一种批量鉴定环状rna的方法及其应用
【专利摘要】目前大多数据库，如circBase等所列出的环状RNA都是基于生物信息学预测或基因测序的结果，而对于某些环状RNA在具体的细胞或组织中的真实存在和表达并不能完全反应。因此我们在研究某些环状RNA时，首先必须对其进行细胞和组织鉴定。但是，如果对单独的某个环状RNA进行鉴定，可能因为细胞或组织或疾病的差异而鉴定不出来，这时就需要对我们感兴趣的RNA进行大量的筛查。本发明通过对环状RNA序列的获得和特异引物的设计从而批量地对这些环状RNA进行鉴定。该方法成本低，准确性高，最重要的是可以批量检测，是基础研究及应用研究的首选方法。
【专利说明】
一种批量鉴定环状RNA的方法及其应用
技术领域
[0001]本发明属于分子生物学研究领域，所涉及的应用范围包括体内外批量鉴定环状RNA分子的基础研究及其后续作为生物标记物用于临床检测及诊断的应用。具体为批量鉴定环状RNA的方法及其应用。
【背景技术】
[0002]环状RNA(circular RNA，circRNA)是新近确认的一类特殊的RNA( non-codingRNA，ncRNA)分子，通常由部分外显子或内含子环化而成的RNA分子，因而其结构比普通线状RNA稳定。circRNA普遍存在于真核细胞，具有一定的组织、时序和疾病特异性。circRNA是RNA家族的一颗极具发展潜力的正在升起的新星，也是RNA领域最新的研究热点。早期，关于circRNA的文献报道少，且表达水平相对低，故在很长一段时间里，circRNA被认为是错误可变剪接(alternative splicing )而形成的副产品，属于自然界中一种极罕见现象，甚至被当做遗传意外或实验人为因素所致，并未引起学术界重视。随着RNA测序和生物信息学等技术的快速发展，人们在大规模研究转录组数据时发现，circRNA并不像之前所认为的那样是一种极罕见现象，反而大量存在于真核细胞中。Danan等发现，circRNA在古生菌细胞普遍存在，并认为其极有可能具有生物学功能。同时，Salzman等也证实circRNA在人类细胞基因表达中是一个普遍现象，并可能扮演着多种生物学功能的重要角色。Jeck等采用高通量测序方法，在人成纤维细胞中检测到超过25000种circRNA，认为circRNA是RNA剪切后所形成的一类极稳定的保守性产物，此外还发现circRNA可被小型干扰RNA( smallinterfering RNA, siRNA)降解。Memczak 等研究证实circRNA 参与转录后调控，Hansen等的研究则揭示circRNA可作为miRNA海绵(miRNA sponge)来影响基因的调控与表达。
[0003]尽管circRNA被发现已有30余年，但由于技术限制等原因，circRNA—直处于被学术界忽视的地位。但随着近年有关circRNA的几项突破性研究的发现，尤其是国际著名权威刊物Nature发表两篇有关circRNA生物学功能的论文，震惊学术界，从此拉开揭开circRNA神秘面纱的序幕，circRNA已引起国内外学术界的关注，并将掀起研究热潮。而Glazar等建立了circRNA专用数据库“circBase”，该数据库对目前已发表的circRNA资料进行整合统一，同时提供已知的及新的circRNA测序资料，旨在为circRNA的研究提供一个较好的交流平台。
[0004]然而，目前大多数据库，如circBase等所列出的环状RNA都是基于生物信息学预测或基因测序的结果，而对于某些环状RNA在具体的细胞或组织中的真实存在和表达并不能完全反应。因此我们在研究某些环状RNA时，首先必须对其进行细胞和组织鉴定。但是，如果对单独的某个环状RNA进行鉴定，可能因为细胞或组织或疾病的差异而鉴定不出来，这时就需要对我们感兴趣的RNA进行大量的筛查。本发明通过对环状RNA序列的获得和特异引物的设计从而批量对这些环状RNA进行鉴定。
【发明内容】
[0005]circRNA是在基因转录后RNA剪接过程形成，因而环化连接部位的DNA序列结构和组成在基因组中检测不到。
[0006]首先，我们通过从基因库找到某个环状RNA可能的DNA序列，然后通过设计一对连接部分附近的反向引物(Divergent primers)，我们命名为circ-XXX-F和circ-XXX-R。在细胞或组织的RNA产物(cDNA)中可检测出来，而以基因组DNA为模板的PCR过程检测不到。PCR结果经琼脂糖凝胶电泳结果检测，以cDNA为模板呈阳性，而以基因组DNA为模板呈阴性，SP可能为环状RNA;两者呈阴性或阳性均不是环状RNA。
[0007]其次，环状RNA因其是环状结构，通过在其基因内部设计一对反向引物，经PCR后将整个环状RNA分子扩增出来，进一步测序便可得环状RNA的基因序列。因此，确定第一步后，我们将设id 对同向引物(Convergent primers)，我们命名为Linear-XXXH^PLinear-XXX-R。这些引物的 Linear-XXX-F 和 circ-XXX-R，或 circ-XXX-F 和 Linear-XXX-R 需要部分重置。
[0008]然后以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR结果经琼脂糖凝胶电泳结果检测，以所预测的分子量大小一致后，将PCR产物进行测序，最后确定环状RNA分子序列。
[0009]本发明技术方案实例:
从circBase随机挑选12个环状RNA，找到它们的序列后，用DNAstar软件分别设计引物，具体如下:
BARDlhsa_circ_0001098
circR-BARDl-F:CTGACTTTCTTACTTCGAGGGCTAAACcircR-BARD1-R:GGTATCAAAATGACTCACCACTTCACGPRKD3hsa_circ_0000992
circR-PRKD3-as-F:CATTCTGGGGGGATGAACTTTTCcircR-PRKD3-as-R:GGAACTGTCTTTATCTGCTGTCAAGGRSFlhsa_circ_0000345
circ-RSFl-as-F:CACAGTAGTCTCTTCTAGAACATTGGCcirc-RSFl-as-R:CCTTCCAAACCATCCTGAGCCBLhsa_circ_0000363
circ-CBL-F:CACAAATGGAGCCCAGACCAGcirc-CBL-R:CCAGAACTGATGGGATGCACTTCAPLFhsa_circ_0001023
circ-APLF-F:GTGGGCCAAGATGAGACTGATGcirc-APLF-R:GATTCGCAGCTGACCACCTGMGAT5hsa_circ_0001068
circ-MGAT5-F: GGTACATCAAGGCACTGGCAGAAGcirc-MGAT5-R: GAAAATGGTAGCAGGATCTTGAAGCBTBD7hsa_circ_0000563
circ-BTBD7-as-F:GCACCCATTTTCTTCAGTCACTCAGcirc-BTBD7-as-R:GGCAGAAGAAGCCATGGAACTTTACKPNBlhsa_circ_0000780circ-KPNBl-F:CCTGTTAAGGATGTTCCAAAGCACcirc-KPNBl-R:CTTCACCAGATTCTGTAAAGCAGCCCNTRLhsa_circ_0001884
circR-CNTRL-F:CTTCAGGTTGTTTTAAGGCAGATGTCcircR-CNTRL-R:CTCCGACTGCCGCTTGGATGLYNhsa_circ_0001803
circ-LYN-F:GCCATGGGATAAAGATGCCTGcirc-LYN-R:CATCGTCACTCAAGCTGTCTTTCC
总RNA的提取(参照Total mRNA Extract kit (Omiga)操作手册，具体如下:
(1)80%-90%融合的293T，用IX PBS轻轻冲洗两次，充分去掉多余的液体，加入I mLRNA裂解液(RNA-So IV )，室温将细胞吹下来；
(2)将匀浆液转移到1.5mL无RNA酶的EP中并加入200 yL的氯仿，剧烈震荡15秒后冰上静置10 min；
(3)待匀浆液出现明显的分层后，放入40C 12,000 g离心15 min，这时匀浆液便可分为三层；
(4)小心转移上层水相(不超过上层总体积的80%)到一个新的无RNA酶EP管中，并加入1/2倍体积的无水乙醇，充分混匀15秒；
(5)将混合液体转移到HiBindRNA离心柱中，室温10，000 g离心I min，弃流出液；、(6)将离心柱放置于新的收集管中，并加入300 yL的RNA洗杂缓冲液I，10，000 g离心30秒，弃去流出液；
(7)在离心柱中再次加入400 yL RNA洗杂缓冲液I，10，000 g离心I min，弃去流出液；(8)往离心柱中加入500 yL用无水乙醇稀释的RNA洗杂缓冲液Π，10，000 g离心I min，弃流出液；
(9)重复(8)洗涤后13，000g离心2 min充分除去残余液体；
(10)将离心柱置于新的1.5mL无RNA酶离心管中，在离心柱中加入30 yL DEPC水，室温静置2 min后，13,000 g离心I min，重新将洗出液吸回离心柱中，重复离心一次，最后收集洗脱液，-80 °C保存。
[0010]RNA的鉴定和定量:取2 μ?所得的RNA溶液，于I %琼脂糖凝胶电泳，在核酸检测仪下观察RNA完整性，28S、18S条带完整、清晰，且28S亮度是18S的2倍，并拍照片保存，表明RNA完整无降解。另取2 μ? RNA溶液，在核酸定量仪进行定量，所得到RNA浓度，OD 260/280比值在1.8-2.0范围内，表明所得的RNA纯度比较高，达到下一步实验的要求。
[0011 ] 反转录反应和过程取5 yg上述所得的总RNA，根据M-MLV First Strand Kit操作手册反转录合成cDNA，反应体系为20 μ?。具体步骤如下:
(1)在RNA酶的0.2 mL微量离心管中加入I yg的总RNA，oligo(dT) I yL和10 mM dNTPI yL，然后补水至12 yL，离心混匀后65 °C变性5 min，迅速置于冰上冷却，短暂离心后分别加入4 yL 5X第一链合成缓冲液、2 yL 0.1 M DTT和I yL RNaseOUT核酸酶抑制剂；
(2)离心混匀，然后置于PCR反应仪中37°C孵育2 min，随后常温下加入I yL M-MLV逆转录酶(200 U/yL)，离心混匀；
(3)重新放回PCR仪中，预设程序37°C反应50 min，接着70 °C处理15 min以灭活逆转录酶，最后4 °C冷却。制备的cDNA保存在-20 °C备用。
[0012]PCR扩增环状RNA片段具体步骤:
(1)于冰上将引物、cDNA/gDNA模板及5 X PCR buffer融解；
(2)按以下说明配制50yLPCR反应体系(PrimeSTAR ? HS DNA Polymerase, CodeN0.: R010A)ο(5 X PCR buffer,10 yL；Primerstar PCR enzyme ,0.5 yL；dNTP Mix,4 μL；Primers F，2 yL；Primers R，2 yL；gDNA template, I yL (50 ng) ;ddH20，30.5 yL;)总共50 yL；
(3)将混盒液稍稍离心，于PCR仪中反应，条件如下:(98°C，3 min ；98 °C ,15 s；68 °C，45 s ；68 °C ,2 min ;共34 cycles )最后4 °C保存;
(4)取5yL PCR反应产物于2 % DNA琼脂糖凝胶电泳，120 V，15 min，紫外灯下拍照记录；
(5)挑选可能为环状RNA的基因，标准为:以cDNA为模板呈阳性，而以基因组DNA为模板呈阴性，即可能为环状RNA;而者呈阴性或阳性均不是环状RNA。
[0013]根据上述结果，用DNAstar软件分别设计以下引物，其中下划线的为新合成的，没有下划线的为原来的引物，具体如下:
BARDlhsa_circ_0001098
IinearR-BARDl-F:GAAGTGGTGAGTCATTTTGATACCCGcircR-BARD1-R:GGTATCAAAATGACTCACCACTTCACGPRKD3hsa_circ_0000992
IinearR-PRKD3-as-F:GCTTCAATGGTAACACTCTCCCGcircR-PRKD3-as-R:GGAACTGTCTTTATCTGCTGTCAAGGRSFlhsa_circ_0000345
circ-RSFl-as-F:CACAGTAGTCTCTTCTAGAACATTGGClinearR-RSFl-as~R:CTTGTGAAACTGCCAGTCATAGTGAAGCCBLhsa_circ_0000363
circ-CBL-F:CACAAATGGAGCCCAGACCAGIinearR-CBL-R:GCAATGAAAATGGAAGTGAGTGCCAPLFhsa_circ_0001023
IinearR-APLF-F:CACACAAATCCATGTTTTTACCAGTCcirc-APLF-R:GATTCGCAGCTGACCACCTGMGAT5hsa_circ_0001068
circ-MGAT5-F: GGTACATCAAGGCACTGGCAGAAGIinearR-MGAT5~R: CTGCTTTCAGGCTGAGTTCGCBTBD7hsa_circ_0000563
IinearR-BTBD7-as-F:CCTGGTCATGTTTGGCTTCCcirc-BTBD7-as-R:GGCAGAAGAAGCCATGGAACTTTACKPNBlhsa_circ_0003650
circ-KPNBl-F:CCTGTTAAGGATGTTCCAAAGCACIinearR-KPNBl-R:CTGAAGAGTTGCACAGAGTAAAGACTGAAG CNTRLhsa_circ_0001884
IinearR-CNTRL-F:GCGGGAAGAAAGGTGGATGAGcircR-CNTRL-R:CTCCGACTGCCGCTTGGATGLYNhsa_circ_0001803
circ-LYN-F:GCCATGGGATAAAGATGCCTGIinearR-LYN-R:CCAATCTTCTGCACAAGCCATC。
[0014]PCR扩增环状RNA片段具体步骤:
(1)于冰上将引物、cDNA模板及5X PCR buffer融解；
(2)按以下说明配制50yLPCR反应体系(PrimeSTAR? HS DNA Polymerase, CodeN0.: R010A)ο(5 X PCR buffer,10 yL；Primerstar PCR enzyme ,0.5 yL；dNTP Mix,4 μL；Primers F，2 yL；Primers R，2 yL；gDNA template, I yL (50 ng) ;ddH20，30.5 yL;)总共50 yL；
(3)将混盒液稍稍离心，于PCR仪中反应，条件如下:(98°C，3 min ；98 °C ,15 s；68 °C，45 s ；68 °C ,2 min ;共34 cycles )最后4 °C保存;
(4)取5yL PCR反应产物于2 % DNA琼脂糖凝胶电泳，120 V，15 min，紫外灯下拍照记录；
(5)PCR结果经琼脂糖凝胶电泳结果检测，条带所在位置与预测的分子量大小一致后，将PCR产物进行测序，最后确定环状RNA分子序列；
(6)PCR产物回收并送样进行基因测序。
[0015]结果与分析:
由于我们设计引物检测的片段均在100-250 bp之间，PCR后琼脂糖凝胶电泳如图1所示，在该区域范围，环状RNA连接处的序列能在c(cDNA)模板组检测出来，而在g(基因组DNA)模板检测不到的，可以初步判断该环状RNA的存在，从结果中我们看到，如BARDI，P RKD 3，RSFI,CBL,APLF，MGAT5，BTBD7，KPNBI，CNTRL在区域内都有明显的带。而CBL由于在c和g组均有带，很可能为非特异，需要下一步PCR确定。接下来我们用I inear引物对全基因进行扩增。
[0016]结果如图2所示，？孤03，1??1，081^，4?1^，1?^了5，8了807均能检测到较明亮的条带，与预测条带大小相比，PRKD3约943 pb，RSFl约 1982 bp，APLF约 1190 bp，BTBD7约 1268 bp,而CBL和MGAT5明亮条带位置与预测的不一致，可能不是待检测的环状RNA。CNTRL，MGAT5则出现较多的非特异条带，同样被认为检测不出来。下一步我们将明条带回收后进行基因测序，以便最终确定是否为我们所检测的环状RNA。
[0017]经基因测序结果，序列与预测的环状RNA序列一致，如图3，4，5，6所示。
[0018]综上所述，本发明是一种批量快速检测环状RNA的方法，首先，对感兴趣的环状RNA先合成其连接处的引物circ-XXX-F/R，批量PCR检测连接处是否存在，如果存在以后，再设计一组I inear与circ-XXX-F/R存在部分重叠的引物，经PCR将整个环状RNA扩增，最后经测序确定其序列准确性。
[0019]【附图说明】:
图1环状RNA连接处引物circ-XXX-F/R经PCR批量初步检测，虚线之间的区域为100-250 bp大小的片段，在该区域中以c(cDNA)模板组检测出来，而在g(基因组DNA)模板检测不到条带的即可能为环状RNA; 图2环状RNA的全长基因PCR结果，从图1中筛选明显条带的基因，设计一组linear与circ-XXX-F/R存在部分重叠的引物，PCR结果与预测结果大小相仿的即很可能是该环状RNA ；
图3环状RNA PRKD3(hsa_circ_0000992)全长片段测序结果；
图4环状RNA RSFl(hsa_circ_0000345)全长片段测序结果；
图5环状RNA APLF(hsa_circ_0001023)全长片段测序结果；
图6环状RNA BTm)7(hsa_circ_0000563)全长片段测序结果。
【主权项】
1.一种批量鉴定环状RNA的方法，其特征包括每个步骤及过程。2.根据权利要求1所述的步骤，其特征在于，包括以RNA总量为5ug作为反转录RNA的量。3.根据权利要求1所述的步骤，其特征在于，先批量设计环状RNA连接处的PCR引物，并经PCR初步检测环状RNA是否存在，检测片段大小在于100 bp - 250 bp之间。4.根据权利要求3所述的鉴定方法，其特征在于，环状RNA引物的特征为5’端为Reword，3’端为Forword引物，与正常PCR引物方向相反。5.根据权利要求1所述的步骤，其特征还包括，根据3的结果再设计一组引物对初步鉴定的环状RNA进行全长基因扩增。6.根据权利要求5所述的步骤方法，其特征还包括，环状RNA全长扩增PCR引物包含部分与之前的引物部分重叠。7.根据权利要求1所述的步骤，其特征还包括，全长PCR产物经基因测序最终确定是否为预测的环状RNA。8.本发明包括用于各种不同组织或细胞中批量检测环状RNA的方法。9.本发明还包括该方法用鉴定出来的环状RNA用于基础研究及其后续作为生物标记物用于临床检测及诊断的应用。10.说明书所述的实施案例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，本发明的权利要求还包括对本发明技术方案所作的各种变形和改进，均应属于本发明权利要求书的保护范围之内。
【文档编号】C12Q1/68GK106011249SQ201610392217
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月6日
【发明人】杨展
【申请人】杨展