检测喷气燃料中硫酸盐还原菌引物、应用及检测方法与流程

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测喷气燃料中硫酸盐还原菌引物、应用及检测方法。

背景技术：

本发明对于背景技术的描述属于与本发明相关的相关技术，仅仅是用于说明和便于理解本发明的

技术实现要素：
，不应理解为申请人明确认为或推定申请人认为是本发明在首次提出申请的申请日的现有技术。

硫酸盐还原菌(sulfate-reducingbacteria,srb)是一类能将硫酸根离子及其它氧化态硫还原为硫化物并从中获取能量的一类兼性厌氧微生物。硫酸盐还原菌生命力顽强，广泛分布于自然界中，常见于土壤、海洋及油田管道中，同时硫酸盐还原菌也是腐蚀性最强，且分布最为广泛的一种微生物。硫酸盐还原菌种类繁多，目前报道的有就有多达13个属，40余种。据研究，喷气燃料中的污染硫酸盐还原菌以脱硫弧菌属(desulfovibrio)及更为耐氧的脱硫肠状菌属(desufotomaculum)为主，喷气燃料中的硫酸盐还原菌污染对喷气燃料质量有较大影响，会导致喷气燃料腐蚀性加剧，引起银片腐蚀不合格。

目前硫酸盐还原菌最常用的检测方法为最大可能数法(mpn)，mpn法是一种基于培养法的方法，检测准确度高，检测限低，但其检测周期一般在30天左右，耗时长不适用于快速检测。同时还有一些基于srb特征物质的检测方法如硫离子选择性电极测定法，或基于srb细胞检测方法如荧光抗体技术，以及基于srb遗传信息的检测方法如聚合酶链式反应(pcr)方法等。但以上方法都存在操作复杂或不适用于喷气燃料样本检测等问题，因此需要建立一种适用于现场快速检验，且方便操作的喷气燃料硫酸盐还原菌检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种、应用及检测方法，本发明的方法具有灵敏度高和特异性强的优点。

第一方面，本发明提供了一种检测硫酸盐还原菌的引物，包括：外引物f3和b3，内引物fip和bip，两条环引物lb和lf；

所述的外引物f3序列如seqidno.1所示，所述的外引物b3序列如seqidno.2所示，所述的内引物fip序列如seqidno.3所示，所述的内引物bip序列如seqidno.4所示，所述的环引物lb序列如seqidno.5所示，所述的环引物lf序列如seqidno.6所示。

进一步的，内引物fip的5’端进行生物素标记，环引物lf的5’端进行异硫氰酸荧光素标记作为探针。

第二方面，本发明提供了一种硫酸盐还原菌检测方法，包括如下步骤：

以硫酸盐还原菌的基因组dna作为模板进行扩增，lamp反应体系引物浓度为：f3和b3各0.2μmol/l，fip和bip各1.6μmol/l，lf、lb各0.8μmol/l；lamp预混液为，20mmol/ltris-hcl(ph8.8)，10mmol/lkcl，8mmol/lmgso4，10mmol/l(nh4)2so4，0.1％吐温20，0.8mol/lbetaine，1.4mmol/ldntps，8u/μlbstdna聚合酶；

硫酸盐还原菌(chaetomiumglobosum)的lamp反应体系为：lamp预混液：10ml，fip：2.5ml，bip：2.5ml，lb：0.95ml，lf：0.95ml，f3：0.3ml，b3：0.3ml，待测样品dna模板：2ml；去离子水：0.5ml；

采用引物和lamp反应体系，温度为65℃下进行lamp扩增反应25min，lamp扩增反应结束后，取lamp反应产物8μl，加入到100μllfd分析缓冲液中得到混合溶液，将lfd试纸条插入所述的混合溶液中，等待1min，取出试纸条观察结果，如果lfd试纸条呈阳性，表示待测样品中含有硫酸盐还原菌；如果lfd试纸条呈阴性，表示待测样品中不含有硫酸盐还原菌；

所述的引物为上述的引物。

第三方面，本发明提供了一种检测硫酸盐还原菌的检测方法在喷气燃料真菌检测中的应用，所述的检测方法为上述的检测方法。

进一步的，取喷气燃料样品500ml经0.22μm滤膜抽滤，收集滤膜并用1ml10％的chelex-100溶液反复洗脱，洗脱液收集于1.5ml的离心管内，后将离心管放入金属浴中100℃恒温5min，然后将离心管放入－20℃冰箱5min，重复三次，最后离心管经12000r/min离心5min，吸取上清液至新的1.5ml离心管中，得到待测样品dna模板，用于检测。

本发明具有如下有益效果：

本发明建立了srb的lamp-lfd检测方法，运用该方法可快速判断喷气燃料是否被srb所污染。本发明的方法具有操作简便、检测时间短、灵敏度高、特异好等优点，且检测过程不需要复杂昂贵仪器，结果直观可视。本发明可检测判断喷气燃料是否被srb污染，对于保障喷气燃料质量以及飞机飞行安全具有重要意义。

附图说明

图1为本发明一实施例中lamp-lfd灵敏度图；

图2为本发明一实施例中lamp灵敏度图；

图3为本发明一实施例中pcr灵敏度图；

图4为本发明一实施例中pcr特异性检测结果图；

图5为本发明一实施例中lamp特异性检测结果图；

图6为本发明一实施例中lamp-lfd特异性结果图；

图7为本发明一实施例中硫酸盐还原菌lamp-lfd实地检测结果图。

图1～图3中(0-8)对应脱硫弧菌(desulfotomaculumruminis)dna浓度分别为121,12.1,and1.21ng/μland121,12.1,1.21pg/μland121,12.1,1.21fg/μl，nc为阴性对照。

图4～图6pcr、lamp及lamp-lfd方法检测硫酸盐还原菌特异性对比，m：dl2000dnamarker；nc：阴性对照；68：脱硫弧菌；70：脱硫肠状菌；1-8：枯草芽胞杆菌,类芽胞杆菌属,甲基杆菌属,泛菌属,金黄色葡萄球菌,大肠埃希氏菌,东北大学马赛菌,铜绿假单胞菌。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请进行进一步的介绍。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，在下述说明中，不同的“一实施例”或“实施例”指的不一定是同一实施例。不同实施例之间可以替换或者合并组合，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些实施例获得其他的实施方式。

环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是一种新颖的环介导等温扩增法，该方法具有性强、灵敏度该高、操作简单、不依赖专业设备，耗时短等优点，得到广泛应用。近年来lamp方法的可视化判定方法中应用较为成熟的为横向流动试纸条快速检测技术(lateralflowdipstick，lfd)，这种方法使得lamp方法的检测结果可以通过肉眼快速判定，非常适合现场检测。将等温扩增技术(lamp)与核酸横向流动试纸条检测技术(lfd)相结合，可以实现对喷气燃料中硫酸盐还原菌的现场快速检测。该方法具有测特异性高、时间短且灵敏度高等特点，操作简单无需大型仪器，适用于现场检测。

为打破过去检测方法的局限性，本发明致力于建立一个快速、简单、准确、针对性强、灵敏度高的方法来对喷气燃料中主要污染真菌进行检测。为达到这个目标，本发明将恒等温扩增技术(lamp)与核酸横向流动试纸条检测技术(lfd)相结合。lamp-lfd快速检测技术有是一种可以在恒温条件下高效扩增目的基因并实现了结果可视化的快速检测方法。其特点为检测特异性高、时间短且灵敏度高、操作简单无需大型仪器，因此适用于现场检测。

一种检测硫酸盐还原菌的引物，包括：外引物f3和b3，内引物fip和bip，两条环引物lb和lf；

所述的外引物f3序列如seqidno.1所示，所述的外引物b3序列如seqidno.2所示，所述的内引物fip序列如seqidno.3所示，所述的内引物bip序列如seqidno.4所示，所述的环引物lb序列如seqidno.5所示，所述的环引物lf序列如seqidno.6所示。

进一步的，内引物fip的5’端进行生物素标记，环引物lf的5’端进行异硫氰酸荧光素标记作为探针。

第二方面，本发明提供了一种硫酸盐还原菌检测方法，包括如下步骤：

以硫酸盐还原菌的基因组dna作为模板进行扩增，lamp反应体系引物浓度为：f3和b3各0.2μmol/l，fip和bip各1.6μmol/l，lf、lb各0.8μmol/l。lamp预混液为，20mmol/ltris-hcl(ph8.8)，10mmol/lkcl，8mmol/lmgso4，10mmol/l(nh4)2so4，0.1％吐温20，0.8mol/lbetaine，1.4mmol/ldntps，8u/μlbstdna聚合酶。

硫酸盐还原菌(chaetomiumglobosum)的lamp反应体系为：lamp预混液：10ml，fip：2.5ml，bip：2.5ml，lb：0.95ml，lf：0.95ml，f3：0.3ml，b3：0.3ml，待测样品dna模板：2ml；去离子水：0.5ml；

采用引物和lamp反应体系，温度为65℃下进行lamp扩增反应25min，lamp扩增反应结束后，取lamp反应产物8μl，加入到100μllfd分析缓冲液中得到混合溶液，将lfd试纸条插入所述的混合溶液中，等待1min，取出试纸条观察结果，如果lfd试纸条呈阳性，表示待测样品中含有硫酸盐还原菌；如果lfd试纸条呈阴性，表示待测样品中不含有硫酸盐还原菌；

所述的引物为上述的引物。

第三方面，本发明提供了一种检测硫酸盐还原菌的检测方法在喷气燃料真菌检测中的应用，所述的检测方法为上述的检测方法。

进一步的，取喷气燃料样品500ml经0.22μm滤膜抽滤，收集滤膜并用1ml10％的chelex-100溶液反复洗脱，洗脱液收集于1.5ml的离心管内，后将离心管放入金属浴中100℃恒温5min，然后将离心管放入－20℃冰箱5min，重复三次，最后离心管经12000r/min离心5min，吸取上清液至新的1.5ml离心管中，得到待测样品dna模板，嗯用于检测。

本发明使用的脱硫弧菌(desulfotomaculumruminis)、脱硫肠状菌(desulfovibriofructosivorans)、枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)、类芽胞杆菌属(paenibacillussp.)、甲基杆菌属(methylobacteriumsp.)、泛菌属(pantoeasp.)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、东北大学马赛菌(massilianeuensis)及铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)皆由中国工业微生物保藏管理中心(cicc)提供。以上菌种皆由沙保氏培养基培养，放置于摇床培养4天，温度25℃。沙保氏培养基的制备：4g葡萄糖、1g蛋白胨加入到100ml去离子水中，115℃高压灭菌20min，储存备用。lamp扩增试剂盒购自上海迪奥生物科技有限公司，lfd反应试剂购自德国mileniagenlinehybridetect公司。

实例1：引物设计与合成

根据硫酸盐还原菌dsrb基因序列设计一套特异性引物，包括外引物(f3、b3)、内引物(fip、bip)、一条环引物(lb、lf)共6条lamp引物，对fip5′进行生物素(biotin)标记，lf的5’端进行异硫氰酸荧光素(fitc)标记作为探针。引物序列如表1所示，

表1硫酸盐还原菌引物

按照表1中引物序列，在大连宝生物公司进行lamp引物合成。

实例2：硫酸盐还原菌扩增反应条件优化

以硫酸盐还原菌的脱硫弧菌(desulfotomaculumruminis)基因组dna作为模板进行扩增条件优化。lamp反应时配制引物浓度为：f3和b3各0.2μmol/l，fip和bip各1.6μmol/l，lf、lb各0.8μmol/l。lamp预混液为，20mmol/ltris-hcl(ph8.8)，10mmol/lkcl，8mmol/lmgso4，10mmol/l(nh4)2so4，0.1％吐温20，0.8mol/lbetaine，1.4mmol/ldntps，8u/μlbstdna聚合酶。硫酸盐还原菌的lamp反应体系见表2。

表2硫酸盐还原菌的lamp反应体系

为获取最佳lamp扩增效率，并综合考虑lfd适用条件，应用本发明提供的引物和lamp反应体系，分别在三种不同温度(61℃、63℃、65℃)下进行lamp扩增反应，通过实时浊度仪对扩增反应进行实时监控，确定最佳反应温度和时间。通过该实验，最终确定最佳实验温度为65℃，时间为25min。

lamp扩增反应结束后，取取lamp反应产物8μl，加入到100μllfd分析缓冲液中，将lfd试纸条插入混合溶液中，等待1min，取出试纸条观察试验结果。如果lfd试纸条呈阳性，表示待测样品中含有硫酸盐还原菌；如果lfd试纸条呈阴性，表示待测样品中不含有硫酸盐还原菌。

实例3用本发明的lamp-lfd技术对硫酸盐还原菌的检测灵敏度进行分析。

1.以提取得到的脱硫弧菌(desulfotomaculumruminis)dna为模板，按照10倍等梯度稀释至10^-8梯度(浓度依次为121,12.1,1.21ng/μl,121,12.1,1.21pg/μl,121,12.1,1.21fg/μl)。分别以不同稀释度的dna作为pcr、lamp以及lamp-lfd反应模板。

2.用lamp-lfd、lamp和pcr方法对硫酸盐还原菌进行检测，比较三种方法的灵敏度。

2.1用上述经过梯度稀释的脱硫弧菌(desulfotomaculumruminis)dna作为lamp反应的模板进行扩增，按照实例1中的引物和实例2中反应体系和温度、时间，用本发明提供的lfd方法分析lamp反应产物，结果见图1。

2.2将上述梯度稀释的脱硫弧菌(desulfotomaculumruminis)dna作为lamp反应的模板进行扩增，按照实例1中的引物和实例2中反应体系和温度、时间，结果用浊度仪显示，结果见图2。

2.3将上述梯度稀释的脱硫弧菌(desulfotomaculumruminis)dna作为pcr反应的模板，以f3、b3为引物进行pcr扩增。反应体系为takaraextaq预混液25μl，正向引物1μl，反向引物1μl，dna模板2μl，超纯水21μl。硫酸盐还原菌扩增条件为94℃预变性8min；95℃变性40s,53℃退火40s，72℃延伸90s，35个循环延伸；72℃延伸10min。扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳分析，结果见图3.

3.实验结果为，pcr扩增结果经1％的琼脂糖凝胶电泳检测分析后表明，其检测限为10^-4，即12.1pg/μl。lamp扩增通过荧光仪实时扩增曲线分析表明，其检测限为10^-5，即1.21pg/μl。lamp-lfd经试纸条检测结果表明检测限为10^-6，即为121fg/μl。因此，lamp-lfd方法检测硫酸盐还原菌的灵敏度是lamp方法的10倍，是pcr方法的100倍。

实例4用本发明的lamp-lfd技术对硫酸盐还原菌的特异性进行测定。

取两种常见的硫酸盐还原菌脱硫弧菌(desulfotomaculumruminis)、脱硫肠状菌(desulfovibriofructosivorans)及其他常见喷气燃料污染细菌枯草芽胞杆菌(bacillussubtilis)、类芽胞杆菌属(paenibacillussp.)、甲基杆菌属(methylobacteriumsp.)、泛菌属(pantoeasp.)、金黄色葡萄球菌(staphylococcusaureus)、大肠埃希氏菌(escherichiacoli)、东北大学马赛菌(massilianeuensis)及铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)为lamp-lfd特异性试验菌，其中超纯水为阴性对照。按照实例2中的反应条件分别进行pcr、lamp和lamp-lfd检测，考察3种方法的特异性，结果如图4～图6所示。

由图4～图6可知，3种方法均可检测脱硫弧菌及脱硫肠状菌这两种硫酸盐还原菌，但pcr方法对泛菌属和大肠埃希氏菌产生了非特异性扩增，而lamp及lamp-lfd方法没有出现非特异性扩增现象，证明lamp及lamp-lfd检测方法的特异性优于pcr方法，且可以用于喷气燃料中硫酸盐还原菌的特异性检测。

实例5验证本发明的有效性

为了验证建立的硫酸盐还原菌lamp-lfd快速检测方法的有效性，平行取喷气燃料样品共计11份每份100ml，将0.5ml硫酸盐还原菌菌液加入到9号、10号喷气燃料样品中作阳性样品，1份喷气燃料中加入0.5ml无菌培养基作为阴性对照，震荡混匀待测。采用lamp-lfd方法检测，比对检测结果与最初添加菌液的情况是否一致。

取喷气燃料样品500ml经0.22μm滤膜抽滤，收集滤膜并用1ml10％的chelex-100溶液反复洗脱，洗脱液收集于1.5ml的离心管内，后将离心管放入金属浴中100℃恒温5min，然后将离心管放入－20℃冰箱5min，重复三次，最后离心管经12000r/min离心5min，吸取上清液至新的1.5ml离心管中，得到dna模板。用已设计好的lamp-lfd方法检测喷气燃料中是否存在硫酸盐还原菌。

lamp-lfd检测结果如图7所示。由图可知阴性对照无扩增且出现质控线，证明检测有效。仅9、10号样品的检测结果为阳性，其它均为阴性，与人工污染的结果一致，说明lamp-lfd方法可以用于硫酸盐还原菌的实地检测。

应当说明的是，上述实施例均可根据需要自由组合。以上介绍仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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<110>中国人民解放军陆军勤务学院

<120>检测喷气燃料中硫酸盐还原菌引物、应用及检测方法

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