述的结构，或通过上述的合成方法合成，应用于检测样品中氨基酸含量。

进一步的，检测样品中氨基酸含量的具体步骤如下：

(1)配制ph＝9.0的硼砂-硼酸缓冲溶液；配制5份混合氨基酸混合标准品溶液，浓度分别为10nm、100nm、1μm、10μm和100μm；配制浓度为10mm的2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的乙腈溶液；

(2)依次将400μl硼砂-硼酸缓冲溶液、20μl氨基酸混合标准溶液和100μl2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的乙腈溶液加到2ml的安焙瓶中，室温下反应5min后，将衍生化溶液做如下处理：

(a)加入50μl淬灭剂醋酸停止反应，放置5-10分钟进样分析；

(b)在安焙瓶内加0.5ml的乙醚溶剂，摇动萃取多余的衍生化试剂，取10μl进行高效液相色谱-荧光分析，得到氨基酸混合标准品色谱分离图，将五份氨基酸混合标准品依次衍生、高效液相色谱-荧光分析后，以氨基酸浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制氨基酸浓度工作曲线；

(3)将样品用2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯衍生标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入氨基酸浓度工作曲线中，即可得到样品中氨基酸的浓度。

进一步的，检测牛血清白蛋白中氨基酸含量的步骤如下：

称取牛血清白蛋白4mg于2ml安焙瓶中，加入1ml，6mol/l的hcl，恒温110℃水解24h，氮气吹干后用1ml，ph＝9.0的na2b4o7缓冲溶液溶解，得到牛血清白蛋白的浓度为4g/l。按所述步骤(2)方法标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入工作曲线中，即可求得牛血清白蛋白中各氨基酸的浓度，进而得出牛血清白蛋白中各氨基酸的含量。

本发明吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法与应用的有益效果是：

本发明试剂荧光最大激发波长与发射波长分别在265nm与430nm，可以实现对氨基酸的荧光标记与检测。该试剂以吖啶酮环为荧光母体环，氯甲酸酯为反应活性基团，其合成步骤简单方便，易于实现，两步反应即可完成：(1)将吖啶酮与碳酸乙烯酯进行反应，得到中间体2-(9-吖啶酮)乙醇；(2)将中间体2-(9-吖啶酮)乙醇与固体光气反应，得到目标产物2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯，经乙腈重结晶3次，得到黄色针状结晶产品。

本发明荧光标记试剂化学性质稳定，化学纯度达99.6％。本发明的一种稳定吖啶酮类荧光标记试剂可以快速、准确、灵敏地标记氨基酸，从而实现复杂体系中微量、痕量氨基酸的分离与检测，可用于生命分析、食品分析等研究领域中多种氨基酸的荧光标记与分析，具有广阔的应用前景。

本发明吖啶酮类荧光标记试剂是以吖啶酮为母体环，以氯甲酸酯为活性基团。氯甲酸酯基团在标记胺类化合物(如氨基酸，脂肪胺)时，对胺类化合物选择性专一，而且标记时间短、标记产率高。在衍生条件上，吖啶酮荧光标记试剂只需在室温条件下反应2-5分钟即可衍生完全，且不需要复杂的萃取条件，在检测方法上，采用高效液相色谱即可进行荧光检测。因此，本发明所述的氯甲酸酯标记试剂可以快速、准确、灵敏地标记检测胺类化合物，尤其适用于复杂体系中微量、痕量小分子胺类化合物的分离检测，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是实施例1制备2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯合成路线图；

图2是实施例12-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的核磁¹hnmr图；

图3是实施例2标记试剂与谷氨酸标记产物的荧光激发光谱图；

图4是实施例2标记试剂与谷氨酸标记产物的荧光发射光谱图；

图5是实施例3标记试剂与氨基酸的反应路线图；

图6是实施例3标记试剂衍生22种氨基酸混合标准品的色谱分离图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步详细说明；

实施例1：

一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂及其合成方法与应用，以吖啶酮为荧光母体环，氯甲酸酯为反应活性基团，其化学名称为：2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯，其化学结构式为：

本发明还包括一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂的合成方法，合成方法具体包括以下步骤：

(1)取代反应：向500ml三口烧瓶中分别加入10g吖啶酮、7g碳酸乙烯酯和痕量的氢氧化钾，溶解在200ml的二甲基亚砜中，150℃搅拌，反应6小时。反应结束待反应液冷却后，将其倒入400ml的食盐水溶液中，并不断搅拌，可见淡黄色固体析出，抽滤，并水洗两次。粗产物晾干后，用乙腈重结晶2次，得淡黄色晶体，产率为74％；

(2)氯甲酰化反应：向500ml的单口圆底烧瓶中加入10g固体光气，200ml二氯甲烷，冰浴冷却搅拌条件下，加少量三乙胺，将溶有2-(9-吖啶酮)乙醇的二氯甲烷溶液缓慢滴加到上述冷却溶液中，反应4h，缓慢升到室温反应5小时。反应结束后，抽滤，滤液用旋转蒸发仪减压蒸干，并用乙腈重结晶3次，得到目标产物2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯，产率为70％。

图1是2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯合成路线图，图2是2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的核磁¹hnmr图,其表征数据如下：

¹hnmr(500mhz,dmso)δ8.36(dd,j＝8.0,1.5hz,2h),7.92(d,j＝8.8hz,2h),7.82(ddd,j＝8.7,7.0,1.6hz,2h),7.33(t,j＝7.4hz,2h),4.61(t,j＝6.3hz,2h),3.90(t,j＝6.3hz,2h).

¹³cnmr(126mhz,dmso)δ176.96,142.44,142.32,134.39,126.99,122.02,121.65,116.88,58.59,48.03.

found:c63.78,h3.99,n4.65,o15.95,cl11.79；calculated:c63.69,h4.01,n4.64,o15.91,cl11.75.

本发明还包括一种吖啶酮类荧光胺类化合物标记试剂的应用，标记试剂具有上述的结构，或通过上述的合成方法合成，应用于检测样品中氨基酸含量。

实施例2：

为提高荧光标记氨基酸的检测灵敏度，准确的获得荧光标记试剂的最大激发波长与最大发射波长是提高检测灵敏度的关键。为获得标记试剂或者标记产物的最大激发波长与最大发射波长，用浓度1μm的2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯溶液对谷氨酸标准品溶液进行标记，然后进行荧光分析，获得标记产物的最大激发波长与最大发射波长分别为265nm与430nm。图3是标记试剂与谷氨酸标记产物的荧光激发光谱图；图4是标记试剂与谷氨酸标记产物的荧光发射光谱图。

实施例3：

检测牛血清白蛋白中氨基酸含量的步骤如下：

(1)利用2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯荧光标记试剂检测牛血清白蛋白中氨基酸的含量，配制ph＝9.0的硼砂-硼酸缓冲溶液；配制5份混合氨基酸混合标准品溶液，浓度分别为10nm、100nm、1μm、10μm和100μm；配制浓度为10mm的2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的乙腈溶液；

(2)依次将400μl硼砂-硼酸缓冲溶液、20μl氨基酸混合标准品溶液和100μl2-(9-吖啶酮)乙基氯甲酸酯的乙腈溶液加到2ml的安焙瓶中，于室温下反应5min，衍生化溶液作如下处理：(a)加入50μl淬灭剂醋酸停止反应(此时衍生化溶液的ph值在6.0-7.5之间)，放置5-10分钟进样分析，如此处理的衍生化溶液在4℃的冰箱储存下，24小时稳定，足以在hplc条件下24小时对衍生物进行定量分析；(b)在安焙瓶内加0.5ml的乙醚溶液，摇动萃取多余的衍生化试剂(色谱分离取下层水溶液进行)。取10μl进行高效液相色谱-荧光分析，得到氨基酸混合标准品色谱分离图，将五份氨基酸标品依次衍生、高效液相色谱-荧光分析后，以氨基酸浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制氨基酸浓度工作曲线；

(3)称取牛血清白蛋白4mg于2ml安焙瓶中，加入1ml，6mol/l的hcl，恒温110℃水解24h，氮气吹干后用1ml，ph＝9.0的na2b4o7缓冲溶液溶解，相应浓度4g/l，低浓度的水解溶液(0.01g/l)用ph＝9.0的na2b4o7缓冲溶液稀释而成。按上述方法标记后，进行高效液相色谱-荧光分析，将所得到的峰面积代入工作曲线中，即可求得牛血清白蛋白中各氨基酸的浓度，进而得出牛血清白蛋白中各氨基酸的含量。

图5是标记试剂与氨基酸的反应路线图；图6是标记试剂衍生22种氨基酸混合标准品的色谱分离图。

上述实施例只是为了说明本发明的技术构思及特点，其目的是在于让本领域内的普通技术人员能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡是根据本发明内容的实质所做出的等效的变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。