lncRNA及其在疾病中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及lncrna及其在疾病中的应用。

背景技术：

肝癌(livercancer)是指发生于肝脏或从肝脏开始的恶性肿瘤，肝癌的症状包括肋骨架右侧下方的肿块或疼痛、腹水、黄疸、容易瘀伤、体重减轻以及身体的虚弱。肝癌是死亡率最高的恶性肿瘤之一。它是世界上第五大常见恶性肿瘤，也是癌症死亡的第三大原因。全球每年有超过50万人患有肝癌，其中一半以上在中国，每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51％，给我国的社会和医疗带来了沉重的负担(siad,villanuevaa,etal.livercancercelloforigin,molecularclass,andeffectsonpatientprognosis[j].gastroenterology,2017,152:745-761.)。肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,hcc)发生在慢性肝脏炎症的环境中，并且与慢性病毒性肝炎感染(乙型或丙型肝炎)或与酒精或黄曲霉素等毒素接触相关性极高。中国是乙型肝炎的高发国家，由此控制肝细胞癌的形势尤为严峻(parikhnd,fusetal.riskassessmentofhepatocellularcarcinomainpatientswithhepatitiscinchinaandtheusa[j]digestivediseasesandsciences,2017,62:3243-3253.)。很多患者在初次确诊时就被分期为中晚期，有些已经发生了转移错过了诊疗的最佳时机，导致预后效果相当差(zhuzx,huangjwetal.treatmentstrategyforhepatocellularcarcinomainchina:radiofrequencyablationversusliverresection[j].japanesejournalofclinicaloncology,2016,46:1075一1080.)。近年来由于深度测序和dna平铺阵列的发展，彻底改变了我们对基因组织和内容的看法：据估计高达70％的基因组被转录，但只有2％的人类基因组最终被翻译成蛋白质(polychronopoulosd,kingjwdetal.conservednon-codingelements:developmentalgeneregulationmeetsgenomeorganization[j]2017,45:12611-12624.)。随着研究的深入，长链非编码rna(longnoncodingrna，1ncrna)，即一类长于200核苷酸的不编码蛋白质的转录物，日渐被研究者发现。根据1ncrna在基因组中与蛋白质编码基因的相对位置，进一步将其分为5类，即正义1ncrna、反义1ncrna、双向1ncrna、基因内1ncrna和基因间1ncrna(jarrouxj,morillonaetal.history,discovery,andclassificationoflncrnas[j]advancesinexperimentalmedicineandbiology,2017,1008:1-46.)。目前1ncrna已被证实在多种生物过程中发挥作用，比如在生长发育中起调控作用，参与稳定免疫系统等，更与肿瘤的发生发展相关。lncrnas在多种癌症中异常表达，并参与多种癌症生物学过程。比如1ncrnamalat1，被发现在早期小细胞肺癌中异常表达，且能作为体现转移潜力的预后指标之一(lizx,zhuqn,etal.malatl:apotentialbiomarkerincancer[j].cancermanagementandresearch,2018,10:6757-6768.)。随后1ncrna在多种癌症中与转移的关系又被多个课题组所揭示，被证实与许多肿瘤的发展与转移密切相关。由此，发现更多对肿瘤转移具有重要调控作用的长链非编码rna对认识肿瘤的发生发展，并以此提供相应的防治措施有不可忽略的作用。

技术实现要素：

为了弥补现有技术的不足，本发明经过广泛而深入的研究，通过检测肝癌标本中lncrna在肿瘤组织和正常组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncrna，探讨其与肝癌的发生之间的关系，从而为肝癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种肝癌的基因标志物，所述标志物包括rp11-830f9.5。

本发明的第二方面提供了一种检测本发明第一方面所述的基因标志物的试剂。

本发明的第三方面提供了本发明的第一方面所述的基因标志物或本发明第二方面所述的试剂的用途，所述用途包括：

1)用于构建预测肝癌风险的计算模型；

2)制备肝癌癌症诊断的试剂；或

3)制备肝癌诊断试剂盒。

进一步，所述计算模型的输入变量为本发明的第一方面所述的基因标志物的表达水平。

进一步，所述基因标志物的表达水平的测定方法包括反转录pcr、实时定量pcr、原位杂交、芯片技术中的任意一种或多种。

本发明的第四方面提供了一种诊断肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的第二方面所述的试剂。

进一步，所述试剂包括特异性识别rp11-830f9.5的探针或特异性扩增rp11-830f9.5的引物。

进一步，所述特异性扩增rp11-830f9.5基因的引物序列如seqidno.1～2所示。

本发明的第五方面提供了一种rp11-830f9.5基因或其促进剂的用途，用于制备预防和/或治疗肝癌的药物组合物。

进一步，所述促进剂包括rp11-830f9.5基因表达产物、促进型mirna、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

进一步，所述促进剂为rp11-830f9.5基因表达产物或产生rp11-830f9.5基因表达产物的构建体。

本发明的第六方面提供了一种治疗肝癌的药物组合物，所述药物组合物包括rp11-830f9.5的促进剂。

进一步，所述促进剂为rp11-830f9.5基因表达产物或产生rp11-830f9.5基因表达产物的构建体。

发明详述

本发明的发明人经过大量实验和反复研究，发现rp11-830f9.5在肝癌组织中表达显著下调，为了探讨rp11-830f9.5与肝癌的发生发展之间的相关性，通过增加rp11-830f9.5基因表达来检测该基因对肝癌细胞的功能性影响。

在本发明中，术语“rp11-830f9.5”位于16号染色体上，包括rp11-830f9.5基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的rp11-830f9.5，以及源自细胞中加工的任何形式的rp11-830f9.5。该术语涵盖rp11-830f9.5的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。目前rp11-830f9.5存在四个转录本，序列分别如enst00000565053.1、enst00000569249.1、enst00000562574.1、enst00000562405.1。一种代表性的rp11-830f9.5的序列如enst00000565053.1所示。

本发明的多核苷酸可以是dna形式或rna形式。dna形式包括cdna、基因组dna或人工合成的dna。dna可以是单链的或是双链的。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段，包括正义和反义的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度至少含15个核苷酸，较好是至少30个核苷酸，更好是至少50个核苷酸，最好是至少100个核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如pcr)以确定和/或分离rp11-830f9.5的多核苷酸。

本发明的人rp11-830f9.5核苷酸全长序列或其片段通常可以用pcr扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于pcr扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cdna库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cdna库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次pcr扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用pcr技术扩增dna/rna的方法被优选用于获得本发明的基因。用于pcr的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的dna/rna片段。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人rp11-830f9.5编码dna序列和合适的转录控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。所述的dna序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导rna合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(gfp)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇s2或sf9的昆虫细胞；cho、cos、或293细胞的动物细胞等。

用重组dna转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收dna的感受态细胞可在指数生长期后收获，用cacl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用mgcl2。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的dna转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

本发明rp11-830f9.5的促进剂，当在治疗上进行施用(给药)时，可促进rp11-830f9.5的表达，从而抑制肝癌。在一优选例中，所述的rp11-830f9.5促进剂包括rp11-830f9.59基因表达产物、促进型mirna、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。

通常，可将这些促进剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中ph通常约为5-8，较佳地ph约为6-8，尽管ph值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明klf9蛋白或其促进剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量。

在本发明中，术语“治疗”是指治疗性治疗和预防性或防止性措施，其目的是预防或减缓(减轻)不期望的生理变化或失调，例如癌症的发展或扩散。出于本发明的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于：症状的减轻、疾病程度的降低、疾病状态的稳定化(即，未恶化)、疾病进展的延迟或减缓、疾病状态的改善或减轻、以及缓解(不管是部分还是全部)，无论是可检测的还是不可检测的。需要治疗者包括已经患有病症或失调者以及具有患该病症或失调的倾向者、或其中有待预防该病症或失调者。

术语“治疗有效量”是指有效治疗哺乳动物的疾病或失调的药物的量。在癌症的情况下，药物的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减小肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减慢并优选地停止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，在一定程度上减慢并优选停止)肿瘤转移；在一定程度上抑制肿瘤生长；和/或在一定程度上减轻与癌症相关的一种或多种症状。在药物可以预防现有癌细胞生长和/或将其杀死的情况下，所述药物可能是细胞生长抑制的和/或细胞毒性的。对于癌症治疗，可以例如通过评定疾病进展时间(ttp)和/或确定响应率(rr)来量度功效。

进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。

在本发明中，术语“载体”意指能够传送与其连接的另一个核酸的核酸分子。该术语包括作为自身复制核酸结构的载体以及组入其已被引入的宿主细胞中的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们可操作连接的核酸的表达。这样的载体在本文中被称为“表达载体”。

术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指在其中引入了外源核酸的细胞，包括这些细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括初级转化细胞和从其衍生的后代，而不考虑传代次数。后代在核酸含量方面与亲本细胞可能不完全相同，而可能含有突变。在本文中包括具有与在原始转化细胞中所筛选或选择相同的功能或生物活性的突变体后代。

术语“包装说明书”用于指通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这种治疗产品的适应症、用法、剂量、给药、联合疗法、禁忌症和/或警告的信息。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了肝癌的特征基因，建立了预测肝癌的计算模型，以及诊断肝癌的产品和治疗肝癌的药物组合物，使用rp11-830f9.5作为检测变量进行诊断具有较高的敏感性和特异性。

附图说明

图1是rp11-830f9.5在样本中的表达情况图。

图2是rp11-830f9.5的诊断效能图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1检测rp11-830f9.5在肝细胞癌中的表达情况

1、样品收集

分别收集27例原发性肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本(距离肿瘤边缘≥5cm的肝组织)，配对的癌组织经病理证实为肝细胞癌。标本于手术后内用大量生理盐水清洗干净后立即分装，经液氮冷冻后放入-80℃冰箱冻存。

2、rna样品的制备及质量分析

使用trizol法提取组织总rna

1)用剪刀组织剪碎，加入1mltrizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。

2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。

3)4℃，11000rpm离心15min。

4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。

5)4℃，11000rpm离心15min。

6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。

7)4℃，8000rpm离心5min。

8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。

9)检测rna浓度，鉴定rna的产量和纯度。

3、qpcr检测

1)引物设计

根据rp11-830f9.5和gadph的基因序列设计引物，具体引物序列如下：

rp11-830f9.5基因：

正向引物为5’-gaacacgctggctctgag-3’(seqidno.1)；

反向引物为5’-aaccttagacacgctgtattgaa-3’(seqidno.2)。

gapdh基因：

正向引物为5’-aatcccatcaccatcttccag-3’(seqidno.3)；

反向引物为5’-gagccccagccttctccat-3’(seqidno.4)。

2)逆转录反应

采用fastqμantcdna第一链合成试剂盒(货号：kr106)进行lncrna反转录，首先去除基因组dna反应，在试管中加入5×gdnabμffer2.0μl，总rna1μg，加rnasefreeddh2o使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×fastrtbμffer2.0μl，rtenzymemix1.0μl，fq-rtprimermix2.0μl，rnasefreeddh2o5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。

3)qpcr扩增检验

用superrealpremixplus(sybrgreen)(货号：fp205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。

采用20μl反应体系：2×superrealpremixplus10μl，正反向引物(10μm)各0.6μl，5×roxreferencedye^△2μl，dna模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环。

4)cdna模板浓度的筛选

将各样本cdna混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。

根据溶解曲线，可以看出，当cdna的进行10倍稀释时，pcr的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。

5)样品realtimepcr检测

将各样品cdna10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2^-δδct法进行相对定量。

4、结果

qpcr结果显示，以rp11-830f9.5在对照组(癌旁组织)中的表达量作为基准定为1，与癌旁组织相比，rp11-830f9.5在肝细胞癌组织中表达下调(图1)，差异具有统计学意义(p<0.05)。

具体表达情况如表1所示，呈现rp11-830f9.5显著下调的样本有25例，其中癌组织样本有21例，癌旁组织样本有4例。说明rp11-830f9.5应用于肝细胞癌的诊断具有较高的特异性和敏感性。

表1基因在疾病中的阳性情况表

实施例2rp11-830f9.5的诊断效能的检测

1、数据收集

从tcga数据库中下载lncrna的表达谱数据，其中包括371例肝癌组织和50例癌旁组织。

2、roc曲线分析

使用r语言中的proc包分析lncrnarp11-830f9.5的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制roc曲线。

3、结果

roc分析结果如图2所示，从图中可以看出，rp11-830f9.5作为检测变量具有较高的曲线下面积(auc＝0.899)，最佳临界点为23.500，最佳临界点的特异性为0.980，敏感性为0.768。说明使用rp11-830f9.5进行肝细胞癌的诊断具有较高的敏感性和特异性。

实施例3rp11-830f9.5的功能验证

1、细胞培养

人肝癌细胞系hepg2购于上海细胞库，细胞系均以含10％胎牛血清和1％p/s的培养基dmem在37℃、5％co2的培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，隔天换液。

2、转染

2.1过表达载体的构建

由上海吉凯基因设计并合成rp11-830f9.5的过表达载体，将实验分为三组：对照组(hepg2)、阴性对照组(转染空载)和实验组(过表达rp11-830f9.5)

2.2转染

按照invitrogen公司的lipofectamine2000转染试剂说明书进行转染。具体步骤如下：

1)将肝癌细胞系hepg2加入含10％胎牛血清的dmem培养基并置于37℃、5％co2的培养箱中培养。当细胞生长融合至80-90％的时，用pbs清洗3遍以去除细胞瓶中的血清成分，然后加入1-2ml的含0.25％的胰酶0.02％edta的消化液，当细胞变为单个细胞时加入1ml的完全培养基终止消化。

2)将细胞转移至离心管内，放入常温离心机，1000g/min离心5min收集细胞沉淀，用完全培养基将细胞重悬为1×10⁵/ml，吸取500μl接种于24孔板内，放入37℃、5％co2的培养箱中培养过夜。

3)在opti-mem培养液中加入lipofectamine2000，室温孵育5min。

4)在opti-mem培养液中加入过表达载体混合均匀。

5)将稀释好的3)和4)混合均匀，室温放置20min。

6)将混合液加入到无血清培养基培养细胞的24孔板中，轻轻晃动混匀，放入37℃、5％co2的培养箱中培养6h后将细胞培养液更换为新鲜的完全培养基继续培养。

3、qpcr检测细胞中rp11-830f9.5的表达水平

各组细胞转染培养48h后，使用trizol法提取细胞总rna，按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量pcr检测。

4、cck-8法检测细胞增殖能力

1)各组细胞转染后24h，用pbs清洗3次去除细胞内的血清成分，然后用胰蛋白酶将细胞充分消化，1000rpm离心5min收集细胞，弃去上清液并用1ml含10％胎牛血清的dmem培养基重悬，细胞计数板对细胞进行计数。

2)用含有10％胎牛血清的dmem培养基将细胞稀释至1×10⁴/ml，然后向96孔板的每孔加入200μl细胞(每种细胞接种5个复孔)。

3)在96孔板四周未铺细胞的其他孔中加入200μl的pbs。

4)将接种好肿瘤细胞的96孔板放至37℃、5％co2的细胞培养箱内培养72h后加入10μlcck-8，放入培养箱内孵育1h。

5)将培养板取出，用酶标仪测量450nm波长的吸光度。

5、细胞迁移实验

1)各组细胞转染后24h，用pbs清洗3次去除细胞内的血清成分，然后用胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液转移至15ml离心管内，然后放入室温离心机内，1000rpm离心5min收集细胞。弃去上清然后用1ml不含胎牛血清的dmem培养基重悬细胞，用细胞计数板对细胞进行计数。用不含胎牛血清的dmem培养基将细胞稀释至1×10⁶/ml，吸取1×10⁵个细胞滴加入transwell小室的上室。

2)向transwell小室的下室加入600μl含10％血清的完全培养基，然后将上室放入孔板内，置于37℃、5％co2的细胞培养箱内培养24h。

3)取出小室，轻轻弃去小室内的培养基，用pbs清洗2遍后放入75％的乙醇固定液中中固定15min。

4)用棉签将transwell上室内细胞轻轻擦去，然后将小室置于结晶紫中染色15min。

5)取出小室，用pbs清洗3-5次去除多余细胞染液，然后在显微镜下进行观察。

6、细胞侵袭实验

将基质胶用无血清培养基1:20稀释，取100μl铺于小室内，4℃孵育过夜。剩余步骤同细胞迁移实验。

7、统计学分析

所有数据均为三次独立实验获得，按照mean士sd显示。组间差异使用配对样本t检验分析，p<0.05时表示差异具有统计学差异。

8、结果

1)转染结果显示，以rp11-830f9.5在对照组中(hepg2)的表达量作为基准定为1，转染结果显示，相比对照组，实验组在转染过表达rp11-830f9.5的载体后rp11-830f9.5的表达水平(5.38±0.707)显著上调(对照组vs实验组，p值＝0.0086，**)，而转染空载的阴性对照组中的rp11-830f9.5的表达水平(0.94±0.0265)则无显著变化(对照组vs阴性对照组，p值＝0.0591，ns)

2)细胞增殖实验结果，相比阴性对照组的细胞增殖活性(1.25±0.0935)，实验组的细胞增殖活性显著降低(0.67±0.0765)(阴性对照组vs实验组，p＝0.0004，***)，说明rp11-830f9.5影响肝癌细胞的增殖，提示rp11-830f9.5可作为分子靶标应用于肝癌的治疗。

3)细胞迁移和侵袭实验结果显示，相比迁移实验的阴性对照组(184.7±10.21)，迁移实验的实验组的细胞穿膜数显著降低(95±6.557)，差异具有统计学意义(阴性对照组vs实验组，p＝0.0108，*)，说明增加rp11-830f9.5的表达水平可以降低细胞的迁移能力，提示rp11-830f9.5可应用于肝癌转移的治疗；相比侵袭实验的阴性对照组(134.7±9.074)，侵袭实验的实验组的细胞穿膜数显著降低(68.33±10.02)，差异具有统计学意义(阴性对照组vs实验组，p＝0.0259，*)，说明增加rp11-830f9.5的表达水平可以降低细胞的侵袭能力，提示rp11-830f9.5可应用于肝癌浸润的治疗。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110>山东第一医科大学第二附属医院

山东第一医科大学（山东省医学科学院）

<120>lncrna及其在疾病中的应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gaacacgctggctctgag18

<210>2

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aaccttagacacgctgtattgaa23

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aatcccatcaccatcttccag21

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gagccccagccttctccat19