用于提高化妆品成分AA-2G生产转化率的酶的制作方法

本发明属于基因工程与酶工程领域，具体涉及aa-2g生产用环糊精糖基转移酶的制备和应用。
背景技术：
：维生素c葡萄糖苷(ascorbyglucoside,aa-2g)，学名2-0-α-d吡喃型葡萄糖基-l维生素c(2-0-α-d-glucopyranosy-l-ascorbicacide)是维生素c的一种衍生物，该化合物于1990年由日本林原生物化学研究所与日本冈山大学药学系共同研究发现，aa-2g是vc和吡喃型葡萄糖通过糖基转移酶作用的缩合产物，其中vc的c2羟基被吡喃型葡萄糖苷取代，两者通过糖苷键连接，由于c2上有葡萄糖基，因此aa-2g具有显著的非还原性，其同分易构体5-0-α-d吡喃型葡萄糖基-l维生素c(aa-5g)和6-0-α-d吡喃型葡萄糖基-l维生素c(aa-6g)都具有直接的还原性，虽然其比vc稳定，但不如aa-2g稳定。aa-2g具有非还原活性，不易发生氧化反应，在水溶液中稳定，具有较好的耐光型和耐热性，进入细胞后经α-葡萄糖苷酶水解生成vc和葡萄糖，具有同原始vc一样的还原性和抗氧化性，以及促进胶原蛋白的形成。环糊精糖基转移酶(cgtase)属于糖基水解酶家族，被认为是催化合成aa-2g的最佳酶，cgtase能够催化4种反应：水解反应、环化反应、耦合反应以及歧化反应，cgtase通过歧化作用可以催化低聚糖和vc反应生成葡萄糖基维生素c。日本林原生化和冈山大学首次以α-环糊精作为糖基供体通过生物转化法合成aa-2g，aa-2g的纯度可达97％，目前酶法合成是aa-2g合成的唯一途径。已经开发的用于合成aa-2g的酶有5种，α-葡萄糖苷酶、环糊精葡萄糖苷转移酶、α-淀粉酶、蔗糖磷酸酶、α-异麦芽糖基葡糖基糖形成酶，目前投入工业化生产的是环糊精葡萄糖苷转移酶，也是目前催化合成aa-2g的最佳酶，但是现有技术中cgtase还存在酶的转化率不高的问题。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明的目的在于提供用于提高化妆品成分aa-2g生产转化率的酶，其具有更高的转化率，更适合aa-2g的生产。本发明的制备过程如下：1.从ncbi上获得环糊精糖基转移酶序列(geobacillusstearothermophilus,genbank:caa41770.1)，交生物公司合成，采用ecorⅰ酶切pet20b(+)质粒，设计pcr引物f:gtgcggccgcaagctttgatgccttgacactgagt，r:ctccgtcgacaagctaagcagccatagcgtcatca，pcr反应结束后，加20μlcloningenhancer到pcr体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pet20b(+)质粒用hindⅲ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的pcr产物与纯化的线性载体混合均匀，加入in-fusion酶，50℃反应15min，转化e.colijm109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主e.colibl21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；2.质粒dna的提取将携带有质粒pet20b(+)/cgt的e.colibl21基因工程菌接种于lb/amp(amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；3.易错pcr扩增与突变文库的构建以步骤b获得的质粒为模板，用ecorⅰ酶切使质粒线性化，设计引物cgt-f：gacggagctcgaattttgatgccttgacactgagt和cgt-r：attcggatccgaattaagcagccatagcgtcatca，进行易错pcr扩增基因，易错pcr扩增体系(50μl)为10×takarataqbuffer，dntpsmixture，引物各0.2μmol/l，模板dna200ng，taqdna聚合酶2.5u，pcr反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min，mn2+浓度0.5mmol/l，mg2+浓度为7.0mmol/l，加20μlcloningenhancer到pcr体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pet20b(+)质粒用ecorⅰ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的pcr产物与纯化的线性载体混合均匀，加入in-fusion酶，50℃反应15min，转化e.colibl21，涂布于固体lb平板(100μg/mlamp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库；4.突变文库的高通量筛选从lb平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有300μllb培养基(内含50μg/mlamp)的96孔中，每孔对应一特定转化子，每块96孔板同时接种野生型克隆，作为阳性对照，37℃、200r/min振荡培养12h，在无菌条件下，从96孔板中取出20μl菌液，对应接入含1000μl乳糖自诱导培养基的另一96深孔板中，并进行37℃、200r/min振荡培养，4℃临时冷藏种子于96深孔板，25℃、200r/min振荡培养重组菌48h后，以每孔一一对应为原则，移取10μl上清粗酶液至第2块已加入每孔90μl淀粉底物[5％(w/v)]的96孔pcr反应板中，60℃条件下反应10min，加入100μl1mol/l的盐酸，加入100μl甲基橙显色液，于酶标仪上测定od505并保存数据，计算每个克隆子酶活，以阳性对照为参考，将结果高于阳性对照的克隆挑出并进行复筛；5.将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序；6.突变体的生产，将步骤五的含有突变质粒的e.colibl21发酵培养；7.突变体的纯化，采用分子筛的方法纯化突变体；8.对突变体进行sds-page电泳；9.采用bradford测定蛋白质浓度。本发明的有益效果是：获得了三种用于提高化妆品成分aa-2g生产转化率的酶，其具有更高的转化率，更适合aa-2g的生产。附图说明图1sds-page电泳图图2野生型ctg酶及突变位点三维图图3cgt酶最适反应温度具体实施方式下面通过实施例对本发明做进一步详细说明，这些实施例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。实施例1本实施例涉及的材料和试剂见表1，实验仪器见表2；表1实验材料和试剂表2实验仪器设备ab104-n电子分析天平梅特勒-托利多上海有限公司ptc-200型pcr仪美国mjresearch公司dyy-6d型核酸电泳仪北京市六一仪器厂miniprotein3蛋白电泳系统美国bio-rad公司geldoc凝胶成像系统美国bio-rad公司uv2450紫外可见光分光光度计日本shimadzu公司sigma3k-15高速冷冻离心机德国sigma公司taz-c型恒温摇床江苏省太仓市实验设备厂电热培养箱天津天宇机电有限公司蛋白核酸定量测定仪德国eppendorf公司lb培养基配方:胰蛋白胨10g/l，酵母粉5g/l，nacl10g/l，ph7.0；tb培养基配方：胰蛋白胨12g/l，酵母粉24g/l，甘油5g/l，k2hpo472mmol/l，kh2po417mmol/l，固体平板培养基：lb培养基，2％琼脂；1.从ncbi上获得环糊精糖基转移酶序列(geobacillusstearothermophilus,genbank:caa41770.1)，交生物公司合成，采用hindⅲ酶切pet20b(+)质粒，设计pcr引物f:gtgcggccgcaagctttgatgccttgacactgagt，r:ctccgtcgacaagctaagcagccatagcgtcatca，pcr反应结束后，加20μlcloningenhancer到pcr体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pet20b(+)质粒用hindⅲ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的pcr产物与纯化的线性载体混合均匀，加入in-fusion酶，50℃反应15min，转化e.colijm109，挑取阳性克隆，送生物公司测序，将鉴定正确的质粒转化宿主e.colibl21进行表达，得到含有野生型序列质粒的基因工程菌；2.质粒dna的提取将携带有质粒pet20b(+)/cgt的e.colibl21基因工程菌接种于lb/amp(amp终浓度100μg/ml)液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，使用质粒小量提取试剂盒抽提质粒，具体操作按照说明书进行；3.易错pcr扩增与突变文库的构建以步骤b获得的质粒为模板，用ecorⅰ酶切使质粒线性化，设计引物cgt-f：gacggagctcgaattttgatgccttgacactgagt和cgt-r：attcggatccgaattaagcagccatagcgtcatca，进行易错pcr扩增基因，易错pcr扩增体系(50μl)为10×takarataqbuffer，dntpsmixture，引物各0.2μmol/l，模板dna200ng，taqdna聚合酶2.5u，pcr反应条件：95℃5min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min，mn2+浓度0.5mmol/l，mg2+浓度为7.0mmol/l，加20μlcloningenhancer到pcr体系中，37℃孵育15min，80℃孵育15min，将pet20b(+)质粒用ecorⅰ酶切线性化，酶切产物经过0.75％琼脂糖凝胶电泳后回收，溶于灭菌双蒸水中，将孵育后的pcr产物与纯化的线性载体混合均匀，加入in-fusion酶，50℃反应15min，转化e.colibl21，涂布于固体lb平板(100μg/mlamp)抗性筛选阳性转化子，所有转化子构成突变体文库；4.突变文库的高通量筛选从lb平板上挑选单个克隆子菌落接种于含有300μllb培养基(内含50μg/mlamp)的96孔中，每孔对应一特定转化子，每块96孔板同时接种野生型克隆，作为阳性对照，37℃、200r/min振荡培养12h，在无菌条件下，从96孔板中取出20μl菌液，对应接入含1000μl乳糖自诱导培养基的另一96深孔板中，并进行37℃、200r/min振荡培养，4℃临时冷藏种子于96深孔板，25℃、200r/min振荡培养重组菌48h后，以每孔一一对应为原则，移取10μl上清粗酶液至第2块已加入每孔90μl淀粉底物[5％(w/v)]的96孔pcr反应板中，60℃条件下反应10min，加入100μl1mol/l的盐酸，加入100μl甲基橙显色液，于酶标仪上测定od505并保存数据，计算每个克隆子酶活，以阳性对照为参考，将结果高于阳性对照的克隆挑出并进行复筛；5.将复筛通过的阳性克隆，送生物公司测序，测序结果见表3；6.突变体的生产种子培养：将含有突变质粒的e.colibl21接种至装有25mllb培养基的250ml三角瓶中，在37℃，200r/min的摇床中培养8h；发酵培养：将培养好的种子培养液按4％(v/v)的接种量，接种至装有100mltb培养基的500ml三角瓶中，在37℃，200r/min的摇床中培养，当菌体培养至od600为0.6时，添加iptg至0.01mmol/l，迅速转移至25℃摇床，继续诱导90h；各培养基使用前添加100μg/ml氨苄青霉素；7.突变体的纯化a.样品准备发酵培养后的菌液在4℃，8000r/min下离心15min，收集上清液作为纯化的样品，用1mol/lnaoh调节ph至8.0待上样；b.缓冲液配制缓冲液a(平衡缓冲液)：1.8mmol/lkh2po4，10mmol/lna2hpo4，2.7mmol/lkcl，140mmol/lnacl；缓冲液b(洗脱缓冲液)：500mmol/l咪唑，300mmol/lnacl，50mmol/lna2hpo4；缓冲液c(咪唑稀释液)：300mmol/lnacl，50mmol/lna2hpo4；所有缓冲液均用1mol/lnaoh调节ph至8.0；c.装柱加蒸馏水于层析柱中以排除柱子中的空气，排除蒸馏水至保留5-8cm高度在柱内；用移液枪吸取所需量已混匀的介质ni-nta琼脂糖，加入层析柱中，静置30min，使其自然沉降；将转换杆出液端从上端管口缓慢推至介质沉降平面，使介质ni-nta琼脂糖表面维持在水平状态；d.过柱粗酶液在缓冲液a中透析过夜，层析柱的平衡用5-10倍介质体积的缓冲液a，上样流速为1ml/min，未结合在层析柱中的蛋白再用5-10倍介质体积的缓冲液a洗去；吸附到柱上的蛋白用缓冲液b和缓冲液c进行梯度洗脱，洗脱流速1ml/min，收集相应的峰，通过sds-page和酶活分析鉴定突变型cgt酶；纯化的突变型cgt酶保存在-80℃超低温冰箱中；8.sds-page电泳sds-page电泳凝胶的制备参照试剂盒说明书，使用分离胶浓度为10％，浓缩胶浓度为5％，以0.1％考马斯亮蓝r-250进行染色，见图1；9.蛋白质浓度测定具体操作方法根据bradford法蛋白定量试剂盒说明书进行操作。野生型和突变型cgt酶在胞外生产水平上没有明显差异，诱导90h后发酵液中存在45-50mg/lcgt酶蛋白，纯化酶的回收率约为3-5％，纯化后突变酶的纯度与分子量通过sds-page分析估计，突变酶分子量与野生型大小相当约79kd，野生型ctg酶及突变位点三维图见图2。表3突变体的测序结果突变体编号原始核酸序列突变后核酸序列原始氨基酸序列突变后氨基酸序列突变体199aactacny突变体233gttgaave突变体240gatgctda实验一：aa-2g的合成将纯化后的酶液用醋酸-醋酸钠缓冲液(ph5.5)稀释至蛋白浓度为1mg/ml，取适量与底物麦芽糊精和l-aa(5％，w/v)混合，以2ml甘油管作为反映容器，基本装满，黑色纸包裹避光避氧下37℃反应24h，然后加入10u/ml糖化酶在65℃，ph5.5条件下反应24h。实验二：aa-2g的测定aa-2g的测定采用hplc法，相关条件如下：dionexu3000高效液相色谱仪，amethystc18-h色谱柱(4.6mm×250mm，sepax，america)，asi-100自动进样器，紫外二极管阵列检测器uvd340u，柱温25℃，检测波长238nm，进样量5μl，流动相组成kh2po4(0.05mol/l):甲醇＝99:1，用磷酸调ph至2.0，流速0.6ml/min。用超纯水配制浓度为：100mg/l、200mg/l、300mg/l、400mg/l、500mg/l的aa-2g标准液，经hplc分析，大约10min时出现aa-2g的流出峰，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，绘制aa-2g含量的标准曲线。为了确定转化液中aa-2g的量，制作了aa-2g标准曲线，该标准曲线的方程为：y＝371.4x+1.33式中：x-aa-2g峰面积；y-aa-2g含量。线性相关系数r2＝0.9985，可以用来计算转化液中aa-2g的量。样品处理方法：转化液经8000r/min离心5min，取1ml上清液，用蒸馏水定容至5ml容量瓶。然后，用0.22μm滤膜过滤后进样。根据吸入峰面积带入标准曲线，计算aa-2g浓度。实验结果见表4。表4aa-2g产量对比表cgt酶aa-2g产量(g/l)较野生型提高率(％)野生型156.3±0.57-突变体199174.9±0.7811.90突变体233170.3±0.928.95突变体240172.5±0.6710.36实验三：突变体酶法合成aa-2g的最适温度在不同反应温度(30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃)下测定野生型或突变型cgt酶合成aa-2g的产量并作图，实验结果见图3。当前第1页12