一种肿瘤lncRNA标志物及其应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及与一种肿瘤lncrna标志物及其应用。

背景技术：

肝细胞肝癌是癌症相关死亡的第三大主要原因和世界范围内肝硬化患者死亡的主要原因之一。与其他大多数恶性肿瘤不同，在过去的20年内肝癌的死亡率仍呈现不断上升的趋势，同时流行病学的统计结果也表明在未来几十年全球尤其是西方国家，用于肝癌治疗的医疗和经济负担仍在显著增加。肝细胞肝癌大多发生在肝硬化晚期，其中约有70％的肝癌病例与乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒的感染有关。此外过度饮酒或其他代谢功能的紊乱也是肝癌发病率不断升高的原因之一。

多种关键基因的突变或表观遗传学改变导致肝细胞的恶性转变最终形成肿瘤。尽管肝癌的诊断与治疗己经取得了很大的进展，但是由于肝癌基因组改变的复杂性与多样性，肝癌的治疗效果仍不容乐观。近些年随着肝癌分子机制研究的不断深入基于一些关键靶点如p53,egfr,vefgr等蛋白的的靶向分子药物不断被开发出来并取得了一定的进展。

lncrna是一组长度大于200个核苷酸、缺少完整的开放阅读框和无蛋白质编码功能的rna。过去，1ncrna被认为是转录的“噪音”或体内的“垃圾”，但近来的研究发现并非如此，众多1ncrna被证实具有各种不同的生物学功能。越来越多的证据表明lncrna可在遗传水平、转录水平和转录后水平调控同源基因及非同源基因的表达，参与肿瘤发生、发展的病理过程，如hotair(hoxantisenseintergenicrna)作为作为体内一种关键的1ncrna已证实参与在肝癌、乳腺癌以及肺癌等多种肿瘤的发生发展。同时，已有一些研究表明单个lncrna的表达情况能够为肿瘤诊断、治疗和预后提供帮助。寻找与肝癌发生发展相关的lncrna标志物，对于揭示肝癌的发病机制，以及实现临床肝癌的分子诊断和治疗具有重要的意义。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种与肝细胞癌发生发展相关的分子标志物，所述标志物可以作为肝细胞癌的特异性诊断标志物，应用于肝细胞癌的早期发现；同时所述标志物可以作为肝细胞癌的特异性分子靶标，应用于肝细胞癌的个性化治疗。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了检测ac141928.1的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。

进一步，所述产品包括通过测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术检测样本中ac141928.1的表达水平的试剂。所述核酸扩增技术包括聚合酶链式反应、逆转录聚合酶链式反应、转录介导的扩增、连接酶链式反应、链置换扩增和基于核酸序列的扩增。

进一步，所述试剂选自：特异性识别ac141928.1的探针；或特异性扩增ac141928.1的引物。

进一步，所述特异性扩增ac141928.1的引物序列如seqidno.2～3所示。

本发明提供了一种体外检测ac141928.1表达水平来诊断肝癌的产品，所述产品包括芯片、试剂盒、核酸膜条。

进一步，所述芯片包括特异性识别ac141928.1的寡核苷酸探针；所述试剂盒包括特异性扩增ac141928.1的引物，或特异性识别ac141928.1的寡核苷酸探针；所述核酸膜条包括特异性识别ac141928.1的寡核苷酸探针。

进一步，所述特异性扩增ac141928.1的引物序列如seqidno.2～3所示。

进一步，所述试剂盒还包括选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

本发明提供了ac141928.1在制备治疗肝癌/肝癌侵袭/肝癌转移的药物组合物中的应用。

进一步，所述药物组合物包括特异性抑制ac141928.1的试剂。

进一步，所述试剂选自核酸分子、碳水化合物、小分子化合物或干扰慢病毒。

进一步，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、双链rna、小干扰rna或短发夹rna。

进一步，所述核酸分子选自小干扰rna。在本发明的具体实施方式中，所述小干扰rna的序列如seqidno.6～7所示。

本发明提供了一种治疗肝癌/肝癌侵袭/肝癌转移的药物组合物，所述药物组合物包括特异性抑制ac141928.1的试剂。

进一步，所述试剂选自核酸分子、碳水化合物、小分子化合物或干扰慢病毒。

进一步，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、双链rna、小干扰rna或短发夹rna。

进一步，所述核酸分子选自小干扰rna。在本发明的具体实施方式中，所述小干扰rna的序列如seqidno.6～7所示。

本发明提供了ac141928.1在构建预测肝细胞癌的计算模型或筛选治疗肝癌的候选药物中的应用。

附图说明

图1是利用qpcr检测ac141928.1基因在肝细胞癌组织中的表达情况图。

图2是ac141928.1对肝癌细胞增殖的影响图。

具体的实施方式

本发明的发明人经过大量实验和反复研究，发现ac141928.1在肝癌组织中表达显著上调，为了探讨ac141928.1与肝癌的发生发展之间的相关性，通过下调ac141928.1基因表达来检测该基因对肝癌细胞的功能性影响，进而发现ac141928.1可以影响肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

ac141928.1基因位于4号染色体上，包括ac141928.1基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的ac141928.1，以及源自细胞中加工的任何形式的ac141928.1。该术语涵盖ac141928.1的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的ac141928.1的序列如enst00000511928.1(序列如seqidno.1)所示。

本领域技术人员应当理解，测定基因表达的手段不是本发明的重要方面。可以在转录水平上检测生物标志物的表达水平。本发明可以利用本领域内已知的任何方法测定基因表达。

检测技术

本发明的lncrna使用本领域普通技术人员已知的多种核酸技术进行检测，这些技术包括但不限于：核酸测序、核酸杂交和核酸扩增技术。

核酸测序技术的示例性非限制性实例包括但不限于链终止子(sanger)测序和染料终止子测序。本领域的普通技术人员将认识到，由于rna在细胞中不太稳定并且在实验中更易受到核酸酶攻击，因此在测序前通常将rna逆转录成dna。

核酸测序技术的另一示例性非限制性实例包括下一代测序(深度测序/高通量测序)，高通量测序技术是一种基于单分子簇的边合成边测序技术，基于专有的可逆终止化学反应原理。测序时将基因组的dna的随机片段附着到光学透明的玻璃表面，这些dna片段经过延伸和桥式扩增后，在玻璃表面形成数以亿计的簇，每个簇是具有数千份相同模板的单分子簇，然后利用带荧光基团的四种特殊脱氧核糖核苷酸，通过可逆性的边合成边测序技术对待测的模板dna进行测序。

核酸杂交技术的示例性非限制性实例包括但不限于原位杂交(ish)、微阵列和southern或northern印迹。原位杂交(ish)是一种使用标记的互补dna或rna链作为探针以定位组织一部分或切片(原位)或者如果组织足够小则为整个组织(全组织包埋ish)中的特异性dna或rna序列的杂交。dnaish可用于确定染色体的结构。rnaish用于测量和定位组织切片或全组织包埋内的mrna和其他转录本(例如，ncrna)。通常对样本细胞和组织进行处理以原位固定靶转录本，并增加探针的进入。探针在高温下与靶序列杂交，然后将多余的探针洗掉。分别使用放射自显影、荧光显微术或免疫组织化学，对组织中用放射、荧光或抗原标记的碱基标记的探针进行定位和定量。ish也可使用两种或更多种通过放射性或其他非放射性标记物标记的探针，以同时检测两种或更多种转录本。

将southern和northern印迹分别用于检测特异性dna或rna序列。使从样本中提取的dna或rna断裂，在基质凝胶上通过电泳分离，然后转移到膜滤器上。使滤器结合的dna或rna与和所关注的序列互补的标记探针杂交。检测结合到滤器的杂交探针。该程序的一种变化形式是反向northern印迹，其中固定到膜的底物核酸为分离的dna片段的集合，而探针是从组织提取并进行了标记的rna。

本发明可在检测前或同时地对核酸(例如，ncrna)进行扩增。核酸扩增技术的示例性非限制性实例包括但不限于：聚合酶链式反应(pcr)、逆转录聚合酶链式反应(rt-pcr)、转录介导的扩增(tma)、连接酶链式反应(lcr)、链置换扩增(sda)和基于核酸序列的扩增(nasba)。本领域的普通技术人员将认识到，某些扩增技术(例如，pcr)需要在扩增前将rna逆转录成dna(例如，rt-pcr)，而其他扩增技术则直接扩增rna(例如，tma和nasba)。

通常称为pcr的聚合酶链式反应使用变性、引物对与相反链的退火以及引物延伸的多个循环，以指数方式增加靶核酸序列的拷贝数；tma的转录介导的扩增(在基本上恒定的温度、离子强度和ph的条件下自身催化地合成靶核酸序列的多个拷贝，其中靶序列的多个rna拷贝自身催化地生成另外的拷贝；lcr的连接酶链式反应使用与靶核酸的相邻区域杂交的两组互补dna寡核苷酸；其他扩增方法包括例如：通常称为nasba的基于核酸序列的扩增；使用rna复制酶(通常称为qβ复制酶)扩增探针分子本身的扩增；基于转录的扩增方法；以及自我维持的序列扩增。

本发明中非扩增或扩增的核酸可通过任何常规的手段检测。

芯片、核酸膜条、试剂盒

本发明提供了检测中ac141928.1基因的表达水平的产品，所述产品包括(但不限于)芯片、核酸膜条或试剂盒。其中芯片包括：固相载体；以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于ac141928.1所示的部分或全部序列。

所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。

本发明提供了核酸膜条包括基底和固定于所述基底上的针对ac141928.1的寡核苷酸探针；所述基底可以是任何适于固定寡核苷酸探针的基底，例如尼龙膜、硝酸纤维素膜、聚丙烯膜、玻璃片、硅胶晶片、微缩磁珠等

本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒可用于检测ac141928.1的表达。优选的，所述的试剂盒中还含有用于标记rna样品的标记物，以及与所述标记物相对应的底物。此外，所述的试剂盒中还可包括用于提取rna、pcr、杂交、显色等所需的各种试剂，包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、酶、对照液、显色液、洗液等。此外，所述的试剂盒中还包括使用说明书和/或芯片图像分析软件。所述产品还含有说明书，所述说明书记载了该产品的用途以及使用方法，所述用途选自以下任一种：1)评估肝癌的患病风险；2)肝癌的诊断；所述使用方法包括利用核酸测序、扩增或者杂交技术检测ac141928.1的核酸的步骤。

药物组合物

基于本发明人的发现，本发明提供了ac141928.1在制备治疗肝细胞癌的药物组合物中的应用，所述药物组合物包括特异性抑制ac141928.1的试剂。所述试剂包括但不限于核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药或干扰慢病毒。

作为本发明的一种优选的实施方案，所述核酸分子包括但不限于:反义寡核苷酸、双链rna(dsrna)、小干扰rna(sirna)或者短发夹rna(shrna)。

优选地，所述小干扰rna(sirna)包含第一链和第二链，所述第一链和第二链互补共同形成rna二聚体。

本发明所述的小干扰rna可以是化学合成的双链rna；也可以是载体或表达框架表达的双链rna，所述载体或表达框架中可采用例如rna聚合酶iii启动子和rna聚合酶iii终止子调控小干扰rna在哺乳动物细胞中的表达，rna聚合酶iii启动子包括人源或鼠源的u6启动子和人h1启动子等。

本发明所述的小干扰rna可以是由作用于一个靶序列的单一小干扰rna组成，也可以由作用于一个基因的多个靶序列或多个基因上的靶序列的多个小干扰rna组成；所述的靶序列可以是ac141928.1基因的基因组序列，或ac141928.1基因的cdna序列。具体地，本发明所述的小干扰rna可以由序列表中的至少一个序列组成。

优选地，所述短发夹rna(shrna)包含正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和反义链片段的序列互补。作为一种可选择的实施方式，所述shrna的茎环结构的序列可选自以下任一种序列：uucaagaga、aug、ccc、uucg、ccacc、cucgag、aagcuu和ccacacc。

在制备本发明的药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。

所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。

本发明提供了ac141928.1在制备预测肝细胞癌的计算模型中的应用。正如熟练技术人员可以领会的，可以使用两种或更多种标志物的测量来改进调查中的诊断问题。生化标志物可以个别测定，或者在本发明的一个实施方案中，它们可以同时测定，例如使用芯片或基于珠的阵列技术。然后独立解读生物标志物的浓度，例如使用每种标志物的个别截留，或者它们组合进行解读。

在本发明中，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合基因和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

优选地，在标志物组合中应用的数学算法是一种对数函数。优选地，应用此类数学算法或此类对数函数的结果是单一值。根据根本的诊断问题，能容易地将此类值与例如个体关于肝细胞癌的风险或与有助于评估肝细胞癌松患者的其它有意诊断用途关联起来。以一种优选的方式，此类对数函数是如下获得的：a)将个体分类入组，例如正常人、有肝细胞癌风险的个体、具有肝细胞癌的患者等等，b)通过单变量分析来鉴定在这些组之间差异显著的标志物，c)对数回归分析以评估标志物的可用于评估这些不同组的独立差别值，并d)构建对数函数来组合独立差别值。在这种类型的分析中，标志物不再是独立的，而是代表一个标志物组合。

用于将标志物组合与疾病关联起来的对数函数优选采用通过应用统计方法开发和获得的算法。例如，适宜的统计方法是判别分析(da)(即线性、二次、规则da)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推/装袋方法)、广义线性模型(即对数回归)、基于主分量的方法(即simca)、广义叠加模型、基于模糊逻辑的方法、基于神经网络和遗传算法的方法。熟练技术人员在选择适宜的统计方法来评估本发明的标志物组合并由此获得适宜的数学算法方面不会有问题。在一个实施方案中，用于获得评估肝细胞癌中使用的数学算法的统计方法选自da(即线性、二次、规则判别分析)、kernel方法(即svm)、非参数方法(即k-最近邻居分类器)、pls(部分最小二乘)、基于树的方法(即逻辑回归、cart、随机森林方法、助推方法)、或广义线性模型(即对数回归)。

本发明提供了ac141928.1在筛选治疗肝癌的候选药物中的应用，其中，若待筛选物质可以特异性降低ac141928.1的水平，则待筛选物质为治疗肝癌的候选药物。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1检测ac141928.1在肝细胞癌中的表达情况

1、样品收集

分别收集27例原发性肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本(距离肿瘤边缘≥5cm的肝组织)，配对的癌组织经病理证实为肝细胞癌。标本于手术后内用大量生理盐水清洗干净后立即分装，经液氮冷冻后放入-80℃冰箱冻存。

2、rna样品的制备及质量分析

使用trizol法提取组织总rna

1)用剪刀组织剪碎，加入1mltrizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测rna浓度，鉴定rna的产量和纯度。

3、qpcr检测

1)引物设计

根据ac141928.1和gadph的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

ac141928.1基因：

正向引物为5’-cctctggagaaagaactg-3’(seqidno.2)；

反向引物为5’-ctggtgctcaataagaca-3’(seqidno.3)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.4)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.5)。

2)逆转录反应

采用fastqμantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行lncrna反转录，首先去除基因组dna反应，在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

3)qpcr扩增检验

用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×superrealpremixplus10μl，正反向引物(10μm)各0.6μl，5×roxreferencedye^△2μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环。

4)cdna模板浓度的筛选

将各样本cdna混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cdna的进行10倍稀释时，pcr的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品realtimepcr检测

将各样品cdna10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量。

4、结果

qpcr结果如图1所示，与癌旁组织相比，ac141928.1在肝细胞癌组织中表达上调，差异具有统计学意义(p<0.05)。

具体表达情况如表1所示，呈现ac141928.1显著上调的样本有24例，其中癌组织样本有21例，癌旁组织样本有3例。说明ac141928.1应用于肝细胞癌的诊断具有较高的特异性和敏感性。

表1基因在疾病中的阳性情况表

实施例2ac141928.1的功能验证

1、细胞培养

人肝癌细胞系hepg2购于上海细胞库，细胞系均以含10％胎牛血清和1％p/s的培养基dmem在37℃、5％co2的培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，隔天换液。

2、转染

2.1sirna的合成

由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对ac141928.1的干扰sirna-ac141928.1，对照为通用的sirna-nc。其中，干扰sirna-ac141928.1的序列如下所示：

正义链为5’-ugcauauguauauaugcaccu-3’(seqidno.6)；

反义链为5’-gugcauauauacauaugcacu-3’(seqidno.7)。

2.2转染

将实验分为3组，分别为对照组(hepg2)、阴性对照组(sirna-nc)和实验组(sirna-ac141928.1)。按照invitrogen公司的lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染。具体步骤如下：

1)将肝癌细胞系hepg2加入含10％胎牛血清的dmem培养基并置于37℃、5％co2的培养箱中培养。当细胞生长融合至80-90％的时，用pbs清洗3遍以去除细胞瓶中的血清成分，然后加入1-2ml的含0.25％的胰酶0.02％edta的消化液，当细胞变为单个细胞时加入1ml的完全培养基终止消化。

2)将细胞转移至离心管内，放入常温离心机，1000g/min离心5min收集细胞沉淀，用完全培养基将细胞重悬为1×10⁵/ml，吸取500μl接种于24孔板内，放入37℃、5％co2的培养箱中培养过夜。

3)在opti-mem培养液中加入lipofectamine2000，室温孵育5min。

4)在opti-mem培养液中加入sirna混合均匀。

5)将稀释好的3)和4)混合均匀，室温放置20min。

6)将混合液加入到无血清培养基培养细胞的24孔板中，轻轻晃动混匀，放入37℃、5％co2的培养箱中培养6h后将细胞培养液更换为新鲜的完全培养基继续培养。

3、qpcr检测细胞中ac141928.1的表达水平

各组细胞转染培养48h后，使用trizol法提取细胞总rna，按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量pcr检测。

4、cck-8法检测细胞增殖能力

1)各组细胞转染后24h，用pbs清洗3次去除细胞内的血清成分，然后用胰蛋白酶将细胞充分消化，1000rpm离心5min收集细胞，弃去上清液并用1ml含10％胎牛血清的dmem培养基重悬，细胞计数板对细胞进行计数。

2)用含有10％胎牛血清的dmem培养基将细胞稀释至1×10⁴/ml，然后向96孔板的每孔加入200μl细胞(每种细胞接种5个复孔)。

3)在96孔板四周未铺细胞的其他孔中加入200μl的pbs。

4)将接种好肿瘤细胞的96孔板放至37℃、5％co2的细胞培养箱内培养72h后加入10μlcck-8，放入培养箱内孵育1h。

5)将培养板取出，用酶标仪测量450nm波长的吸光度。

5、细胞迁移实验

1)各组细胞转染后24h，用pbs清洗3次去除细胞内的血清成分，然后用胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管内，然后放入室温离心机内，1000rpm离心5min收集细胞。弃去上清然后用1ml不含胎牛血清的dmem培养基重悬细胞，用细胞计数板对细胞进行计数。用不含胎牛血清的dmem培养基将细胞稀释至1×10⁶/ml，吸取1×10⁵个细胞滴加入transwell小室的上室。

2)向transwell小室的下室加入600μl含10％血清的完全培养基，然后将上室放入孔板内，置于37℃、5％co2的细胞培养箱内培养24h。

3)取出小室，轻轻弃去小室内的培养基，用pbs清洗2遍后放入75％的乙醇固定液中中固定15min。

4)用棉签将transwell上室内细胞轻轻擦去，然后将小室置于结晶紫中染色15min。

5)取出小室，用pbs清洗3-5次去除多余细胞染液，然后在显微镜下进行观察。

6、细胞侵袭实验

将基质胶用无血清培养基1:20稀释，取100μl铺于小室内，4℃孵育过夜。剩余步骤同细胞迁移实验。

7、统计学分析

所有数据均为三次独立实验获得，按照mean士sd显示。组间差异使用配对样本t检验分析，p<0.05时表示差异具有统计学差异。

8、结果

1)转染结果显示，以ac141928.1在对照组中(hepg2)的表达量作为基准定为1，转染结果显示，相比对照组，实验组在转染sirna-ac141928.1后，ac141928.1的表达水平(0.2067±0.04509)显著下调(对照组vs实验组，p值＝0.0011，**)，而转染sirna-nc的阴性对照中的ac141928.1的表达水平(0.947±0.05132)则无显著变化(对照组vs阴性对照组，p值＝0.2136，ns)

2)细胞增殖实验结果如图2所示，相比阴性对照组的细胞增殖活性，实验组的细胞增殖活性显著降低(阴性对照组vs实验组，p＜0.0001，***)，说明ac141928.1影响肝癌细胞的增殖，提示ac141928.1可作为分子靶标应用于肝癌的治疗。

3)细胞迁移实验结果显示，相比阴性对照组的细胞穿膜数(167.3±11.5)，实验组的细胞穿膜数显著降低(88.33±9.452)，差异具有统计学意义(阴性对照组vs实验组，p＝0.0221，*)，说明改变ac141928.1的表达水平可以改变细胞的迁移能力，提示ac141928.1可应用于肝癌转移的治疗。

4)细胞侵袭实验结果显示，相比相比阴性对照组的细胞穿膜数(125.3±9.609)，实验组的细胞穿膜数显著降低(75±6)，差异具有统计学意义(阴性对照组vs实验组，p＝0.0304，*)，说明改变ac141928.1的表达水平可以改变细胞的侵袭能力，提示ac141928.1可应用于肝癌浸润的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>山东第一医科大学（山东省医学科学院）

山东第一医科大学第二附属医院

<120>一种肿瘤lncrna标志物及其应用

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<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>4525

<212>dna

<213>homosapiens

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