蒙古沙冬青诱导型启动子的克隆及应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程和生物
技术领域：
，具体涉及一种蒙古沙冬青诱导型启动子的克隆及应用。
背景技术：
：植物的生长发育和生命周期是不同的基因在时间和空间上有序表达的结果。植物基因表达调控受多种内外因子的精细调控，具有严格的时间及空间有序性，基因表达调控包括转录前、转录、转录后、翻译、翻译后五个水平。其中转录水平的调控最为关键。而启动子是转录水平调控的重要元件。所以植物自身的启动子决定了其基因的表达水平。根据启动子作用方式及功能可分为以下三类：即组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。组成型启动子是在植物所有组织中都能启动基因的表达，基因表达具有持续性。应用组成型表达的启动子能使外源基因在受体植株的所有组织中持续地表达，使外源基因表达产物发挥最大的功能。应用最广泛的是烟草花叶病毒基因camv35s启动子(odell,etal.1985)、水稻肌动蛋白actin1启动子(mcelroy,etal.1990)及玉米泛素ubiquitin启动子(holtorf,etal.1995)。但由于组成型启动子驱动的目的基因在植物的所有组织中都持续地表达，导致植物体内的物质和能量过度地消耗，因此组成型启动子在植物基因工程中的应用也存在一定的缺陷。如果外源基因在植物体的各个器官中持续表达，一方面会导致植物体内产生大量的异源蛋白质或代谢产物，破坏植物体原有的代谢平衡，并进一步影响植物体的产量和品质的提高，以及形态特征的建成；另一方面，有些代谢产物对植物并不是必需的，这将会阻碍植物的生长发育，最终可能导致植物体死亡。为了克服组成型启动子给植物带来的不利影响，就必须寻找一些其他的启动子，比如诱导型启动子。诱导型启动子是当植物受到周围生物或非生物环境胁迫时，才会启动相应的功能基因表达来适应和抵御不良环境。当周围不良环境改善后，相应的功能基因表达就减少或停止。这就降低了目的基因在植物的所有组织中都持续表达给植物带来的不利影响，所以对诱导型启动子的研究和应用近年来受到越来越多科研工作者的重视。沙冬青(ammppiptanthusmongolicus)又名蒙古沙冬青，是我国荒漠地区特有的常绿阔叶灌木，其在长期恶劣的气候条件下形成极强的抗旱、耐寒性，是研究植物抗逆机制很好的材料。因此以沙冬青为材料，克隆其脱水素基因启动子(pamdhn)，为转基因作物抗逆育种提供理论基础。技术实现要素：本发明以抗逆性极强的植物沙冬青为材料，克隆了其脱水素基因(amdhn)的上游启动子序列，利用tssp和plantcare数据库分析其序列，发现该序列具有启动子的基本元件tata-box和caat-box，并且具有多个与低温、干旱、盐胁迫和植物激素诱导相关的顺式作用元件，其中包括1个dre和3个abre等诱导元件。根据启动子序列构建了含有不同诱导元件的截短形式的植物表达载体，将植物表达载体转入拟南芥，获得转基因拟南芥植株。利用不同诱导因子处理转基因拟南芥植株，观察到转基因拟南芥植株中的gus基因大量表达，所以确定了该启动子为诱导型启动子。本发明解决的技术问题：提供一种分离的dna，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受逆境胁迫和植物激素诱导表达，所述分离的dna的序列如seqidno：1所示，其能够指导可操作地连接在其下游的核酸在植物中受低温胁迫、植物激素诱导表达。优先的是，植物激素为aba或sa。含有上述启动子的表达盒、重组表达载体、工程菌或转基因，其中所述核酸能够赋予植物抗逆或诱导表达的性状。本发明提供一种所述的表达盒转化的转基因植物的生产方法，其包括：(1)构建包含启动子的的表达盒；(2)将步骤(1)获得的表达盒导入植物细胞；(3)再生出转基因植物；和(4)选择出转基因植物；(5)增殖步骤(4)获得的植物以获得后代。本发明还提供赋予植物耐逆性状或植物激素诱导表达的方法，其包括(1)选择能够赋予植物耐逆性状或植物激素诱导表达的核酸：(2)使用步骤(1)获得的核酸构建表达盒；(3)将步骤(2)获得的表达盒导入植物细胞；(4)再生出转基因植物；和(5)选择出赋予了植物耐逆性状的转基因植物；(6)增殖步骤(5)获得的植物以获得后代。本发明还提供一种在植物中表达异源核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物体导入特定表达盒，所述特定表达盒含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的异源核苷酸序列，其中所述启动子的核苷酸序列如seqidno：1所示，作为优选的是，其中所述的植物为蒙古沙冬青。将沙冬青脱水素基因启动子(pamdhn)的序列扩增后，克隆至含有报告基因gus的植物表达载体，将构建好的载体转化拟南芥，获得转基因株系，并用gus显示底物mug对转基因植株染色，显微镜下观测拟南芥植株组织染色情况。有益效果：本发明首次提供本发明提供一种蒙古沙冬青诱导型启动子及其应用。该启动子的特异性很强，因此为植物育种的研究提供了有效的工具。附图说明图1：蒙古沙冬青基因组dna特异性引物的设计；图2：蒙古沙冬青pamdhn启动子基础和调控元件；图3：蒙古沙冬青3条不同长度的启动子序列；图4：pcr鉴定转化子；图5：融合aba元件的启动子序列表达图谱；图6：融合低温元件的启动子序列表达图谱；图7：融合sa元件的启动子序列表达图谱；图8：拟南芥蘸花法转化及筛选步骤：拟南芥野生型(col-0)种子表面消毒点种在ms培养基中(16h光照/天培养10天)；将ms培养基中拟南芥移栽到育苗基质中；生长3周拟南芥；生长5-6周拟南芥抽薹，准备农杆菌蘸花转化；生长9-10周拟南芥，收种子(t0代种子)t0代种子在抗性培养基上筛选(箭头所示为筛选阳性植株)；图9：转基因拟南芥pcr鉴定；图10：拟南芥gus染色分析：(a)35s-gus拟南芥在不同处理条件下的染色结果，分别为对照，200μmsa处理48小时，4℃低温胁迫48小时，10μmaba处理48小时；(b)psa648拟南芥株系在不同处理条件下的染色结果，分别为对照，200μmsa处理48小时；(c)pcold262拟南芥株系在不同处理条件下的染色结果，分别为对照，4℃低温胁迫48小时；(d)paba232拟南芥株系在不同处理条件下的染色结果，分别为对照，10μmaba处理48小时；(e)不同处理条件下不同拟南芥株系gus含量测定。具体实施方式根据以下实施例，可以更好的理解本发明，但以下实施例并不表示对本发明的任何限制。实施例1.pamdhn启动子序列的克隆利用染色体步移方法克隆启动子序列，方法如下：1.蒙古沙冬青基因组dna的获取，利用植物基因组提取试剂盒提取蒙古沙冬青幼叶的基因组dna。2.特异性引物的设计，根据已知的蒙古沙冬青脱水素基因(amdhn)序列，在atg下游284bp、184bp和68bp处设计3条同向3′端特异性引物，即：sp1、sp2、sp3。sp1-5′-cagttccaccaccgcttccata-3′；sp2-5′-tccatatcctgctgtgtcacca-3′sp3-5′-gcctcacagggtttccatactcatc-3′。具体位置见图1。3.巢式pcr扩增启动子序列(1)第一次pcr：取2μl蒙古沙冬青基因组dna作为模板，以apprimer(试剂盒提供的四种中的任意一种，以下以ap1引物为例，挑选扩增效果最好的引物进行后续的扩增)作为上游引物，sp1引物为下游引物，进行第一次pcr反应。①按下列组份配制第一次pcr反应液，基因组dna经od测定准确定量后，取2μl，以ap1引物作为上游引物，sp1为下游引物，进行第一次pcr反应。按下列组份配制1stpcr反应液。②1stpcr反应条件如下：(2)第二次pcr反应。将1stpcr反应液稀释1000倍后，取1μl作为2ndpcr反应的模板，以ap1引物为上游引物，sp2引物为下游引物，进行2ndpcr反应。①按下列组份配制2ndpcr反应液。②2ndpcr反应条件如下：(3)第三次pcr反应。将2ndpcr反应液稀释1000倍后，取1μl作为3rdpcr反应的模板，以ap1引物为上游引物，sp3引物为下游引物，进行3rdpcr反应。①按下列组份配制3rdpcr反应液。②3rdpcr反应条件如下：4.取1st，2nd，3rdpcr反应液各5μl，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳。5.切胶回收清晰的ap1/sp3引物的电泳条带，连接pmd19-t载体。6.连接反应如下：7.转化大肠杆菌(1)在冰上将5μl上述连接产物与100μl感受态细胞trans1-t1混匀，冰浴30min；(2)42℃水浴中热激30s，然后快速将管转移至冰浴中2min；(3)向离心管中加入500μllb液体培养基，混匀后置于37℃摇床上，200rpm/min温育1h，使细菌复苏；(4)于4000rpm/min离心2min，吸去约400μl的上清液，用剩余的培养基将细胞重新悬浮。取200μl菌液涂于含氨苄青霉素的lb平板上，氨苄青霉素(amp)浓度为100μg/ml；(5)37℃条件下，倒置平板培养12-16h，筛选抗性菌落。8.转化子蓝白斑筛选将转化的细菌菌液均匀涂布于预先用16μl50mg/mliptg和40μl20mg/mlx-gal涂布的lb氨苄平板上，倒置于37℃培养箱中培养过夜。对转化子进行蓝白班筛选，因为pmd19-t载体的多克隆位点(mcs)位于lacz-α肽编码区内，当外源dna片段插入pmd19-t载体的mcs后，会改变lacz基因的编码，从而影响其产物β-半乳糖苷酶α-片段的活性，所以重组克隆在x-gal/iptg平板上呈白色，而非重组克隆呈蓝色。随机挑选平皿上的菌斑较大、光滑、不靠边、密度低处的白色菌斑6个，分别置于3ml含amp的lb液体培养基中。37℃，250rpm震荡，过夜培养。9.分别取6个过夜菌液送上海生工公司，进行dna序列测定。10.经过测序拼接共克隆到1718bp脱水素基因启动子序列，脱水素基因启动子序列如seqidno.1所示。实施例2.pamdhn启动子序列分析预测(1)利用启动子分析软件tssp和plantcare分析预测amdhn基因atg上游1500bp启动子序列的基础响应元件和调控元件，分析结果发现，其中转录起始位点位于atg上游70bp，转录起始位点为a，tata-box位于-33bp，caat-box位于-86bp，且存在多个调控元件，其中包括低温、盐胁迫、aba和meja等诱导元件。具体位置见图2。实施例3.pamdhn启动子的功能研究1.克隆不同长度的启动子序列截取atg上游3段不同长度的启动子序列，分别包括aba、低温和meja诱导元件的启动子序列长度分别为232bp、262bp和648bp(图3)。特异引物如下：sa648-f-ctgcaggtcgacggatccttgatgagagataaaaaatgagacaaaaaattgggsa648-r-acgacggccagtgaattctatgtatgtgtgtataagcagaaagaatgccold262-f-ctgcaggtcgacggatccacatggatgtcggtaaaaaaaaaaaaaaaacccold262-r-acgacggccagtgaattctatgtatgtgtgtataagcagaaagaatgcacaba232-f-ctgcaggtcgacggatccccaacacgcgtcctagctagaba232-r-acgacggccagtgaattctatgtatgtgtgtataagcagaaagaatgc以蒙古沙冬青基因组dna为模板，利用上述引物通过pcr扩增3条不同长度的启动子序列，2.植物表达载体构建(1)目的基因扩增pcr反应体系：反应程序：94℃：3min；94℃：30sec；58℃：45sec；72℃：30s；33cycles；72℃:10min；(2)连接pmd19-t载体将上述pcr产物切胶回收，连接pmd19-t。连接反应如下：室温反应30min，连接产物转化大肠杆菌。(3)转化子蓝白斑筛选。挑选白色菌斑6个，分别置于3ml含amp的lb液体培养基中。37℃，250rpm震荡，过夜培养。(4)pcr鉴定转化子，鉴定正确的转化子上海生工公司进行dna序列测定。测序正确的转化子用于表达载体的构建。(5)目的基因与表达载体连接：a.用ecori和bamhi双酶切pcambia1391z和t载体质粒，分别回收目的片段；双酶切反应体系：反应体系使用量10xtangobuffer2.0μlecori1μlbamhi1μl质粒1μgdh2oupto20μl37℃酶切1.0h；65℃，20min失活。b.将a所得两个片段用同源重组酶重组连接、转化大肠杆菌，菌落pcr检测。连接反应如下：室温反应30min，连接产物转化transt1感受态细胞。挑取单菌落进行pcr鉴定。结果如图4。(6)植物表达载体构建图谱如图5-7所示。3.重组的植物表达载体转化农杆菌(1)于－80℃冰箱中取出农杆菌gv3101感受态细胞(100μl/管)，立即置于冰浴上融化。(2)加入5μl待转化的重组连接产物，轻弹管壁混匀。(3)把菌液加入预冷的电极杯中，1400v，电激。(4)立即把杯中的混合液转入预先加好0.8mllb液体培养基的的eppendorf管中。(5)28℃，150rpm，温育2h。(6)取50μl转化产物涂于含rif和str和kan(50g/ml)抗性平板上。实施例4.重组载体转化拟南芥利用农杆菌蘸花法转化拟南芥步骤如下(图8)：(1)拟南芥种植：取col-0生态型的拟南芥种子，在ep管中用70％的酒精消毒2-3min，10％次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗5-6次，用0.1％的琼脂混匀，点种在1/2ms培养基上，4℃黑暗条件下春化3天，然后置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000lux、18℃、湿度为70％条件下培养。10天后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中。当幼苗长至5-6cm时进行转化，转化前将已经开放的花和种子剪除干净。(2)农杆菌蘸花法转化拟南芥a.活化农杆菌gv3101；b.以1:50接种到100mllb培养基中，28℃，200rpm培养至od600＝1.2-1.6；c.4000rpm，离心15min，收集菌体；d.重悬于渗透缓冲液(1/2ms培养基+5％蔗糖，121℃灭菌20min，加终浓度0.02-0.03％silwettl-77，振荡混匀)，以重悬渗透液为对照，调节od600＝0.4-0.6；e.将拟南芥倒置于装有渗透缓冲液的合适大小的容器上侵染30s，用塑料薄膜覆盖整个托盘并适留通气孔后，在弱光下培养，24h后取下薄膜，于室温中继续培养。f.约30日后收获种子，(3)阳性苗筛选：a.将收获的转基因种子用含有0.2％的tritonx-100浸泡10min；b.用10％的次氯酸南表面消毒10-12min；c.灭菌水冲洗5-6次，每次约2min；d.用水将转基因种子置于含潮霉素(筛选浓度为20mg/l)的ms平板上，4℃暗培养3天；e.抗性筛选的种子在22℃，16h光照/8h黑夜光周期培养。两周后，阳性植株在抗生素平板上生长良好，而阴性植物则不萌发或不久死亡。实施例5.转基因拟南芥pcr鉴定及纯合体的筛选通过3代的转基因植株筛选，获得纯合的转基因拟南芥种子。转基因拟南芥pcr鉴定使用hptii特异引物进行检测，产物长度为448bp，引物为hptii-f：gatgttggcgacctcgtatt和hptii-r：tagcgagagcctgacctatt。实验结果如图9所示。实施例6.转基因拟南芥中gus基因表达(1)转基因拟南芥种植取col-0生态型的拟南芥种子，在ep管中加入自来水，用移液枪吸取种子种于蛭石(蛭石浇透水)中，用塑料膜覆盖置于16h光照/8h黑暗光周期、2000-3000lux、23℃、湿度为70％条件下培养。10天后，选择生长健壮的幼苗移栽到培养土中。(2)转基因拟南芥植株组织染色(图10)a.将生长1个月的拟南芥植株置于灭菌的平皿中，加入gus染色液覆盖材料；b.将平皿置于恒温培养箱中培养24h后倒掉染色液；c.向平皿中加入70％乙醇，于37℃温育5-6h；d.倒掉平皿中的乙醇，在37℃继续温育10h，组织完全脱色后倒掉乙醇，进行gus染色观察及照相。(3)gus蛋白活性测定gus能与底物mug(分子量352.3，4-甲基伞型酮-β-葡萄糖醛酸苷，4-methylumbelliferylβ-d-glucuronide)反应产生荧光物质mu(分子量198.2，4-甲基伞型酮，4-methylumbelliferone)。mu的激发波长为365nm，发射波长为456nm，其含量可由荧光分光光度计测出。因此，可以根据单位质量的植物总蛋白在单位时间内产生的荧光物质的多少来定量的检测gus含量。①植物总蛋白的提取a.取新鲜的植物组织100mg左右，用液氮将生物材料急速冷冻，然后采用液氮研磨的方式在研钵里磨碎组织。如果不立即研磨，可以先将液氮冷冻处理的植物组织储存于-80℃冰箱。b.将研磨破碎的组织转到ep管里，并立即加入1ml的gus提取缓冲液，充分混匀。c.12000rpm，4℃离心5min，将上清转至另一洁净的ep管，冰上放置待用。②蛋白浓度的测定(bradford法)a.取7个ep管，分别加入0μl、2μl、4μl、8μl、12μl、16μl、20μl的bsa标准液，用水补至相同体积20μl。加入980μl的考马斯亮蓝g250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。以蛋白浓度(mg/ml)对吸收值a595做标准曲线。b.取待测蛋白样品10μl，加10μl水，加入980μl的考马斯亮蓝g250溶液，充分混匀，冰上静置5min。用紫外分光光度计测定595nm处的吸收值。代入公式，求出蛋白样品的浓度。③gus表达水平的定量测定a.取100μl蛋白上清，加入400μl37℃预热的gus提取缓冲液里，再加入500μlmug底物，37℃温浴。在0min、15min、30min、45min和60min分别取混合反应物200ul加入到800ul反应终止液，室温避光保存。b.用荧光分光光度计在激发波长365nm、发射波长455nm下，狭缝10nm时测定不同时间点的荧光强度值。c.以荧光强度值对反应时间作曲线，求出单位时间的荧光强度变化。d.用单位时间的荧光强度变化除以参加反应的蛋白量，求出单位质量的蛋白单位时间的荧光强度变化。sequencelisting<110>内蒙古自治区农牧业科学院<120>蒙古沙冬青诱导型启动子的克隆及应用<130>蒙古沙冬青诱导型启动子的克隆及应用<160>1<170>patentinversion3.3<210>1<211>1718<212>dna<213>ammppiptanthusmongolicus<400>1ttgtaatacgactcactatagggcgaattgaatttagcggccgcgaattggccctttgtc60gagtgagatgaagaagatctcagtgaaaaagcgtcatatgtttaaataatagtgctgatg120agatcaataactaaattattgacacgattgaagaactaacaaaagagtataaattagctt180atacaggattgacaaagcaactgaatgtggtagaattttttaacaaattaaattgtactg240aattttcaaatcattgcttgcaattcaaagaatgaatgtctactaatgcatttattttac300tagaaaaagatattcattcattcaaatttataaaatacatcgaaaacaacataaattcaa360cattgctaaaaaccaaaaacgatgaatctccgaataaactcacagcacccagattaatag420cataaaacggcaaaatgcttacaaatgtgacaaaatcaaaatgatcggaatatctatgcc480tccggatctataacgttgacgtccaagtcttgatcgaatctataatggatcgaagctgat540ctgccaaactgaaccaaacgaacaccgtaacaaaacgggaaaccaaacaatgccgcaata600agacgacgaacaaaacaacgcctcactcaaatgacgaaatcacataaaaacaccaaagaa660aaacagaatctatgtgaaaaaattacttatttagataaaaggagaaaaaaaatgacatag720aatggcacaagaccaccccctccgatagatgaggaagagatcggaagagagagaaggttg780agaaagagacgactttagtagaaatgtgcaattaatggaagacgggataaaagtaaaaat840aattatcggaagcaacattgctgcaaaaatattatgtgaaccttatagccttatgcatat900ttaatatttagatactaatgtattttttacatgaatgttatagacttattataggataaa960aatctgatatcccaaaatatgatgtctcggtatccctaccaatcaaatattgaaaatgaa1020tataaatattaatgagttataattttattttttcaagtatcaaattattattgatgagag1080ataaaaaatgagacaaaaaattgggatagaaaatctttatcccatattataacattgcta1140ttaaaaacatgtaaacctcattgtccaaacaagaattactcgaaaagaaagaaagaaaga1200aagatatgatgtactgtttctttatcatacttagctaggtgtacgcgattgctgagttat1260ttgtgcccttacaatgacacaaaatcctgagccaccgtcattgaaaatcatatccattca1320tggcccagctagctttaatcaaaccttatccatttgggacttcaaggtttacctcatcct1380caaaaacgcatccactagttttcttttgtcgtgttcttcatccacgccgcgtcaccccat1440gaatcagaaaacgacaacatggatgtcggtaaaaaaaaaaaaaaaaccaacacgcgtcct1500agctagtacgtggcgcgctacaacaacattaacgtcgcatgccacgtgtcaaagcttgtg1560aacaatgaaaccggtgcactcaccagatatttatttatgcaatgtttgcttgcttatata1620aacaccattcacgaatgcttcaatcatcatcttctataatctaaaccaacaaacttcact1680ttctttgtgcattctttctgcttatacacacatacata1718当前第1页12