一种复合微生物菌剂及其制备方法和应用与流程

本发明涉及农业生产领域的土壤微生态调控技术，其涉及一种具有土壤微生物种群调控功能的复合微生物菌剂的制备和应用。主要表现在土壤拮抗、降解微生物和生物炭的综合运用。
背景技术：
：土壤是个复杂的生态系统，本身具有一定程度的净化能力。但是随着近年来人口的增多和经济的发展，人类活动中产生的废弃污染物的数量、种类和污染速度都远远超过了土壤自身净化能力，导致土壤内部环境质量恶化，土壤内部的平衡被打破，污染物的积累占据优势，从而导致土壤丧失正常生态修复功能。土壤污染通过种种直接或间接的途径，危害动物和人类的健康，土壤安全问题引起人类的日益关注。土壤微生态调控的实质是微生物的相互作用、生物降解或者生物转化，即微生物及其活动产物对其他微生物生命活动的作用、对有机污染物的分解作用和对无机污染物的钝化作用。利用土壤中的土著微生物的代谢功能，或者补充具有降解转化能力的工培微生物群，通过创造适宜环境条件，促进或强化微生物代谢功能，从而达到降解并最终消除污染物的目的。微生态调控技术日益受到社会重视。土壤环境常见的降解、转化污染物的微生物有细菌、真菌和放线菌，他们通过生命活动过程或者产物，实现对污染物进行吸收、沉淀、氧化和还原，来降低污染物在土壤中的毒性，如：特定微生物在活动中产生的醋酸、柠檬酸、乳酸等可促进有机污染物和铅的溶解，也可使土壤吸附固定的磷元素重新释放，提高植物对磷的利用率的同时，释放出的磷还能有效降低铅的生物可利用性。同时微生物还能调节土壤酶活性，有利于富集和贮存营养元素。微生物在活动中产生的腐殖酸，可增强植物的呼吸强度，达到促进生长发育的作用。伴随着经济作物的广泛种植，农业废弃物的大量产生，传统的处理方法既污染环境又浪费资源。将有机废弃物在低氧状态下生物质热解成生物炭，其不仅含有丰富有机质，其较大的比表面积、发达的孔隙结构，还赋予了其改善土壤物理结构、提高土壤有机碳含量、增加土壤肥力的协同作用，时可为微生物提供生存的空间。在全球资源日益匮乏、土壤环境污染问题日趋严重的今天，生物质炭是一种可再生能源，具有绿色且可持续发展的优势。拮抗微生物活性菌泥与生物炭的结合作为一种修复材料制造微生物菌剂，用于修复污染土壤，改良土壤微生态环境，具有很高的利用价值。技术实现要素：本发明根据拮抗微生物在土壤微生态调控方面的研究进展，从中筛选出最佳共生菌种组合，通过单独培养筛选高产菌种。筛选出的高产菌种为：植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、黑曲霉(aspergillusniger)、绿色木霉菌(trichodermaviride)、酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。本发明所述的拮抗复合微活性菌泥的生产方法，包括以下步骤：a.斜面培养：植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母15～38℃条件下培养2～6天，植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌15～42℃条件下培养1～3天。在本发明优选的实施方式中，步骤a斜面培养得到的菌种，通过取样器或通过接种环刮取培养后的菌种，并进一步用无菌水洗入培养基，以此作为步骤b以及种子培养的种子液。b.一级种子培养(摇瓶培养阶段)：将步骤a培养的菌种无菌条件下分别取1ml的种子液接入装量为20ml液体培养基的250ml三角瓶中。黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母15～38℃条件下，100～200r/min摇床培养2～6天；植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌15～42℃条件下静止培养1～3天，单菌种液体培养od600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子。c.二级种子培养：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将一级种子分别接种子发酵罐中。黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母15～38℃条件下搅拌速度为100～200/min，通气量为1:0.5～1.5,培养2～6天，植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌15～42℃条件下培养1～3天，制得二级种子。d.主体发酵：按液体培养基的体积比为5～20％的接种量，将二级种子分别接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。其中，步骤a、b、c中黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母所用的培养基是pda培养基，植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌所用的培养基是mrs培养基。固态培养基与液态培养基的区别在于固态培养基在制备过程中添加了适量的琼脂。其中，步骤d所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜3-20％、硫酸铵0.5～10％、蛋白胨0.5～5％、碳酸钙0.5～3％，余量为水。所述的高密度发酵培养可以采用补料分批培养(fbc)方式，其中补料碳源为:葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物。并且，培养过程分阶段调控发酵ph、溶解氧、搅拌转速和温度等条件。具体地说发酵培养过程包括:有氧培养阶段:起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1:1～1.5，调控发酵溶解氧5～15％，搅拌转速150-200r/min,搅拌间隔时间1～3小时，搅拌1～3分钟，温度25～35℃；微溶氧和厌氧培养阶段：24～96h，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间3～5小时，搅拌3～5分钟，使用碳酸钙调节ph保持稳定在3.8～4.5之间，温度25～35℃。e.离心分离：步骤d中的发酵液进行常规的过滤和离心分离后，得到拮抗微生物活性菌泥。生物炭的制备：生物炭通过用农业有机废弃物经封闭式内循环低温缺氧热解炭化技术制得。所述封闭式内循环低温缺氧热解炭化为将农业有机废弃物经粉碎、干燥后，置于封闭的炭化炉中，在缺氧的条件下通过外热源加热，使炉内物料温度达到400℃～450℃进行热解炭化。所述缺氧的条件为在外热源加热过程中碳化炉密封，加热过程不向炭化炉通入氧气或空气。所述内循环为加热过程中，炭化炉封闭，炭化炉内物料与气体于炉内循环，不与外界环境连通。所述炭化炉中物料热解碳化时间为1.5-16小时，在优选的实施方式中，炭化时间为5-8小时。所述农业废弃物包括但不限于具有有机质的废弃物，如植物的枝条、叶片、桔梗、木屑等。复合微生物菌剂的制备方法：将上述步骤e.离心分离得到的拮抗微生物活性菌泥与所述生物炭混合。生物炭与上述拮抗微生物活性菌泥按照质量比10:1-4进一步混配，搅拌均匀后35-40℃烘干造粒，获得粒径2-4mm的复合微生物菌剂颗粒。制得的复合微生物菌剂可以直接施用，也可以用作有机肥的发酵菌剂。在制备得到的复合微生物菌剂中，其中，植物乳杆菌1.5×108～1.0×1010cfu/g、枯草芽孢杆菌1.0×108～5.0×1010cfu/g、黑曲霉1.0×108～1.0×1010cfu/g、绿色木霉菌1.0×108～1.0×1010cfu/g、酿酒酵母5.0×108～1.0×1010cfu/g。优选地：植物乳杆菌为5.0×108～1.0×1010cfu/g,特别优选为1.0×109～6.0×109cfu/g；枯草芽孢杆菌为1.5×108～5.0×1010cfu/g，特别优选为5.0×108～5.0×109cfu/g；黑曲霉5.0×108～5.0×109cfu/g；绿色木5.0×108～5.0×109cfu/g；酿酒酵母1.6×109～6.0×109cfu/g。在本发明特别优选的实施方案中，植物乳杆菌1.5×109cfu/g、枯草芽孢杆菌1.0×109cfu/g、黑曲霉1.0×109cfu/g、绿色木霉菌1.0×109cfu/g、酿酒酵母1.5×109cfu/g。本领域技术人员通过领域内常规的技术对各菌种的量进行调节。在优选的实施方式中，在步骤d中，通过调节各菌种的加入量，进而调节制备得到的菌泥的各菌种比例。上述复合菌剂的菌量是基于最终得到的复合微生物菌剂测定得到的。上述各菌种的量是基于单位质量复合微生物菌剂中的各菌种的含菌量。本发明公开的复合菌剂，基于复合菌剂的总质量，生物炭的占比为65-95％。在本发明复合菌剂的使用方法中，将本发明的复合菌剂以底施的形式施入，于春季一次施足或春季种植时及秋收各一次施用，施入量为每年400公斤/亩。本发明有益技术效果体现如下:本发明产品可提供农、林、城市绿化植物提供生长发育所必需的各种营养元素，还能增加土壤中有益微生物的活性，同时克服了化肥的过量施用和不平衡施肥造成的弊端。此发明还担负着土壤有机质腐殖质转化的重任，增加土壤团粒结构，提高保水保肥能力，活化被土壤固化了的养分，提高化肥利用率，同时复合微生物菌剂中的有益微生物向土壤分泌各种有益物质，有效地促进养分的转化，减轻了土传病的发生，修复了污染的土壤，是农业种植、园林绿化种植、种苗培育的理想材料，在农业可持续发展中有着广阔前景。附图说明图1：封闭式内循环低温缺氧热解炭化技术示意图。具体实施方式下面结合实例对本发明举例说明，但不用来限制本发明所要保护的范围。一、复合微生物菌剂的制备方法实施例1：a.斜面培养：植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母30℃条件下培养3天，植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌37℃条件下培养2天。b.一级种子培养，摇瓶培养阶段：将步骤a培养的菌种无菌条件下分别取1ml的种子液接入装量为20ml液体培养基的250ml三角瓶中。黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母30℃条件下，150r/min摇床培养3天；植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌37℃条件下静止培养2天，单菌种液体培养od600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子。c.二级种子培养，种子罐培养阶段：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种子发酵罐中。黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母30℃条件下搅拌速度为180/min，通气量为1:1,培养4天，植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌37℃条件下培养2天，制得二级种子。d.主体发酵：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。其中，所述的高密度发酵培养采用补料分批培养方式，所用的培养基的配方按质量百分比为：糖蜜8％、硫酸铵6％、蛋白胨2.5％、碳酸钙2％，余量为水。高密度发酵培养可以采用补料分批培养(fbc)方式，其中补料碳源为:葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物。发酵培养过程包括：有氧培养阶段：起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1:1.2，调控发酵溶解氧10％，搅拌转速180r/min,搅拌间隔时间2小时，搅拌2分钟，温度30℃；微溶氧和厌氧培养阶段：60h，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间4小时，搅拌4分钟，使用碳酸钙调节ph保持稳定在4左右，温度30℃。e.离心分离：步骤d中的发酵液进行常用的离心分离后，得到拮抗微生物活性菌泥。f.复合微生物菌剂制备：选用农业废弃物经粉碎、干燥脱水后制得的生物炭和拮抗微生物活性菌泥按照质量比10﹕1混配，搅拌均匀后在40℃下烘干造粒，获得粒径2-4mm的复合微生物菌剂颗粒，含水量≤15％。实施例2：复合微生物菌剂的制备方法a.斜面培养：植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母25℃条件下培养2天，植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌25℃条件下培养1天。b.一级种子培养(摇瓶培养阶段)：将步骤a培养的菌种无菌条件下分别取1ml的种子液接入装量为20ml液体培养基的250ml三角瓶中。黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母25℃条件下，100～200r/min摇床培养2天；植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌25℃条件下静止培养1天，单菌种液体培养od600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子。c.二级种子培养：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将一级种子分别接种子发酵罐中。黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母25℃条件下搅拌速度为100/min，通气量为1:0.5,培养2天，植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌25℃条件下培养1天，制得二级种子。d.主体发酵：按液体培养基的体积比为15％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。其中，所述的高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物，发酵培养过程包括:有氧培养阶段:起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1:1，调控发酵溶解氧5％，搅拌转速150r/min,搅拌间隔时间1小时，搅拌1分钟，温度25℃；微溶氧和厌氧培养阶段：24h，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间3小时，搅拌3分钟，使用碳酸钙调节ph保持稳定在3.8之间，温度25℃。e.离心分离：步骤d中的发酵液进行常用的离心分离后，得到拮抗微生物活性菌泥。f.复合微生物菌剂制备：选用农业废弃物经粉碎、干燥脱水后制得的生物炭和拮抗微生物活性菌泥按照质量比5﹕1混配，搅拌均匀后在40℃下烘干造粒，获得粒径2-4mm的复合微生物菌剂颗粒，含水量≤15％。实施例3：复合微生物菌剂制备方法a.斜面培养：植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌、黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母原始菌种无菌条件下分别接种于固体培养基上，将黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母35℃条件下培养3天，植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌35℃条件下培养3天。b.一级种子培养(摇瓶培养阶段)：将步骤a培养的菌种无菌条件下分别取1ml的种子液接入装量为20ml液体培养基的250ml三角瓶中。黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母35℃条件下，100～200r/min摇床培养2～6天；植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌35℃条件下静止培养3天，单菌种液体培养od600值3.0-4.0之间时停止培养，制得一级种子。c.二级种子培养：按液体培养基的体积比为10％的接种量，将一级种子分别接种子发酵罐中。黑曲霉、绿色木霉、酿酒酵母35℃条件下搅拌速度为200/min，通气量为1:1.5,培养5天，植物乳杆菌、枯草芽孢杆菌35℃条件下培养3天，制得二级种子。d.主体发酵：按液体培养基的体积比为20％的接种量，将二级种子接种于发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。其中，所述的高密度发酵培养采用补料分批培养方式，其中补料碳源为：葡萄糖、甘油、蔗糖、糖蜜其中任一种或其混合物；氮源为：硫酸铵、牛肉膏、蛋白胨其中任一种或其混合物，发酵培养过程包括:有氧培养阶段:起始0～24小时内，间隔通气，保持在有氧条件发酵，通气量1:1，调控发酵溶解氧15％，搅拌转速200r/min,搅拌间隔时间3小时，搅拌3分钟，温度35℃；微溶氧和厌氧培养阶段：60h，保持发酵液上层微溶氧状态，静止培养，间隔搅拌，搅拌间隔时间5小时，搅拌5分钟，使用碳酸钙调节ph保持稳定在4.5之间，温度35℃。e.离心分离：步骤d中的发酵液进行常用的离心分离后，得到拮抗微生物活性菌泥。f.复合微生物菌剂制备：选用农业废弃物经粉碎、干燥脱水后制得的生物炭和拮抗微生物活性菌泥按照质量比5﹕2混配，搅拌均匀后在40℃下烘干造粒，获得粒径2-4mm的复合微生物菌剂颗粒，含水量≤15％。二、复合微生物菌剂的构成通过上述实施例1-3的制备方法，通过调整步骤d中，主体发酵过程中，活性菌种的加入量，进而得到如表1所述的复合菌剂。表1：复合微生物构成方案举例，单位：cfu/g。上述复合菌剂的菌量是基于最终得到的复合微生物菌剂测定得到的。三、复合微生物菌剂使用方法以底施的形式直接施用，施入量为每年200公斤/亩，视人工条件于春季一次施足(果树种植或在春季种植及秋收各一次施用).或者开环装沟，在树木周围施用，施用量根据树势大小决定，一般以树龄计大树每株施用约5公斤，小果或幼龄树可减半。用于改善土壤微生物种群结构、增加土壤肥力、降解有毒有害物质等目的。四、复合微生物菌剂的利用实验2019年在浦东新区进行了此复合微生物菌剂在园林绿化上的示范工作，示范区域原为生活垃圾处理中心和集中堆放点，后经复垦为小叶黄杨苗圃地，选用2月龄沙床苗移栽，观察周期为2年，示范面积10亩。示范过程中，除实验组在圃地准备和苗移栽第二年初春亩施加上述方案3所述的复合微生物菌剂200公斤外，实验组和对照组与往常的各项管理水平保持一致。实验组采用上述方案3的制备得到的生物菌剂进行实验。对照组未施加生物菌剂。根据如下数据可以发现，此复合微生物菌剂能有效改善园林绿化等土壤理化性质，促进有益微生物生长繁殖，同时抑制有害微生物的滋生繁衍，改善团粒结构；有效分解土壤中的矿物质、有机污染物，同时起到固定土壤重金属的作用；使作物根系发达，枝叶茂盛，增强植株抗病性，病虫害发生率，从而降低化肥、农药的使用频次。土壤活性：表2小叶黄杨根部微生物活性表3不同处理小叶黄杨根部土壤酶活性理化性质：表4不同处理小叶黄杨根部土壤理化性质生长表现表5生长情况记录组别根茎叶树形病虫害频次示范组扎根深，侧根多粗壮浓密、深绿球形，圆润2对照组根系一般细弱相对稀、偏黄不规整5当前第1页12