一种与大麦啤酒混浊性状相关的InDel分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，尤其涉及一种与大麦啤酒混浊性状相关的indel分子标记及其应用。

背景技术：

大麦(hordeumvulgarel.)是全球种植面积和产量仅次于玉米、小麦和水稻的第四大谷类作物，其用途广泛，主要用于食品、饲料与啤酒酿造。大麦作为酿造啤酒的主要原料，其品质优劣直接影响啤酒的商品质量及价值。啤酒是一种成分复杂、稳定性不强的胶体溶液，在贮存和运输过程中易发生混浊沉淀。啤酒混浊是一个严重的品质问题，因为它显著缩短啤酒的贮藏时间及货架时间。随着啤酒产业和消费的日益扩大，混浊问题亦日趋突出。因此，解决啤酒混浊问题是保证啤酒品质的重要组成部分。

麦芽作为酿制啤酒的原料，对混浊现象起有十分重要的作用。啤酒生产中发现，大麦原料对啤酒胶体溶液的稳定性和混浊形成有实质性的影响，不同品种的麦芽所酿制的啤酒，混浊度存在差异。因此，可以通过筛选不同啤酒混浊特性的大麦材料，实现对啤酒大麦的育种改良，最大程度地从源头上处理是解决啤酒混浊问题是最经济有效的方法。

一般，很多啤酒公司采用强制老化的方法预测啤酒的货架时间。该方法大致是将啤酒在特定的条件下保存一段时间后检测啤酒的浊度。测试条件一般根据试验目的，模拟市场保存条件而定。但这种测定方法需要时间长，故生产上广泛采用更为快捷的测定方法：即酒精冷混浊试验方法。该法大致步骤是：在待测啤酒样品中添加一定量酒精，于-8℃下冷冻后测定混浊值。一般认为啤酒的冷混浊测定值以20ebc为界限，高于20ebc为高混浊材料，而低于20ebc为低混浊材料。但这些方法均需收集大量的大麦种子，再进行长周期的制麦、制啤等步骤，同时还需加上繁琐的测定分析。因此传统大麦啤酒混浊特性测定分析方法过程繁琐复杂、需要种子量巨大，结果又难以准确可靠。

因此，准确、快速、简单地对大麦啤酒混浊特性进行鉴定，不仅有利于加快优质啤用大麦的相关育种进程，也有利于麦芽、啤酒产业对大麦原料的选择。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种与大麦啤酒混浊性状相关qtl位点紧密连锁的indel分子标记，同时提供了该indel分子标记在筛选大麦啤酒混浊性状中的应用，该分子标记hazy1-indel，在啤酒生产中可用于筛选不同混浊度的大麦原料，同时在大麦遗传育种领域可用于培育不同混浊度的大麦新品种。

具体技术方案如下：

一种与大麦啤酒混浊性状相关的indel分子标记，所述indel分子标记基于大麦啤酒混浊基因hazy1编码区起始位点atg下游70bp处存在的一段6bp缺失所设计；用于鉴定大麦的啤酒混浊性状；

所述大麦啤酒混浊基因hazy1编码区的核苷酸序列如seqidno.1所示；

所述6bp缺失的核苷酸序列为ccgctg(seqidno.4)。

上述indel分子标记与位于4号长臂端的qtl位点紧密连锁，该qtl位点显著控制大麦啤酒混浊性状，lod值为4.85，解释约20％的表型变异，结合大麦全基因组序列及注释等信息，锁定位于619905096bp附近的horvu4hr1g081640基因为关键的混浊基因，命名为hazy1基因。

进一步地，本发明根据上述indel分子标记位点涉及了扩增引物，用于扩增所述indel分子标记的引物对序列如下所示：

上游引物f为：5’-ccgtcatggtctccgtcttc-3’(seqidno.2)；

下游引物r为：5’-agtgtccgagcagattggtc-3’(seqidno.3)。

上述引物可有效筛选不同啤酒混浊性状的大麦种质资源，准确率达100％。

本发明还提供了所述indel分子标记以及所述引物在大麦分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了所述indel分子标记以及所述引物在啤酒生产中筛选不同混浊性状的大麦种质资源的应用。

具体的，所述应用包括以下步骤：

(1)提取待测大麦植株的基因组dna；

(2)以步骤(1)所述基因组dna为模板，利用所述引物对进行pcr扩增反应；

(3)检测pcr扩增产物，若扩增产物为90bp的dna条带，则该待测大麦植株为高啤酒混浊型种质；若扩增产物为96bp的dna条带，则该待测大麦植株为低啤酒混浊型种质。

其中，90bp的dna条带的核苷酸序列如seqidno.5所示；96bp的dna条带的核苷酸序列如seqidno.6所示。

进一步地，pcr扩增的反应体系50μl体系，包括2×taqmastermix(dyeplus)25μl，10μmol/lprimer各2μl，100ng/μl模板dna2μl，无菌水21μl。

进一步地，pcr扩增的程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。

进一步地，采用3％的琼脂糖凝胶电泳检测pcr扩增产物。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次公开了一个大麦啤酒混浊性状qtl紧密连锁的indel分子标记，该分子标记为共显性标记，检测准确高效、扩增方便稳定，可用于分子标记辅助选择，提高不同混浊特性大麦品种的鉴定效率。

附图说明

图1为实施例2中pcr扩增产物的电泳结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的分子标记和应用进行详细说明，但不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明所使用的大麦材料可从浙江大学作物所得到。本发明所使用生化试剂均为市售。

实施例1

(1)供试材料

利用栽培大麦franklin、yerong两者构建的120个dh系为材料。对这120份材料进行统一栽培收获种子，干燥保存待用。

(2)性状测定

收获的大麦种子按下述方法进行微型制麦：称取200克种子清洗干净后于15℃条件下进行浸水5小时、断水8小时、浸水8小时、断水12小时、浸水3小时、断水1小时后再发芽82小时。发芽结束后，进行烘干处理。烘干的麦芽进行去根后，进行酿酒试验。

酿酒试验方法如下：(1)称取50g麦芽以10目大小进行粉碎；(2)将麦芽粗粉按协定糖化法于糖化仪进行糖化；(3)按1:8的投料比进行稀释；(4)将麦汁用磷酸调ph至5.4左右，分装100ml到250ml的三角瓶中，进行灭菌(105℃，30min)；(5)在超净台上往灭菌后的麦汁中按0.6‰的比例接种啤酒酵母(jjb,英国)，装上发酵栓后，在8℃的培养箱中发酵13d，每12h摇匀一次。(6)取出发酵结束后的麦汁，过滤得到澄清的啤酒，用于混浊性状测定。

混浊度的测定方法为：在酿制的啤酒中添加5％的酒精,于-8℃经40min冷冻后采用浊度计进行浊度测定。

将上述120份材料进行统一的制麦、酿酒、测定步骤后得到这120份大麦材料的混浊特性。

(3)qtl分析及候选基因的确定

结合上述混浊测定值和该群体的遗传图谱，采用qtlnetwork软件进行qtl分析，结果显示位于4号长臂端的一个qtl与表型显著连锁，lod值为4.85，解释约20％的表型变异。结合大麦全基因组序列及注释等信息，锁定位于619905096bp附近的horvu4hr1g081640基因为关键的混浊基因，命名为hazy1基因，序列如下(seqidno.1所示)：atggcgtgcaagtccagccgcagtctcctcctcttggccaccgtcatggtctccgtcttcgccgccgctgccgctgccgccgccgccaccgactgctccccaggggtggcttttccgaccaatctgctcggacactgccgcgactatgtgttacagcagacttgtgccgtcttcactcccgggtcgaagttacccgaatggatgacatccgcggagctgaactaccccgggcagccatacctcgccaagttgtattgctgccaggagctcgcagaaattccccagcagtgccggtgcgaggcgctgcgctacttcatggcgttgccggtaccgtctcagcccgtggacccgagcaccggcaatgttggtcagagcggcctcatggacctgcccggatgccccagggagatgcaacgggacttcgtcagattactcgtcgccccggggcagtgcaacttggcgaccattcacaacgttcgatactgccccgccgtggaacagccgctgtggatctag

实施例2

(1)供试材料

利用栽培大麦franklin、yerong两者构建的20个dh系为材料，分别包括10份高混浊种质材料及低混浊种质材料，具体如表1所示。

表120份不同混浊特性的大麦种质材料

对上述20份大麦材料进行hazy1基因的cds序列比对，比对结果显示低混浊大麦材料的hazy1基因的cds起始位点atg下游70bp处存在ccgctg，而高混浊大麦材料的序列中不包含ccgctg。

(2)hazy1-indel标记的获得

根据上述6bp的缺失位点，设计一对indel标记引物，上游引物为5’-ccgtcatggtctccgtcttc-3’，下游引物为5’-agtgtccgagcagattggtc-3’。

(3)dna提取

以苗期新鲜叶片为材料，采用ctab法提取dna，详细步骤如下：

a)取大麦嫩叶3～5g左右，在液氮中研成粉末，取1g左右加入65℃保温的ctab提取缓冲液中，65℃水浴30～60min，其间轻摇3～5次；

b)加等体积的氯仿：异戊醇(24:1)溶液，并充分摇匀；经10000rpm离心5min，将上清夜转入一个新的离心管中；

c)加入等体积冰异丙醇，上下摇匀，在-20℃下静置20min以沉淀dna；

d)10000rpm离心5min，弃去上清夜；70％乙醇清洗两次，风干后溶于te中。置于-20℃待用。

(4)pcr反应及电泳检测

pcr扩增反应体系为：2×taqmastermix(dyeplus)(南京诺唯赞生物科技股份有限公司)25μl，10μmol/lprimer各2μl，100ng/μl模板dna2μl，无菌水21μl，反应总量50μl。

pcr反应在bio-radt100热循环仪上进行，反应程序包括：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。反应产物在3％的琼脂糖凝胶电泳检测。

(5)电泳结果分析

利用indel标记对20份供试材料进行基因型检测，结果如图1所示。其中，图1中泳道编号与表1材料编号对应，高混浊特性材料能扩增出90bp的dna条带，而低混浊特性材料能扩增出96bp的dna条带。其中，90bp的dna条带的核苷酸序列如seqidno.5所示；96bp的dna条带的核苷酸序列如seqidno.6所示。

序列表

<110>浙江大学

<120>一种与大麦啤酒混浊性状相关的indel分子标记及其应用

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>516

<212>dna

<213>大麦(hordeumvulgarel.)

<400>1

atggcgtgcaagtccagccgcagtctcctcctcttggccaccgtcatggtctccgtcttc60

gccgccgctgccgctgccgccgccgccaccgactgctccccaggggtggcttttccgacc120

aatctgctcggacactgccgcgactatgtgttacagcagacttgtgccgtcttcactccc180

gggtcgaagttacccgaatggatgacatccgcggagctgaactaccccgggcagccatac240

ctcgccaagttgtattgctgccaggagctcgcagaaattccccagcagtgccggtgcgag300

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tactgccccgccgtggaacagccgctgtggatctag516

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ccgtcatggtctccgtcttc20

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agtgtccgagcagattggtc20

<210>4

<211>6

<212>dna

<213>大麦(hordeumvulgarel.)

<400>4

ccgctg6

<210>5

<211>90

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ccgtcatggtctccgtcttcgccgccgctgccgccgccgccaccgactgctccccagggg60

tggcttttccgaccaatctgctcggacact90

<210>6

<211>96

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ccgtcatggtctccgtcttcgccgccgctgccgctgccgccgccgccaccgactgctccc60

caggggtggcttttccgaccaatctgctcggacact96