一种诊断肺腺癌的甲基化分子标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医学检测
技术领域：
，涉及甲基化eid3作为诊断肺腺癌的分子标志物及制备诊断肺腺癌试剂或试剂盒中的应用。
背景技术：
：最新的临床数据显示，肺癌是全球发病率以及致死率最高的恶性肿瘤之一。而肺腺癌是其最常见的病理类型。一项针对我国不吸烟肺腺癌的研究相表明，相对于其他病理类型的肺癌，肺腺癌具有更多的基因变异。此外，肺腺癌病理亚类表现为多样化，这些都给肺腺癌的诊断带来了挑战。低剂量肺ct是目前筛查肺癌的主要手段，使得大量肺腺癌患者在肿瘤发生早期被发现，并且随着手术技术的革新、靶向治疗的进展以及免疫治疗的开展等，肺腺癌患者的预后有了一定的提升，但是肺腺癌患者的总体生存期仍不理想，5年生存率不足20％。寻找新的肺腺癌诊断靶点迫在眉睫。在众多的基因修饰方式中，最常见的为基因的甲基化修饰，而以往基因组学的研究着重于基因序列的改变，随着表观遗传学的发展，研究者们发现，不仅仅是基因的序列，其修饰也可从亲代遗传到下一代。tcga数据库作为目前容量最大的公用数据库之一，为我们提供了一个筛选新型靶点的好方法。本发明人利用tcga中肺腺癌基因表达及基因甲基化数据库，评估了肺腺癌中肿瘤及癌旁组织存在差异甲基化的基因，将其基因表达与甲基化水平相联系，并且从中选择差异显著的基因－eid3做进一步研究。eid家族共有3个成员：eid1、eid2以及eid3。其中，eid3可直接影响甲基转移酶家族成员dnmt3a，该酶具有双甲基化和去甲基化能力。从而我们认为eid3基因的甲基化可能对肺腺癌的发生发展产生一定的影响。研究表明，在乳腺癌细胞中eid3表达的上调可诱导细胞衰老，并增加乳腺癌细胞对放化疗的敏感性。血清中的eid3抗体可作为预测胰腺神经内分泌肿瘤复发的生物学标志物。目前，肺腺癌中eid3基因及其甲基化的影响尚未有报道。并且尚未有用于检测eid3基因表达及甲基化在组织中表达情况的完整试剂盒。技术实现要素：为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于从tcga数据库中进行筛选并使用本单位样本进行验证，提供一种诊断肺腺癌的甲基化基因标志物，本发明的另一目的在于提供检测eid3基因表达及甲基化诊断试剂盒中的应用。本发明分析了tcga数据库以及来自复旦大学附属华东医院的肺腺癌队列。本发明在tcga甲基化数据库基础上，揭示了肺腺癌组织及癌旁正常肺组织具有显著甲基化差异的基因(图1)。本发明在华东医院验证样本中，设计了eid3基因甲基化测序特异性引物(图2)，测序结果表明eid3在肺腺癌组织相对癌旁正常肺组织显著高甲基化(图3)，在所检测的甲基化位点中，除194、204、208位点以外，其他位点甲基化水平相对较低。所有位点在t组中甲基化均显著高于n组(图4)。本发明的主要技术方案如下：一种甲基化分子标志物在制备肺腺癌诊断产品中的应用，所述的甲基化分子标志物为甲基化eid3基因。进一步的，所述诊断产品通过测定样本中eid3基因表达及甲基化水平来诊断肺腺癌。进一步的，所述的样本为肺腺癌组织。一种用于诊断肺腺癌的检测试剂盒，所述试剂盒用于检测甲基化eid3基因。进一步的，所述的试剂盒中包含检测甲基化eid3基因的引物对，所述引物对的序列如seqidno.1和seqidno.2所示。leftprimer(seqidno.1)：gaggygttygtttatagatt；rightprimer(seqidno.2)：tacaatccaaccaaatttaattcac。所述试剂盒中除特异性引物外，还包括，pcr反应液由sybrgreen染料、dntp、mg2+、dtt、反转录酶和buffer等组成。pcr反应液中各组分和用量对所属领域技术人员而言是公知常识。体外检测肺腺癌组织中eid3的甲基化差异，首先是检测待测组织及癌旁肺组织中eid3的甲基化水平，其次对两组样本中eid3甲基化水平进行比较，最后判断这种核酸分子标志物在待测肺腺癌组织中是否均存在高甲基化修饰。有益效果：本发明提供了一种诊断肺腺癌的甲基化分子标志物及其应用，其有益效果主要体现在以下几个方面：1、本申请首次证实了甲基化eid3基因可作为肺腺癌的诊断标志物，eid3在肺腺癌组织相对癌旁正常肺组织显著高甲基化，表明甲基化eid3基因可以作为肺腺癌的诊断标志物；2、甲基化eid3基因在肺腺癌组织中的特异性高表达，为肺腺癌的诊断提供了一种新途径；3、本申请提供了用于检测甲基化eid3基因的试剂盒，检测准确率高，为肺腺癌的诊断提供了一种更加快速、准确的检测方法。附图说明图1为tcga数据库中肺腺癌及癌旁肺组织中甲基化差异最大的前100个基因热图。图2为eid3甲基化引物设计区域图。图3为华东医院肺腺癌及癌旁肺组织eid3基因甲基化检测结果图，t代表肺腺癌组织，n代表癌旁肺组织。图4为华东医院肺腺癌及癌旁肺组织eid3基因各个甲基化位点甲基化水平检测结果图，t代表肺腺癌组织，n代表癌旁肺组织；*代表p值＜0.05。图5为eid3基因位点树状聚类图；每个样本为一行；位点甲基化水平用不同颜色方块代表。具体实施方式现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径得到。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规实验方法。实施例1tcga甲基化数据库研究1.数据下载：tcga肺腺癌甲基化数据库下载于tcga数据库官网，网址为https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/，搜索关键词为lungadenocarcinoma以及dnamethylation。数据下载日期为2019-03-27。所有数据均经过标准化处理，dna甲基化队列的总样本量为616(53个正常，563个肺腺癌)。2.数据处理：(1)所有数据在进行进一步分析之前均经过标准化处理。(2)卡方检验用于分析基因甲基化在肺腺癌及癌旁肺组织中的差异。(3)差异甲基化基因使用p＝0.05以及|logfc|＝0.5为标准筛选。(4)tcga数据下载软件为perl，数据处理及分析所使用软件为r，版本号为3.3.1。3.数据分析结果：在本发明中，tcga组基因甲基化队列共纳入616例样本信息，其中肺腺癌563例，对照53例。我们使用p值<0.05以及|logfc|>0.5进行筛选，发现在已有甲基化数据的20204个基因中，共2084个基因在肺腺癌组织与癌旁组织中存在差异甲基化，其中肿瘤组织相对癌旁组织高甲基化的有369个，相对低甲基化的有1715个。我们展示了差异甲基化倍数前100的基因所构成的热图(图1)。实施例2组织eid3甲基化水平定量研究1.研究对象：我们所使用的30例肺腺癌及癌旁正常肺组织组织样本来自华东医院胸外科诊断为肺腺癌，并且进行手术切除的患者。所取用组织块在切除后立即置于组织冻存管内，并置于液氮中保存。病理学诊断以华东医院病理科石蜡切片诊断为准。2.组织dna提取：首先我们选取适量的组织进行dna提取，所使用的试剂盒为e.z.n.a.tmtissuednakit(omegabio-tek)。(1)预冷组织研磨仪至4℃。选取适量的组织，加入200μl缓冲液，研磨至组织破碎。(2)加入25μlob蛋白酶并涡旋混合均匀。在摇动的水浴中于55℃孵育，以实现完全裂解。(3)加入5μlrnasea(25mg/ml)并在室温下孵育2-5分钟。(4)以10,000xg离心5分钟以沉淀不溶的组织碎片。小心吸出上清液，然后转移到无菌微量离心管中，留下任何不溶的沉淀物。(5)加入220μlbufferbl并涡旋混合。在70℃下孵育10分钟。(6)加入220μl的无水乙醇(室温)，并通过以最大速度涡旋15秒彻底混合。上下吹打混合。(7)在2ml收集管中组装一个dna吸附柱。将步骤6中的所有裂解物转移到包括可能形成的任何沉淀物的色谱柱中。以8,000xg离心1分钟以结合dna。丢弃流通液体。(8)将色谱柱放入第二个2ml收集管中，并通过移液500μlhb进行清洗。8,000xg离心1分钟。丢弃流通液和2ml收集管。(9)将色谱柱放入第二个2ml收集管中，用移液器吸取700μl用乙醇稀释的dnawashbuffer进行洗涤。8,000xg离心1分钟。丢弃流通液，并在下一步骤中重新使用2ml收集管。(10)将柱子放回步骤10的2ml收集管中，用第二个700μl用乙醇稀释的dnawashbuffer洗涤柱子，并如上所述离心。丢弃流通。(11)将色谱柱放回相同的2ml收集管中，以最大速度(>12,000xg)离心空色谱柱2分钟以干燥色谱柱。该步骤对于确保后续步骤中的最佳洗脱至关重要。(12)将色谱柱放入无菌的1.5ml微量离心管中，加入50-200μl预热(70℃)洗脱缓冲液。让试管在室温下静置3分钟。(13)要从色谱柱上洗脱dna，以10,000xg离心1分钟。用第二个100-200μl的洗脱缓冲液重复洗脱。(14)取2μl用nanodrop2000检测dna的浓度及纯度。3.取500ng基因组dna，通过ezdnamethylation-goldkittm(zymoresearch，ca，usa)进行亚硫酸氢盐转化。(1)20μldna样品加入pcr管中，再加入130μlctconversionreagent。(2)样品管置于热扩增仪中并进行下一步骤：①.98℃反应10min②.64℃反应2.5h③.4℃冷去后进行后续反应。(3)在纯化柱中加600μlm-bindingbuffer并将柱子放于所提供的collectiontube中。(4)将样品(来自2)加入到含有m-bindingbuffer的纯化柱中。盖上盖子，上下颠倒数次柱子使样品混匀。(5)全速离心(11,000xg)30s。弃清液。柱中加入100μlm-washbuffer，全速离心30s。(6)柱中加入200μlm-desμlphonationbuffer，室温(20～30℃)放置15～20min。之后全速离心30s。(7)向柱中加入200μlm-washbuffer，全速离心30s。另加200μlm-washbuffer，全速离心30s。(8)柱子放入1.5ml离心管中。直接向柱子中加入10μlm-elutionbuffer。全速离心30s洗脱dna；得到的dna进行后续反应。4.pcr反应：①引物设计：startsizetmgc％'c'ssequenceleftprimer2812053.840.05gaggygttygtttatagattrightprimer5592558.428.04tacaatccaaccaaatttaattcacproductsize:279,tm:73.8,cpgsinproduct:16②pcr反应体系的配制：③pcr循环条件：5.pcr产物电泳检测，筛选合格的pcr产物进行纯化。6.采用vahtsturbodnalibraryprepkitfor(nd102-0102))进行建库。(1)末端修复，磷酸化并加da尾(2)接头连接①将下列组分直接添加至65μl末端修复产物中：成分体积(μl)vahtsturbot4dnaligase2.0μlvahtsturboligationenhancer30.5μlvahtsadapterforillumina*2.5μlintotal100.0μl②吹打混匀，离心后将反应液收集至管底。③将反应管置于pcr仪中，进行下列反应：热盖on,105℃，20℃,15min，holdat4℃。(3)将连接产物进行纯化：(4)pcr扩增:①在灭菌pcr管中配制如下反应：②使用移液器轻轻吹打混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。③将反应管置于pcr仪中，进行下述反应：步骤温度时间循环数预变性98℃30sec1变性98℃10sec退火65℃30sec8延伸72℃30sec完全延伸72℃5min1hold4℃(5)使用dnabeads纯化样品①将dnabeads置于室温下至少30min。②向1.5-mllobindtube中加入2.0倍的均匀的magicpuresizeselectiondnabeads，并加入文库。在漩涡混匀器上混匀并室温放置5min.③将tube放在磁力架上直至溶液澄清(大约3到5min)。弃上清④向每个tube中加入250μl的70％乙醇。放置1min，使所有beads沉淀，弃掉乙醇。⑤重复④。⑥在37℃加热模块中干燥样品5min或直到残余的乙醇完全消失。⑦加入15μlnuclease-freewater，在漩涡混匀器上混匀，室温温育2min。静置2到3min，直到溶液澄清。⑧将15μl左右的上清液转移至一个新的1.5-mllobindtube中。弃掉beads。7.样本进行二代测序。实施例3：临床验证根据以上方法，我们检测了华东医院30例样本(包括肺腺癌组织及癌旁正常组织)中eid3基因甲基化水平，并且进一步分析了所包含的各个甲基化位点在肿瘤及癌旁的甲基化差异。本发明人发现，在华东医院样本中，eid3在肺腺癌组相对癌旁组织呈现出明显的高甲基化(图3)。并且在所检测的甲基化位点中，除194、204、208位点以外，其他位点甲基化水平相对较低。所有位点在t组中甲基化均显著高于n组(图4)。本发明人通过聚类分析，可见在肺腺癌及癌旁组织中，rhoh甲基化水平存在显著差异，并且在各个甲基化位点均可体现(图5)。本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表<110>华东医院<120>一种诊断肺腺癌的甲基化分子标志物及其应用<160>2<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列(化学合成)<400>1gaggygttygtttatagatt20<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列(化学合成)<400>2tacaatccaaccaaatttaattcac25当前第1页12