一种基因抑制剂在制备抗胃癌转移制剂中的用途的制作方法

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种基因抑制剂及其应用。

背景技术：

胃癌是消化系统常见的一种恶性肿瘤，由于胃癌的发病机制十分复杂，且患者的早期症状不明显，导致胃癌患者的早期诊断率较低。胃癌是全球第四大恶性肿瘤，虽然，最近几年胃癌的发病率有所下降，但是患者的死亡率仍然没有有效的降低，在中国胃癌患者的死亡率仍然在所有肿瘤中位列第二。胃癌分为早期胃癌和进展性胃癌，大部分胃癌患者诊断时就已处于进展期。很多的早期胃癌患者都缺乏特异性的临床症状，患者通常并不会重视，从而致使胃癌被忽视。临床数据表明，晚期胃癌患者的术后5年生存率只有30％-40％，而早期胃癌患者的术后生存率则可以达到70-80％。

长链非编码rna是一类大约200个核苷酸，缺少完整特异性阅读框的非编码能力的rna分子。长链非编码rna在细胞和组织中具有较强的特异性，且具有广泛的生物学功能，并且多数的长链非编码rna在疾病中呈现为异常表达。现有的研究显示，长链非编码rna在染色质水平、转录水平、转录后水平、翻译水平等均具有着重要的作用。按照长链非编码rna在基因组内与相邻蛋白编码基因的相对位置差异，将长链非编码rna分为5类，分别是：同义lncrna、反义lncrna、双向lncrna、内含子lncrna和基因间lncrna。位置上的不同，将会使lncrna发挥不同的作用。

目前的研究表明，长链非编码rna在肿瘤的发生发展中扮演着重要的作用，因此，寻找新的与胃癌发生发展有关的长链非编码rna，并设计相应的分子靶向药物对于胃癌的治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种特异性抑制linc02033的sirna，用于制备抗胃癌制剂。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种基因抑制剂，所述基因抑制剂为sirna，所述sirna抑制长链非编码rnalinc02033的表达，所述sirna用于制备抗胃癌制剂。

优选地，所述sirna的正义链为ggagcaagaucuaagauuaaa，sirna的反义链为uaaucuuagaucuugcuccaa。

此外，本发明提供了linc02033基因抑制剂在制备抗胃癌药物中的用途。

优选地，所述用途包括linc02033在制备抗胃癌转移制剂中的用途。

除此之外，本发明提供了一种抗胃癌转移的制剂，所述制剂包括linc02033的基因抑制剂。

优选地，所述基因抑制剂为linc02033的sirna。

优选地，所述sirna的正义链为ggagcaagaucuaagauuaaa，所述sirna的反义链为uaaucuuagaucuugcuccaa。

优选地，所述制剂还包括其他药学上可接受的药物载体。

本发明的有益效果在于：

本发明通过实验证明长链非编码rnalinc02033在胃癌组织中高表达，同时，本发明证明通过sirna抑制剂抑制linc02033表达能够显著的抑制胃癌细胞的迁移和侵袭，因此，linc02033sirna能够用于制备抗胃癌转移制剂，从而为开发新的胃癌药物提供了可能。

附图说明

图1linc02033在胃癌组织和癌旁组织中的表达差异

图2si-linc02033基因抑制剂对于linc02033的抑制效果

图3细胞划痕实验检测抑制linc02033对于胃癌细胞迁移的影响

图4transwell实验检测抑制linc02033对于胃癌细胞迁移和侵袭的影响

图5westernblot实验检测抑制linc02033对于胃癌细胞emt相关蛋白的影响

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明，即所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

实施例1

检测linc02033在胃癌组织和癌旁组织表达差异

1.研究对象

20例胃癌组织和20例相应的癌旁组织，组织来源于青岛市肿瘤医院，所有组织标本均通过医院伦理委员会审查和批准，所有组织标本来源患者均签署知情同意书。胃癌组织经病理检测证实为胃癌(胃癌组织切除时，患者尚未进行化疗，放疗等治疗)。

具体组织情况如下

2.组织rna提取

(1)将50mg胃癌组织或癌旁组织放入到研钵中，加入少量的液氮，进行迅速的研磨，组织变软后，再次加入少量液氮进行研磨，重复三次；

(2)加入1mltrizol，使用电动匀浆器匀浆2分钟，之后，将组织转移至离心管中，室温放置5分钟；

(3)离心机12000r/min离心5分钟，保留上清，去除沉淀；

(4)在离心管中加入200μl氯仿，震荡混匀后，室温放置5分钟；

(5)离心机12000r/min，4℃，离心15min；

(6)吸取上清转移至另一离心管中，加入500μl预冷的异丙醇混匀，混匀之后冰上静置10分钟；

(7)离心机12000r/min，4℃，离心10min，去除上清，保留沉淀；

(8)在沉淀中加入1ml75％乙醇，温和的震荡离心管，悬浮沉淀；

(9)离心机8000r/min，4℃，离心5min，小心去除上清；

(10)室温静置10分钟，待rna干燥后，使用50μldepc水溶解rna，并使用微量紫外分光光度计测定rna的纯度和浓度。

3.荧光定量pcr检测

(1)去除基因组dna

反应试剂：

反应条件：42℃2分钟，4℃。

(2)逆转录反应

反应试剂：

反应条件：37℃15分钟，85℃5秒，4℃。

4.荧光定量pcr检测

反应试剂:

反应条件：95℃5min；95℃60s，62℃40s40个循环；72℃5min。

linc02033引物序列为

forward5’-ggccttctccagcagcctaa-3’(seqno:1)

reverse5’-tctgcagcaccaggaggaag-3’(seqno:2)

gapdh引物序列为

forward5’-gaaggtgaaggtcggagtc-3’(seqno:3)

reverse5’-gaagatggtgatgggatttc-3’(seqno:4)

采用2^-△△ct方法处理实时定量pcr数据，计算linc02033的表达变化。

实验结果

实验结果如图1所示，从图中可以看出，胃癌组织中linc02033的相对表达量(2.394±0.168)明显高于癌旁组织中，且差异具有统计学意义，说明相较于癌旁组织，linc02033在胃癌组织中高表达，因此，linc02033可以作为胃癌治疗的靶点。

实施例2

荧光定量pcr检测linc02033基因抑制剂的效果

1.细胞培养

人胃癌细胞mkn-45采用高糖dmem培养液培养(10％胎牛血清)，置于37℃，5％co2恒温细胞培养箱培养。

2.si-rna转染

(1)转染前一天将2×10⁵的mkn-45细胞接种于6孔板中，37℃，5％co2恒温细胞培养箱培养24h，参照lipofectamine2000说明书进行转染；

(2)实验分组为对照组(空转)，si-nc组，si-linc02033组。

(3)荧光pcr检测步骤同实施例1。

si-linc02033的序列为

正义链为5’-ggagcaagaucuaagauuaaa-3’(seqidno.5)

反义链为5’-uaaucuuagaucuugcuccaa-3’(seqidno.6)

实验结果

实验结果如图2所示，从图中可以看出si-linc02033组的linc02033相对表达量显著降低，说明si-linc02033基因抑制剂能够有效的抑制linc02033的表达，抑制率为81.7％。

实施例3

细胞划痕实验

(1)将转染si-nc和si-linc02033的mkn-45细胞接种至6孔板中；

(2)当细胞密度达到85％时，使用200μl枪头在培养孔的垂直方向轻轻滑过贴壁细胞层，并且使用pbs洗去脱落下来的细胞；

(3)分别于0h和24h在倒置显微镜下拍摄划痕。

实验结果

实验结果如图3所示，从图中可以看出，si-linc02033组细胞发生迁移的距离要显著的小于si-nc组，说明si-linc02033基因抑制剂能够有效的抑制胃癌细胞mkn-45的细胞迁移能力。

实施例4

细胞侵袭实验

(1)将固体matrigel胶置于4℃过夜融化为液态；

(2)用移液器吸取200μl无血清培养基，加入40μlmatrigel胶，冰上混匀，在transwell小室的上室加入100μl混匀后的matrigel胶，放入培养箱中孵育4小时，至matrigel胶完全变为固态；

(3)将转染si-nc和si-linc02033的mkn-45细胞消化，并且使用pbs洗涤细胞，之后使用无血清培养基悬浮细胞，并进行细胞计数；

(4)在transwll下室中加入600μl含10％血清的培养基，上室加入100μl包含2.5×10⁴个细胞的细胞悬液，继续在细胞培养箱中培养24小时；

(5)用镊子小心的将transwell小室取出，吸干上室液体，之后将transwell小室转移到加入800μl甲醇的培养板中，室温固定30分钟；

(6)将transwell小室取出，吸干上室固定液，转移到预先加入800μlgiemsa染液的孔中，室温染色20分钟；

(7)用清水冲洗浸泡3次，取出transwell小室，吸去上室液体，用棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞，置于显微镜下进行拍照。

实验结果

实验结果如图4所示，从图中可以看出，si-linc02033组通过transwell小室的细胞数量少于si-nc组，说明si-lin02033能够抑制胃癌细胞mkn-45的细胞侵袭。

实施例5

westernblot实验

(1)转染前一天将2×10⁵的mkn-45细胞接种到6孔培养板上，37℃，5％co2细胞培养箱中培养24h后，参照lipofectamine2000说明书对细胞进行转染，实验分组为si-nc组，si-linc02033组，每组重复3次；

(2)转染48h后，pbs洗涤细胞，每孔加入100μlripa细胞裂解液，裂解30分钟；

(3)充分裂解后，将裂解液转移至离心管中，10000g/min，4℃离心10分钟，取上清至新的离心管；

(4)吸取2μl，使用bca法进行蛋白定量，加入5×上样缓冲液调整蛋白样品为2μg/μl，沸水水浴煮5分钟；

(5)12000rpm/min离心5分钟，得到制备好的蛋白样品；

(6)组装好电泳槽，配置5％上层胶和12％下层胶；

(7)每孔加入20μg蛋白样品和蛋白marker指示剂；

(8)电泳槽加入新配置的电泳缓冲液，按照上层胶电压80v，下层胶120v条件下开始电泳，待溴酚蓝指示剂移至胶底时，结束电泳；

(9)组装转膜夹子，装入倒满转移液的转移槽中，250ma，转膜1.5h；

(10)将转膜后的pvdf膜转移至5％的脱脂奶粉中，室温，封闭1h；

(11)tbst洗膜3次，每次5min，孵育β-actin，e-cadherin，n-cadherin和vimentin一抗稀释液，4℃摇床孵育过夜；

(12)tbst洗膜3次，每次5min，孵育二抗，室温，摇床孵育1h；

(13)暗室中，快速将发光液滴加至pvdf膜上，进行显像。

实验结果

实验结果如图5所示，从图中可以看出，转染si-linc02033之后，促emt转化的n-cadherin，vimentin的表达量下调，而抑制emt转化的e-cadherin的表达上调，说明抑制linc02033能够通过抑制emt来促进胃癌细胞的转移和侵袭。

序列表

<110>青岛思拓新源细胞医学有限公司

<120>一种基因抑制剂在制备抗胃癌转移制剂中的用途

<130>2020.3.20

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

ggccttctccagcagcctaa20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tctgcagcaccaggaggaag20

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

gaaggtgaaggtcggagtc19

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gaagatggtgatgggatttc20

<210>5

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggagcaagaucuaagauuaaa21

<210>6

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

uaaucuuagaucuugcuccaa21