检测IFFO1基因甲基化的物质在诊断肺癌中的应用的制作方法

本发明涉及生物医学领域中，检测iffo1基因甲基化的物质在诊断肺癌中的应用。

背景技术：

肿瘤是严重危害人类生命健康的一类慢性疾病。肿瘤的精准治疗离不开精准的生物标志物，通常临床上会通过组织活检来获取标本。但是组织活检不能反映肿瘤的异质性，而且由于获取标本采用侵入性手段，给患者带来一定痛苦。非侵入性的液体活检有无创、快速、可重复取样等特点，具有很好的发展潜力和前景。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是如何诊断肺癌。

本发明首先提供了如下任一应用：

1、检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质在制备诊断或辅助诊断肺癌产品中的应用；

2、检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质在制备筛查或辅助筛查肺癌患者产品中的应用；

3、检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质或抑制iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质在制备治疗或辅助治疗肺癌产品中的应用；

4、检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质在制备监测或辅助监测肺癌治疗后发展进程产品中的应用。

cpg位点是指dna片段中的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸与鸟嘌呤脱氧核苷酸相邻的位点，即胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(c)-磷酸(p)-鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(g)。

上述应用中，所述检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质可为检测序列表中序列1所示dna片段中cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质。

所述iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化具体可为序列表中序列1的第19和20位、第22和23位、第28和29位、第79和80位、第82和83位、第94和95位、第97和98位、第99和100位、第117和118位以及第123和124位的cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化。

具体的，所述检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质可为检测序列表中序列1的第19和20位、第22和23位、第28和29位、第79和80位、第82和83位、第94和95位、第97和98位、第99和100位、第117和118位以及第123和124位的cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质。

上述应用中，所述检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质可包括序列表中序列2和3所示的两条单链dna组成的引物对。

上述应用中，所述检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质还包括taqman探针，所述taqman探针的序列为序列表中序列4。

所述taqman探针可标记有荧光基团(如6-fam)和荧光淬灭基团(如bhq1)。

所述检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质还包括来源于非肺癌患者的样本。所述来源于非肺癌患者的样本可为非肺癌患者的细胞或体液，如血液或唾液。

所述检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质可由所述引物对和所述taqman探针组成，还可由所述引物对、所述taqman探针和所述来源于非肺癌患者的样本组成。

所述产品可为试剂盒，药物或疫苗。

本发明还提供了下述任一应用：

x1)以iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化为标志物的诊断或辅助诊断肺癌方法中所用的物质在制备诊断或辅助诊断肺癌产品中的应用；

x2)以iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化为标志物的筛查或辅助筛查肺癌患者方法中所用的物质在制备筛查或辅助筛查肺癌患者产品中的应用；

x3)以iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化为标志物的治疗或辅助治疗肺癌方法中所用的物质在制备治疗或辅助治疗肺癌产品中的应用；

x4)以iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化为标志物的监测或辅助监测肺癌治疗后发展进程方法中所用的物质在制备监测或辅助监测肺癌治疗后发展进程产品中的应用。

所述iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化可为序列表中1所示dna片段中cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化。

所述iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化具体可为序列表中序列1的第19和20位、第22和23位、第28和29位、第79和80位、第82和83位、第94和95位、第97和98位、第99和100位、第117和118位以及第123和124位的cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化。

本发明还提供了具有如下y1)-y5)中任一功能的物质，所述物质包括序列表中序列2和3所示的两条单链dna组成的引物对：

y1)检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化；

y2)诊断或辅助诊断肺癌；

y3)筛查或辅助筛查肺癌患者；

y4)治疗或辅助治疗肺癌；

y5)监测或辅助监测肺癌治疗后发展进程。

所述物质还可包括taqman探针，所述taqman探针的序列为序列表中序列4。

所述taqman探针可标记有荧光基团(如6-fam)和荧光淬灭基团(如bhq1)。

所述检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质还可包括来源于非肺癌患者的样本。所述样本可为非肺癌患者的细胞或体液，如血液或唾液。

所述物质可由所述引物对和所述taqman探针组成，还可由所述引物对、所述taqman探针和所述来源于非肺癌患者的样本组成。

所述物质可为试剂盒，药物或疫苗。

在本发明中，检测待测样本是否为肺癌患者样本时，以来源于非肺癌患者的样本为对照样本，利用所述检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化的物质检测所述对照样本和所述待测样本基因组dna中iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化情况，确定所述待测样本是否为肺癌患者样本：

如所述待测样本基因组dna中iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化水平高于所述对照样本，所述待测样本为或候选为肺癌患者样本；如所述待测样本基因组dna中iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化水平不高于所述对照样本，所述待测样本不为或候选不为肺癌患者样本。

所述iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化具体可为第19和20位、第22和23位、第28和29位、第79和80位、第82和83位、第94和95位、第97和98位、第99和100位、第117和118位以及第123和124位的cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的甲基化。

利用所述物质检测iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化情况可采用荧光定量pcr进行。

所述待测样本可为细胞或体液，如血液或唾液。

本发明发现iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化水平与肺癌相关，并进一步提供了检测iffo1基因的cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化水平的成套试剂，利用该成套试剂可以成功检测iffo1基因的cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化情况，并可进一步确定待测样本是否为肺癌患者的样本。因此，iffo1基因cpg位点胞嘧啶脱氧核糖核苷酸甲基化能够作为一种肺癌检测标记物来辅助进行肺癌的早期诊断治疗以及手术后复发监测，尤其在为普通人群进行肺癌初筛方面具有非常好的应用前景。

附图说明

图1为荧光taqman探针实时定量pcr检测不同细胞系中iffo1基因的甲基化情况。纵坐标为2^－△△ct，表明不同细胞系中iffo1基因甲基化相对于ekvx中iffo1基因甲基化的量。

图2为实施例1的成套试剂的灵敏度的检测结果。m为dna分子量标准，2ngekvx、1:10、1:100、1:1000和2ng293t分别表示模板dna1、模板dna2、模板dna3、模板dna4和模板dna5的反应体系，nc为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中，如无特殊说明，序列表中各核苷酸序列的第1位均为相应dna/rna的5′末端核苷酸，末位均为相应dna/rna的3′末端核苷酸。

实施例1、用于诊断肺癌的成套试剂的制备

本实施例提供的用于诊断肺癌的成套试剂由引物对和taqman探针组成，引物对由序列表中序列2和3所示的两条单链dna组成。taqman探针的5′末端标记有荧光基团6-fam，3′末端标记有荧光淬灭基团bhq1，具体信息如下：

上游引物：5′-aaggtgtatgagttggagcgtcggaatc-3′(序列2)；

下游引物：5′-cgaaaccgatctacactacctaatcgcg-3′(序列3)；

taqman探针：6-fam5′-acgacccaaaccccgccgaccctactta-3′bhq1(序列4)。

该成套试剂中的两条单链dna和taqman探针均独立包装，且三者的摩尔比为1:1:1。

该成套试剂中的引物对可以对人基因组的iffo1基因的第268-390位(序列表中序列1所示)进行pcr扩增。序列1含有11个cpg位点，分别为序列1的第19、20位、第22、23位、第28、29位、第56、57位、第79、80位、第82、83位、第94、95位、第97、98位、第99、100位、第117、118位和第123、124位。cpg位点是指dna片段中的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸与鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸相邻的位点，即胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(c)-磷酸(p)-鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(g)。

实施例2、实施例1的成套试剂可以用来诊断肺癌

一、待测细胞系：

人正常细胞系：293t(人胚胎肾细胞系)，wpmy-1(人正常前列腺基质永生化细胞系)；

肺癌细胞系：h460(大细胞肺癌细胞系)，h522(非小细胞肺癌细胞系)，h1299(非小细胞肺腺癌细胞系)，ekvx(人肺癌细胞系)。

二、利用实施例1的成套试剂检测cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的甲基化情况

1.培养并且提取各待测细胞系的基因组dna：利用qiagen公司的qiaampdnabloodminikit，按照产品使用说明进行提取。

2.亚硫酸氢钠转化提取的基因组dna：

将步骤1得到的待测细胞系的基因组dna各取1μg分别用亚硫酸氢钠处理进行转化，得到亚硫酸氢钠处理的基因组dna。如果cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸c没有被甲基化(dna的甲基化通常发生在cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸c)，在亚硫酸氢钠处理后变成尿嘧啶核糖核苷酸u，然而甲基化的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸不会被转化。亚硫酸氢钠处理进行转化利用qiagen公司的epitectfastdnabisulfitekit，按照产品使用说明进行。

3.iffo1基因甲基化的检测

以各细胞系的亚硫酸氢钠处理的dna为模板，利用实施例1的成套试剂进行实时定量pcr，实验重复4次。

选用alu-c4为内参基因，内参基因的引物和taqman探针(探针的5′和3′末端分别标记有6-fam和bhq1)如下：

上游引物：5′-ggttaggtatagtggtttatatttgtaattttagta-3′；

下游引物：5′-attaactaaactaatcttaaactcctaacctca-3′；

探针：6-fam5′-cctaccttaacctccc-3′bhq1。

反应体系(20μl)：probeqpcrsupermix10μl，4ng模板dna，实施例1成套试剂中的上游引物、下游引物和taqman探针。该反应体系中，实施例1成套试剂中的上游引物、下游引物和taqman探针的浓度均为200nm。内参基因alu-c4的上游引物和下游引物的浓度为600nm,taqman探针的浓度为200nm。

反应条件：94℃3分钟；94℃15秒，55℃1分钟，40个循环。

将各个样本的ct值相对于内参基因alu-c4的ct值进行了归一化，将ekvx的2^－△△ct设为1并计算各样本的2^－△△ct，以2^－△△ct作为纵坐标进行作图，其它样本的2^－△△ct与ekvx的2^－△△ct比值如图1所示。

结果显示，实施例1的成套试剂在两种人源正常细胞中几乎没有检测到任何信号，而在四种肺癌细胞中都特异检测到了iffo1基因甲基化信号(图1)，对这六种细胞的序列1区域的扩增产物进行测序，结果显示，亚硫酸氢钠处理后，肺癌细胞基因组dna中的对应于序列表中序列1的第19、20位、第22、23位、第28、29位、第79、80位、第82、83位、第94、95位、第97、98位、第99、100位、第117、118位和第123、124位的cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸绝大多数未发生变化，而两种人源正常细胞的这些cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸绝大多数均转变为尿嘧啶核糖核苷酸u(pcr产物中转变的位点显示为胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸t)，且人源正常细胞的这些cpg位点中发生核苷酸转变的数量显著高于肺癌细胞，表明肺癌细胞基因组中这些cpg位点的甲基化水平显著高于人源正常细胞。证实了实施例1的成套试剂能够有效特异地对肺癌细胞中iffo1基因中序列1的第19、20位、第22、23位、第28、29位、第79、80位、第82、83位、第94、95位、第97、98位、第99、100位、第117、118位和第123、124位的cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的甲基化情况进行检测，并进一步可以根据甲基化情况确定待测样本是否为肺癌患者的样本。因此，iffo1基因甲基化能够作为一种肺癌检测标记物来辅助进行肺癌的早期诊断治疗以及手术后复发监测，尤其在为普通人群进行肺癌初筛方面具有非常好的应用前景。

具体的，在实际应用中，检测待测样本是否为肺癌患者样本时，以来源于非肺癌患者的样本为对照样本，利用实施例1的成套试剂采用荧光定量pcr检测对照样本和待测样本基因组dna中对应于序列表中序列1的第19、20位、第22、23位、第28、29位、第79、80位、第82、83位、第94、95位、第97、98位、第99、100位、第117、118位、第123、124位的cpg位点的胞嘧啶脱氧核糖核苷酸的甲基化情况，确定待测样本是否为肺癌患者样本：

如待测样本中基因组dna中对应于序列表中序列1的第19、20位、第22、23位、第28、29位、第79、80位、第82、83位、第94、95位、第97、98位、第99、100位、第117、118位、第123、124位的cpg位点的甲基化水平高于对照样本，该待测样本候选为肺癌患者样本；如待测样本中基因组dna中对应于序列表中序列1的第19、20位、第22、23位、第28、29位、第79、80位、第82、83位、第94、95位、第97、98位、第99、100位、第117、118位、第123、124位的cpg位点的甲基化水平不高于对照样本，该待测样本候选不为肺癌患者样本。

实施例3、实施例1的成套试剂的灵敏度

待测样本为：ekvx(人肺癌细胞)和293t(人胚胎肾细胞)。

检测方法如下：

提取各待测样本的基因组dna，利用qiagen公司的epitectfastdnabisulfitekit对得到的基因组dna进行亚硫酸氢钠处理，得到亚硫酸氢钠处理的dna。按照如下方式制备15μl反应体系的模板dna：

模板dna1：2ng亚硫酸氢钠处理的ekvxdna；

模板dna2：将ekvx的亚硫酸氢钠处理的dna稀释10倍后和293t的亚硫酸氢钠处理的dna混合即得到模板dna2，模板dna2中ekvx的亚硫酸氢钠处理的dna的量为0.2ng，总dna量为2ng；

模板dna3：将ekvx的亚硫酸氢钠处理的dna稀释100倍后和293t的亚硫酸氢钠处理的dna混合即得到模板dna3，模板dna3中ekvx的亚硫酸氢钠处理的dna的量为0.02ng，总dna量为2ng，人类单拷贝基因组为3.3pg，模板dna3即含有6拷贝ekvx单拷贝基因组；

模板dna4：将ekvx的亚硫酸氢钠处理的dna稀释1000倍后和293t的亚硫酸氢钠处理的dna混合即得到模板dna4，模板dna4中ekvx的亚硫酸氢钠处理的dna的量为0.002ng，总dna量为2ng；

模板dna5：2ng亚硫酸氢钠处理的293tdna。

以上述模板dna为模板，分别利用实施例1的成套试剂按照如下反应体系和反应条件进行实时定量pcr，采用probeqpcrsupermix(北京全式金生物)进行。每个反应体系中一种模板dna，并利用水替换模板作为阴性对照(nc)。

反应体系(15μl)：probeqpcrsupermix7.5μl，模板dna，实施例1成套试剂中的上游引物、下游引物和taqman探针。该反应体系中，实施例1成套试剂中的上游引物、下游引物和taqman探针的浓度均为200nm。

反应条件：94℃3分钟；94℃15秒，55℃1分钟，40个循环。

将各pcr产物进行2％琼脂糖电泳，结果显示，实施例1的成套试剂检测到0.6拷贝的肿瘤基因组dna，具有高灵敏度；另外，实施例1的成套试剂可以在大量正常组织dna的干扰下，对低至0.6拷贝的肿瘤基因组dna进行高灵敏度的检测(图2)。

<110>北京大学

<120>检测iffo1基因甲基化的物质在诊断肺癌中的应用

<160>4

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>124

<212>dna

<213>人（homosapiens）

<400>1

aaggtgcatgagctggagcgccggaaccggctgttggagaagcaactgcagcaagcgctg60

gaggagggtaagcagggccggcggggcctgggtcgtcgcgaccaggcagtgcagaccggc120

ttcg124

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aaggtgtatgagttggagcgtcggaatc28

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

cgaaaccgatctacactacctaatcgcg28

<210>4

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

acgacccaaaccccgccgaccctactta28