本发明涉及一种从蔗糖异构酶酶解液中分离制备海藻酮糖的方法，属于功能性糖分离制备领域。
背景技术：
蔗糖作为传统的甜味剂在食品工业中的应用十分广泛，然而，食用过多的蔗糖却会引起肥胖或龋齿，随着人们生活水平的提高和对健康的日益重视，蔗糖作为普遍使用的甜味剂，已不适合肥胖、糖尿病等特殊人群的需求，人们对非致龋齿性的、适合特殊人群的、具有特殊功能的新型甜味剂的需求日益增长(ravaud,s.,robert,x.,watzlawick,h.,etal.trehalulosesynthasenativeandcarbohydratecomplexedstructuresprovideinsightsintosucroseisomerization.journalofbiologicalchemistry,2007,282,28126–28136.)。
海藻酮糖(trehalulose)是异麦芽酮糖(isomaltulose)和蔗糖(sucrose)的同分异构体，其分子量为342，分子式为c12h22o11，自然界中仅在蜂蜜、花粉和果实中有少量发现(nakajima,y.,sugitani,t.,tanaka,m.,etal.occurrenceoftrehalulose,1-o-a-d-glucopyranosyl-d-fructose,innectarhoney.foodscienceandtechnology,1990,37,554–558.)。蔗糖在蔗糖异构酶的催化作用下，会发生异构反应，生成异麦芽酮糖和海藻酮糖(李莎,徐虹.微生物来源的蔗糖异构酶的研究进展及应用.化工进展,30,1326–1331.)，在此过程中，会有少量蔗糖水解为葡萄糖和果糖。
海藻酮糖的甜度约为蔗糖的60％，口感与蔗糖接近。由于海藻酮糖具有甜度低、非龋齿性，因此作为替代蔗糖的新型甜味剂具有非常大的潜力。但是由于海藻酮糖的溶解度高，采用结晶的方式很难获得产品，目前对它的分离制备研究很少。
从蔗糖异构酶酶解液中分离提取海藻酮糖，是目前最易形成工业化生产的方法。但是由于产物为混合物，同时存在的异麦芽酮糖和蔗糖与海藻酮糖仅仅是糖苷键连接不同的异构体，所以很难获得高纯度的海藻酮糖。veronese以及kishihara等人利用制备型色谱和模拟移动床吸附分离纯化的方法得到了高纯度的海藻酮糖(veronese,t.,bouchu,a.,&perlot,p.rapidmethodfortrehaluloseproductionanditspurificationbypreparativehigh-performanceliquidchromatography.biotechnologytechniques,1999,13,43–48.)。cookson等人用四种反相液相色谱制备分离方法对海藻酮糖混合物进行分离纯化，得到少量的高纯度海藻酮糖(cookson,d.,cheetham,p.,&rathbone,e.preparativehighperformanceliquidchromatographicpurificationandstructuraldeterminationof1-o-a-d-glucopyranosyl-d-fructose(trehalulose).journalofchromatographya,1987,402,265–272.)。但是这些制备方法所用仪器价格昂贵，得率低。
目前尚未有用hilic方法对海藻酮糖的分离制备进行研究的报道。
技术实现要素：
获得海藻酮糖标准品，为含有海藻酮糖的产品中海藻酮糖的定性、定量分析是非常重要的。同时从蔗糖异构酶酶解液结晶异麦芽酮糖之后的废糖浆中，对海藻酮糖进行分离制备，除了能够获得海藻酮糖之外，还可进一步提高异麦芽酮糖的收率，达到废物利用的效果。但是，由于海藻酮糖和异麦芽酮糖是同分异构体，极性强，很难进行分离。到目前为止，未见采用亲水色谱方法从蔗糖异构酶酶解液中进行海藻酮糖分离制备的报导。
蔗糖在蔗糖异构酶的催化作用下，会发生异构反应，所得蔗糖异构酶酶解液中包含异麦芽酮糖、海藻酮糖以及少量的葡萄糖和果糖。其中，蔗糖异构酶催化蔗糖发生异构反应为本领域常规技术手段。
为实现上述目的，本发明提供了一种从蔗糖异构酶酶解液中分离制备海藻酮糖的方法，
(1)对蔗糖异构酶酶解液进行脱色；
(2)对脱色后的蔗糖异构酶酶解液进行固相萃取处理，除去大分子杂质以及残余色素；
(3)对固相萃取后的蔗糖异构酶酶解液进行浓缩；
(4)对浓缩后的蔗糖异构酶酶解液在色谱柱上进行亲水作用色谱分离制备，收集海藻酮糖馏分、进行浓缩，获得海藻酮糖。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)所述脱色采用大孔树脂或离子交换树脂。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中的蔗糖异构酶酶解液为由蔗糖通过蔗糖异构酶异构反应所得到的酶解液，或者是由蔗糖通过蔗糖异构酶异构反应得到酶解液后，酶解液进一步生产异麦芽酮糖后得到的废糖浆。
进一步地，上述技术方案中，步骤(1)中的蔗糖异构酶酶解液进行脱色时的上样量为：按照蔗糖异构酶酶解液中还原糖含量计算，上样量为大孔树脂质量的0.1％－10％。
进一步地，上述技术方案中，采用大孔树脂对蔗糖异构酶酶解液进行脱色时，所述脱色的方法为：采用体积比10％－20％乙醇-水溶液对大孔树脂进行淋洗、再采用体积比30％－60％乙醇-水溶液对大孔树脂进行洗脱，淋洗和洗脱所用乙醇-水溶液的体积为3－10倍柱体积，收集洗脱液进行浓缩。
进一步地，上述技术方案中，步骤(2)的固相萃取采用c18spe填料，固相萃取处理中蔗糖异构酶酶解液的上样量按照还原糖的含量计算，为c18spe填料质量的0.2％－20％；固相萃取处理的淋洗液为水，淋洗液体积为1－10倍柱体积，收集上样液和淋洗液并合并。
进一步地，上述技术方案中，步骤(4)所述色谱柱的色谱柱填料是以硅胶为基质的键合材料，所述键合材料的键合相为亲水基团，所述亲水基团包括-nh2，-oh，酰胺基团及两性离子。
进一步地，上述技术方案中，色谱柱填料为以硅胶为基质，键合两性离子时，所述两性离子包括半胱氨酸、组氨酸中的一种或两种。
进一步地，上述技术方案中，所述色谱柱的色谱柱填料的粒度为2－20微米，色谱柱的内径为2.1－100毫米，色谱柱柱长为50－500毫米；亲水作用色谱分离制备采用的流动相为乙腈或甲醇与水混合，其中乙腈或甲醇不含或含有0.1－1v％甲酸，水相中不含或含有0.1－1v％甲酸；洗脱条件按水相体积分数5－30％等度或经10－50分钟水相体积分数由5－10％提高到30－50％梯度进行；制备时流动相流速为0.2－100ml/min，柱温为室温或25－40℃，进样量以还原糖质量记，为色谱柱填料的0.05－2wt％；检测器为示差折光检测器或者蒸发光散射检测器，收集海藻酮糖馏分，旋转蒸发、冷冻干燥，得到海藻酮糖。
进一步地，上述技术方案中，浓缩的方式包括真空旋转蒸发。
本发明的有益效果：
1.采用亲水色谱分离技术，通过选用合适的色谱柱和色谱分离制备条件，从蔗糖异构酶酶解液中得到海藻酮糖。
2.得到的海藻酮糖纯度高，最高可以达到90％以上。
3.本发明所涉及的从蔗糖异构酶酶解液或者含有海藻酮糖的废糖浆中制备高纯度海藻酮糖的方法，仪器自动化程度高，操作方便、简单，常温常压下就可进行，适合大规模制备的需要。
具体实施方式
下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
蔗糖通过蔗糖异构酶异构反应得到蔗糖异构酶酶解液，所述蔗糖异构酶酶解液中含有海藻酮糖。
将蔗糖异构酶酶解液500ml浓缩至25ml，其中，蔗糖异构酶酶解液中还原糖浓度为500mg/ml。先将浓缩后的蔗糖异构酶酶解液用大孔树脂ab-80进行脱色，上样量以还原糖质量记，为大孔树脂质量的0.1％，用体积比10％的乙醇淋洗，用体积比30％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩。将浓缩后的脱色后的蔗糖异构酶酶解液，用c18spe固相萃取柱进行大分子杂质去除，同时可以去除一些残余色素。上样量以还原糖质量计算，为c18spe填料的0.2wt％，用水淋洗spe柱，淋洗体积为1倍柱体积，收集上样液和淋洗液、合并。
在旋转蒸发仪上，将c18spe的上样液和淋洗液进行浓缩。用粒径2微米的sio2-cys(以sio2为基质，键合半胱氨酸得到的填料)填料装柱，柱径2.1mm，柱长50mm，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用体积比5％水相等度洗脱，柱温为室温，流动相流速为0.2ml/min，进样量以还原糖质量记，为色谱柱填料的0.05wt％，示差折光检测器，收集40－50分钟含有海藻酮糖的洗脱组分，旋转蒸发去除有机相，然后进行冻干，得到粉末状海藻酮糖，经液相色谱分析，纯度为85％。
实施例2
蔗糖通过蔗糖异构酶异构反应生产蔗糖异构酶酶解液后，得到的蔗糖异构酶酶解液进一步用于生产异麦芽酮糖，得到废糖浆，所述废糖浆中含有海藻酮糖。
将蔗糖异构酶酶解液500ml浓缩至25ml，其中，蔗糖异构酶酶解液中还原糖浓度为500mg/ml。先将浓缩后的蔗糖异构酶酶解液用大孔树脂d-101进行脱色，上样量以还原糖质量记，为大孔树脂质量的10％，用体积比10％的乙醇淋洗，用体积比60％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩。将浓缩后的脱色后的蔗糖异构酶酶解液，用c18spe固相萃取柱进行大分子杂质去除，同时可以去除一些残余色素。上样量以还原糖质量记，为c18spe填料的20wt％，用水淋洗spe柱，淋洗体积为10倍柱体积，收集上样液和淋洗液、合并。
在旋转蒸发仪上，将c18spe的上样液和淋洗液进行浓缩。用粒径20微米的sio2-his(以sio2为基质，键合组氨酸得到的填料)填料装柱，柱径100mm，柱长500mm，流动相选择甲醇为有机相，水为水相，采用体积比30％水相等度洗脱，柱温为25℃，流动相流速为100ml/min，进样量以还原糖质量记为色谱柱填料的2wt％，示差折光检测器，收集10－15分钟含有海藻酮糖的洗脱组分，旋转蒸发去除有机相，然后进行冻干，得到粉末状海藻酮糖，经液相色谱分析，纯度为75％。
实施例3
蔗糖通过蔗糖异构酶异构反应得到蔗糖异构酶酶解液，所述蔗糖异构酶酶解液中含有海藻酮糖。
将蔗糖异构酶酶解液500ml浓缩至25ml，其中，蔗糖异构酶酶解液中还原糖浓度为500mg/ml。先将浓缩后的蔗糖异构酶酶解液用大孔树脂ab-8进行脱色，上样量以还原糖质量记，为大孔树脂质量的5％，用体积比20％的乙醇淋洗，用体积比60％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩。将浓缩后的脱色后的蔗糖异构酶酶解液，用c18spe固相萃取柱进行大分子杂质去除，同时可以去除一些残余色素。上样量以还原糖浓度计算，为c18spe填料的10wt％，用水淋洗spe柱，淋洗体积为5倍柱体积，收集上样液和淋洗液、合并。
在旋转蒸发仪上，将c18spe的上样液和淋洗液进行浓缩。用粒径10微米的sio2-cys-his(以sio2为基质，键合半胱氨酸和组氨酸得到的填料)填料装柱，柱径20mm，柱长250mm，流动相选择乙腈(含0.1v％甲酸)为有机相，水(含0.1％v甲酸)为水相，采用体积比20％水相等度洗脱，柱温为40℃，流动相流速为20ml/min，进样量以还原糖质量记为色谱柱填料的1wt％，示差折光检测器，收集45－55分钟含有海藻酮糖的洗脱组分，旋转蒸发去除有机相，然后进行冻干，得到粉末状海藻酮糖，经液相色谱分析，纯度为99％。
实施例4
蔗糖通过蔗糖异构酶异构反应得到蔗糖异构酶酶解液，所述蔗糖异构酶酶解液中含有海藻酮糖。
将蔗糖异构酶酶解液500ml浓缩至25ml，其中，蔗糖异构酶酶解液中还原糖浓度为500mg/ml。先将浓缩后的蔗糖异构酶酶解液用大孔树脂ab-8进行脱色，上样量以还原糖质量记，为大孔树脂质量的5％，用体积比20％的乙醇淋洗，用体积比60％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩。将浓缩后的脱色后的蔗糖异构酶酶解液，用c18spe固相萃取柱进行大分子杂质去除，同时可以去除一些残余色素。上样量以还原糖浓度计算，为c18spe填料的10wt％，用水淋洗spe柱，淋洗体积为5倍柱体积，收集上样液和淋洗液、合并。
在旋转蒸发仪上，将c18spe的上样液和淋洗液进行浓缩。用粒径5微米的商品化氨基色谱柱，柱径4.6mm，柱长250mm，流动相选择乙腈(含1％v甲酸)为有机相，水(含1％v甲酸)为水相，采用梯度洗脱，水相体积分数由体积比5％经10分钟提高到体积比30％，柱温为40℃，流动相流速为1ml/min，进样量以还原糖质量记为色谱柱填料的1wt％，蒸发光散射检测器，收集6－10分钟含有海藻酮糖的洗脱组分，旋转蒸发去除有机相，然后进行冻干，得到粉末状海藻酮糖，经液相色谱分析，纯度为60％。
实施例5
蔗糖通过蔗糖异构酶异构反应得到蔗糖异构酶酶解液，所述蔗糖异构酶酶解液中含有海藻酮糖。
将蔗糖异构酶酶解液500ml浓缩至25ml，其中，蔗糖异构酶酶解液中还原糖浓度为500mg/ml。先将浓缩后的蔗糖异构酶酶解液用大孔树脂ab-8进行脱色，上样量以还原糖质量记为大孔树脂质量的5％，用体积比20％的乙醇淋洗，用体积比60％的乙醇进行洗脱，收集洗脱液进行浓缩。将浓缩后的脱色后的蔗糖异构酶酶解液，用c18spe固相萃取柱进行大分子杂质去除，同时可以去除一些残余色素。上样量以还原糖浓度计算，为c18spe填料的10wt％，用水淋洗spe柱，淋洗体积为5倍柱体积，收集上样液和淋洗液、合并。
在旋转蒸发仪上，将c18spe的上样液和淋洗液进行浓缩。用粒径5微米的商品化酰胺基色谱柱，柱径4.6mm，柱长250mm，流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用梯度洗脱，水相体积分数由体积比10％经50分钟提高到体积比50％，柱温为40℃，流动相流速为1ml/min，进样量以还原糖质量记为色谱柱填料的1wt％，蒸发光散射检测器，收集10－20分钟含有海藻酮糖的洗脱组分，旋转蒸发去除有机相，然后进行冻干，得到粉末状海藻酮糖，经液相色谱分析，纯度为65％。