一种用特异性PCR引物检测双季槐槐米的方法与流程

本发明涉及植物分子生物学检测技术，具体属于一种用特异性引物pcr检测双季槐槐米的方法。

背景技术：

槐树(sophorajaponical.)，又名国槐、中国槐等，为豆科槐属的多年生落叶乔木，是一种集药用、食用、材用、观赏于一体的优良树种。米槐，是以国槐砧木嫁接的专用于生产槐米的经济作物，具有国槐的生态学特性，喜光、抗旱、耐瘠薄，对土壤要求不严格，适宜在丘陵山地、沟边地、旱坡地栽植。槐米为米槐的花蕾，是我国常用大宗出口中药材之一，具有凉血止血、清肝泻火的功效，主治便血、痔血、血痢、崩漏、吐血、衄血、肝热目赤、头痛眩晕等，具有凝血止血，抗炎，解痉、抗溃疡，强心、扩张冠脉、降压、调血脂等药理作用，临床常用于治疗高血压、冠心病、防治脑溢血及吐血、风热目赤等疾病。槐米在医疗、保健、化工等方面均有重要用途，但多年来，米槐的种植一直没有形成规模产业，导致槐米的采收总量一直不高。经调研发现，目前国际市场上90％的槐米产自中国，而国内药企对槐米的年需求量则为8000吨左右，导致槐米供不应求，因此以槐米作为研究对象具有重要意义。双季槐作为近年来研发的新品种米槐，其主要特点是有两季结米期，大大提高了槐米产量，但其质量优劣还未知，因此，建立一种双季槐槐米的鉴别方法，以区分单、双季槐米，为后续单、双季槐的槐米中有效成分的分析和质量控制奠定基础，很有必要。

核糖体基因内部转录间隔区(its)序列存在于高度重复的核糖体中，进化速度快且长度不大，加上协同进化，使该片段在基因组不同单元间十分一致，因而适合进行各种分子操作。由于该区域受外界环境因素的影响较小，进化速度快，因而具有种内变异小而种间变异大的特点，是种类鉴定和系统发育分析的重要分子标记，可用于生物分类、系统发育和遗传多样性的研究。

本发明依据分子标记技术原理和原则，设计出两对双季槐槐米特异性pcr鉴别引物，并建立了一种特异性区分双季槐槐米的分子鉴别方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测双季槐槐米的特异性pcr引物，以及用该特异性pcr引物快速、准确地检测双季槐槐米的方法。

为实现上述目的，本发明提供的一种用于检测双季槐槐米的特异性pcr引物对，所述的特异性引物对是如下(1)和(2)引物对中的任意一对：

(1)上游引物f1：5＇gcaatgcgagcactgctt3＇

下游引物r1：5＇tcgttccccgtgggggcga3＇

(2)上游引物f2：5＇gcaatgcgagcactgctt3＇

下游引物r2：5＇cgggtgcgggactagtct3＇

本发明提供的一种用特异性pcr引物检测双季槐槐米的方法，包括以下步骤：

1)提取槐米样品中的dna；

2)以步骤1)中提取的dna为模板，使用上述引物中的任意一对进行pcr扩增反应；

3)对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，根据电泳检测结果判定样品是否为双季槐槐米；

其中，pcr扩增反应体系以25μl计为：

所述的引物对的pcr反应条件：

第(1)或第(2)对引物对的pcr反应条件均为：93℃5min；93℃30s，65℃30s；72℃30s，共30个循环；72℃5min，10℃10min。

pcr扩增反应结束后，若电泳检测结果出现约720bp左右的单一dna条带，则该样品为双季槐槐米。

本发明的有益效果：本发明基于双季槐槐米的its序列，设计出可快速检测双季槐槐米的特异性引物，并在此基础上建立pcr检测体系，为双季槐槐米的鉴别提供了分子鉴定依据。根据该特异性引物建立的检测方法具有操作简便、特异性好、灵敏度高等优点，可实现对双季槐槐米的准确检测。

附图说明

图1是利用两对双季槐槐米特异性引物，分别对山西运城盐湖区羊爻沟双季槐槐米和单季槐槐米经pcr扩增后，pcr产物的琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本方法，但不用来限制本发明的范围。

若未特别指明，以下实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(newyork：goldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的操作技术规程，或按照制造厂商所建议的实验条件；所用原料均为市售商品。

实施例1

用于检测双季槐槐米的pcr引物的合成

从genbank中共获得双季槐槐米its序列两条，同时对所有双季槐槐米和单季槐槐米样品进行测序，利用生物学软件dnastar比对上述序列，找出双季槐槐米所区别于其他种的变异位点。根据变异位点的位置，在its序列的上下游设计约20个碱基的引物；利用生物学软件primer5.0对设计的引物进行分析，最终确定双季槐槐米合适的引物对分别为：

(1)上游引物f1：5＇gcaatgcgagcactgctt3＇(seqidno.1)

下游引物r1：5＇tcgttccccgtgggggcga3＇(seqidno.2)

(2)上游引物f2：5＇gcaatgcgagcactgctt3＇(seqidno.3)

下游引物r2：5＇cgggtgcgggactagtct3＇(seqidno.4)

引物合成由上海桑尼生物科技有限公司完成。

实施例2

利用pcr引物检测双季槐槐米的特异性和灵敏度分析

1.1样品来源

本实施例中采用的药材样品包括有：双季槐槐米、单季槐槐米，采自山西省运城市盐湖区茂端双季槐种植专业合作社。

1.2dna提取

将上述样品，每个样品取约60mg，用液氮研磨成粉末，利用试剂盒法提取dna。试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司，型号为：ctab植物基因组dna快速提取试剂盒(货号：dn14)，50次。

检测上述提取的槐米dna的浓度，于-20℃保存备用。

1.3pcr反应

反应体系(25μl)

pcr反应条件为：93℃5min；93℃30s，69℃30s；72℃30s，共30个循环；72℃5min，10℃10min。

1.4结果

取扩增产物5μl，在1.2％琼脂糖凝胶上进行电泳，电压为138v，23min后在zf-258全自动凝胶成像分析系统检测电泳结果，如果双季槐槐米特异性引物能在720bp左右扩增出单一的dna条带，则证明所检样品为双季槐槐米，电泳检测结果如图1所示，其中，1和3的dna模板为双季槐槐米，2和4的dna模板为单季槐槐米，产物条带为720bp；m为dl2000dnamarker。上述结果表明实施例1中设计的引物特异性强。

虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>山西大学

<120>一种用特异性pcr引物检测双季槐槐米的方法

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>中国槐(sophorajaponical)

<400>1

gcaatgcgagcactgctt18

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>中国槐(sophorajaponical)

<400>2

tcgttccccgtgggggcga19

<210>3

<211>18

<212>dna

<213>中国槐(sophorajaponical)

<400>3

gcaatgcgagcactgctt18

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>中国槐(sophorajaponical)

<400>4

cgggtgcgggactagtct18