环状RNAhsa_circ_0006687及其应用的制作方法

【技术领域】

本发明涉及hbbart’s胎儿水肿综合征诊断或检测技术领域，特别涉及一种环状rna及其在辅助诊断或检测hbbart’s胎儿水肿综合征的应用。

背景技术：

地中海贫血，简称地贫，是一种因珠蛋白基因缺陷使得珠蛋白肽链合成减少或不能合成，从而导致溶血性贫血的遗传性疾病。以贫血、黄疸、肝脾肿大、特殊外貌为临床特点。地中海贫血是全球最大的单基因病之一，携带率超过5％。我国长江以南各省发病率较高。其中又以广西壮族自治区发病率最高，人群中地中海贫血基因携带率为24.5％，α-地贫和β-地贫分别为17.55％、6.43％。重型α地贫，又称hbbart’s胎儿水肿综合征(hbbart'shydropsfetalissyndrome，bhfs)，常常引起胎死宫内或新生儿死亡，也可引起危及母体生命的镜像综合征，给许多家庭和社会带来痛苦及负担。因此，开展地中海贫血的相关研究对于地中海贫血的防治，减少出生缺陷，提高人口素质意义重大。

circrna是具有共价闭合环状结构的内源性非编码rna家族，由反向剪接事件产生，广泛存在于哺乳动物细胞中。目前认为其生物学功能主要有mirna海绵、吸附rna结合蛋白、竞争性剪接、翻译模板等，与包括肿瘤在内的多种疾病相关。因其生物学功能和稳定性被研究者们认为是重要的生物标志物与疾病的治疗靶点，并且在其他疾病中已经有报道及应用。但目前在地中海贫血中还没有circrna相关报道及应用。目前α地贫相关标志物研究较少，对于地中海贫血的基因诊断、产前诊断方法也无法解决临床上a地贫同基因型患者表型异质性的问题。

技术实现要素：

鉴于上述内容，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处，提供一种新的hbbart’s胎儿水肿综合征的辅助诊断指标以及相应的诊断试剂盒。

为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种环状rna，所述环状rna为hsa_circ_0006687的环状rna，其序列为seqidno.1。

本发明还提供了一种检测或辅助检测hbbart’s胎儿水肿综合征的试剂，其包括权利要求1所述的hsa_circ_0006687环状rna。

另一方面，本发明还提供了一种检测或辅助检测hbbart’s胎儿水肿综合征的试剂盒，其包括权利要求1所述的环状rna和/或权利要求2所述试剂。

再另一方面，本发明还提供了一种诊断或辅助诊断hbbart’s胎儿水肿综合征的试剂盒，所述试剂包括扩增环状rna的引物。

本发明所述引物包括由如seqidno.2何seqidno.3所述的碱基序列组成的引物对。

优选的，所述的环状rna作为hbbart’s胎儿水肿综合征诊断或辅助诊断、治疗靶点、预后评估的应用。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明建立了hbbart’s胎儿水肿综合征(hbbart'shydropsfetalissyndrome，bhfs)胎盘组织环状rna生物标志物的筛选方法和表达谱，并发现bhfs胎盘组织中环状rna存在异常表达，揭示了胎盘组织环状rna对hbbart’s胎儿水肿综合征(hbbart'shydropsfetalissyndrome，bhfs)潜在的检测的价值。其中，hsa_circ_0006687在hbbart’s胎儿水肿综合征(hbbart'shydropsfetalissyndrome，bhfs)胎盘组织中表达上调，是bhfs征性的环状rna分子，有辅助诊断、表型预测及治疗手段研发的价值及重要的学术意义。

2、hbbart’s胎儿水肿综合征相关的环状rna可以作为胎盘样本检测a地贫及其表型预测的生物志物，应用于产前诊断及无创胎儿产前检测中。发明人还以环状rna生物标志物为目标设计了相应实时荧光定量pcr引物，可用于制备诊断试剂或生物芯片等工具，对hbbart’s胎儿水肿综合征胎儿的辅助诊断、表型预测和治疗有重要潜在价值和应用前景。

【附图说明】

图1是qpcr检测hsa_circ_0006687在对照组和实验组中的表达箱线图；

其中c为对照组，t为实验组。

图2是hsa_circ_0006687qpcr产物琼脂糖凝胶电泳图；

其中m为dnamarker，条带从上到下依次为1500bp、1000bp、800bp、600bp、500bp(亮带)、400bp、300bp、200bp和100bp；编号1为qpcr产物。

图3是hsa_circ_0006687反向剪接位点sanger测序峰图；

其中编号1为碱基g，编号2为碱基a，编号3为碱基c，编号4为碱基t。

【具体实施方式】

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。

实施例：

hbbart’s胎儿水肿综合征(hbbart'shydropsfetalissyndrome，bhfs)胎盘组织环状rna生物标志物，即为hsa_circ_0006687，它具有碱基序列如表1(seqidno:1)。

表1bhfs相关的环状rna生物标志物的序列

胎盘组织环状rna生物标志物在制备辅助诊断hbbart’s胎儿水肿综合征(hbbart'shydropsfetalissyndrome，bhfs)的试剂、试剂盒、生物芯片或治疗药物研发中有一定的应用前景。

以上述环状rna生物标志物为目标设计的跨越反向剪接位点的引物碱基序列如表2(seqidno:2)与(seqidno:3)。

表2rt-qpcr引物信息

上述引物在制备a地贫辅助诊断的试剂、试剂盒、生物芯片或药物研发中具有一定的应用前景。

本实施例将hbbart’s胎儿水肿综合征环状rna生物标志物用于hbbart’s胎儿水肿综合征(hbbart'shydropsfetalissyndrome，bhfs)的辅助检测，其具体过程为：

1.采用高通量测序筛选候选的hbbart’s胎儿水肿综合征相关环状rna

收集5例正常对照及5例hbbart’s胎儿水肿综合征胎盘组织，利用trizol方法提取总rna，并对所获的的总rna进行质检，确保总rna的浓度及完整性达到测序要求。每例样本取1-2μg总rna，用ribozeromagneticgoldkit去除rrna处理，用kapastrandedrna-seqlibraryprepkit(illumina)建库。构建好的文库通过agilent2100bioanalyzer质检，并通过qpcr定量。使用illuminahiseq4000测序仪测序150个循环。将样本中的环状rna表达量标准化为cpm(countspermillion)，对2组样本表达差异进行分析统计，并根据预设的条件，初步筛选出与bhfs相关的环状rna。设定筛选阈值为：

1)表达水平变化倍数foldchange绝对值≥1.5；

2)p值<0.05；

共筛选出112个候选环状rna，其中有40个表达上调，72个表达下调。

2.bhfs胎盘组织环状rna的rt-qpcr及一代测序验证

选择表达上调的hsa_circ_0006687，进行rt-qpcr验证分析。收集22例bhfs胎盘组织作为实验组，同时收集11例正常妊娠对照组(表3)。该研究已获得广西医科大学第一附属医院伦理委员会批准，所有受试者均提供书面知情同意书。

表333例组织样品

上述bhfs胎盘组织环状rna生物标志物表达量的检测方法，包括以下步骤：

(1)总rna提取

取胎盘组织加入300μltrizol，用组织研磨器充分研磨，再加入700μltrizol使其充分裂解，室温静置5分钟后，加入200μl氯仿，剧烈震荡15秒，冰上静置15分钟；4℃12000g离心15分钟；吸取上层水相300μl，加入预冷的等体积异丙醇，轻轻混匀，冰上静置10分钟；4℃12000g离心15分钟，弃上清；加入1ml75％乙醇，小心重悬沉淀，4℃7500g离心5分钟，弃上清，重复操作洗涤一次。置于超净工作台中风干沉淀5-10分钟；最后加入20μl用depc处理过的双蒸水溶解rna沉淀。

(2)去除基因组dna处理

取3μgrna(不足3ug的样品全部做去dna处理)进行后续实验，反应体系如下：

条件为37℃反应30min，75℃灭活10min。

(3)逆转录

将1μgrna(不足1μg的全部逆转录)进行逆转录，反应体系如下：

混匀，离心后，65℃孵育5min，立即放冰上5min。加入下列试剂

反应条件：25℃10min，42℃60min，70℃5min。

(4)qpcr检测

反应体系如下：

使用abi7500型快速实时荧光定量pcr仪进行检测,反应程序如下：95℃2min共1个循环，95℃5s，60℃30s共40个循环，最后加上溶解曲线。(具体引物见表2)。

步骤(4)中引物包含环状rna的反向剪接位点序列(hsa_circ_0006687：aaaagattat)。rt-qpcr扩增产物大小分别为74bp(产物电泳图如图2，扩增序列为seqidno.4)，通过琼脂糖凝胶电泳验证扩增产物大小，sanger测序验证扩增产物包含反向剪接位点序列(sanger测序峰图如图3)。

在rt-qpcr试验中，其结果使用ct值作为环状rnas的相对定量参数，采用2^-δδct法计算实验组mirna的表达量相对于对照组变化的倍数，试验设立阴性对照和3次重复试验；结果数据利用spss19.0软件进行统计分析，采用nonpaametricmann-whitneytest方法统计两组间各环状rna的差异表达水平，p＜0.05时差异具有统计学意义。差异表达的环状rnas数据绘制箱线图；结果见图1，hsa_circ_0006687表达上调，与初筛结果一致。

综上，本发明建立了bhfs胎盘组织环状rna生物标志物的筛选方法和表达谱，并发现bhfs胎盘组织中环状rna存在异常表达，揭示了胎盘组织环状rna对bhfs潜在的检测的价值。其中，hsa_circ_0006687在bhfs胎盘组织中表达上调，是bhfs征性的环状rna分子，有辅助诊断、表型预测及治疗手段研发的潜在价值及重要的学术意义。

因此，它可以作为hbbart’s胎儿水肿综合征(hbbart'shydropsfetalissyndrome，bhfs)辅助诊断及表型预测的生物标志物，或者用于制备诊断试剂或生物芯片等工具，对hbbart’s胎儿水肿综合征(hbbart'shydropsfetalissyndrome，bhfs)的辅助诊断和治疗有重要潜在理论价值和应用前景。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>广西医科大学第一附属医院

<120>环状rnahsa_circ_0006687及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>469

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

attatctgcaattatgaaatgaagtaactcaagatgagcaagttaaaagtgataccagaa60

aaaagccttaccaataattctaggatcgtaggactcctggctcaactggagaagatcaat120

gctgagccttcagaatcagacactgcccgatatgttacatcaaaaattcttcatctggct180

cagagtcaagaaaaaacaaggagagaaatgacagccaaaggttctacaggaatggaaatt240

ctgctgtcaacattagagaacacaaaagatcttcaaactacacttaatatcttaagcatt300

cttgttgagctggtgtcagctggtggaggtcgaagagtgagtttcttagtcaccaaaggt360

ggttcacaaatattgttgcagttacttatgaatgccagcaaagaatctcccccacatgag420

gacttaatggtacagattcattctattcttgcaaagattggaccaaaag469

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tctcccccacatgaggactt20

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

tgcagataatcttttggtccaatct25

<210>4

<211>74

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tctcccccacatgaggacttaatggtacagattcattctattcttgcaaagattggacca60

aaagattatctgca74