一种新型荧光检测试剂及定量检测体内外CO的技术的制作方法

一种新型荧光检测试剂及定量检测体内外co的技术
技术领域
1.本发明涉及一种新型荧光检测试剂及定量检测体内外co的技术，属于分析检测技术领域。


背景技术：

2.一氧化碳（carbon monoxide, co）极易与血红蛋白结合，形成碳氧血红蛋白，使之丧失携氧的能力和作用，从而造成组织窒息，甚至造成死亡。研究报道，当空气中co浓度达到100ppm（约3.57mm）时，人体就会产生头晕、乏力等不适感，随着co浓度的增加，会进一步产生头痛、呕吐、昏迷等症状，当co浓度超过600ppm（约21.43mm）时，短期内会引起窒息死亡。因此，无色，无味、无刺激性的co一直被认为是一种有毒气体，并被称之为“无声杀手”。20世纪70年代有研究表明，血红素氧化酶酶解血红素的过程中会产生内源性co，且它与h2s等气体信号小分子一样，在神经、心脑血管和免疫系统等机体调节的生理和病理方面都发挥着重要的作用。同时，内源性co还具有抑制气道平滑肌细胞增殖、预防高氧及缺血性肺损伤、抑制内皮细胞凋亡等作用。然而，由于缺乏一种有效的方法来监测其在生物系统中的分布，目前的研究对co细胞机制的了解仍然不够明确。因此，开发简单有效的检测体内外co含量的新方法具有重要的意义。
3.尽管已经建立了一些可用于co监测的方法，如比色检测，电化学分析和气相色谱法等，但这些方法通常受到侵入方式的限制而无法实时追踪生物样品。与传统方法相比，荧光探针由于高灵敏度、高特异性、无损实时检测和高时空分辨率等优势而具有很高的吸引力。迄今为止，已经一些用于co检测和生物成像的荧光探针被报道。如cn 106366041 b报道了一种连续识别钯离子、co的荧光探针pipd，由于具有聚集诱导发光效应，该探针可在水相中高选择性识别二价钯离子，当钯离子配位后，荧光淬灭，而当加入co后，荧光继续淬灭。然而，作为额外底物或对co的催化响应的贵金属钯离子并不适合于生物探针，因为它们对免疫系统具有极大的致敏性和致毒性，且对dna合成的有抑制作用，甚至会导致癌变。因此，开发一种安全的无铅化荧光分子探针以测定生命系统中的co具有重要意义。cn 110229105 a报道了一个可直接识别细胞内质网中co的荧光探针，当向其加入co后，525 nm处荧光显著增强，从而实现了co的高灵敏度、高特异性检测。然而该探针的最大发射波长较短，导致其组织穿透能力较弱且容易受到细胞和组织背景荧光的干扰，限制了其大规模使用。因此，开发一种高灵敏度、强特异性、长波长发光的co荧光分子探针以实现其在细胞中的检测，具有迫切性和重要的意义。


技术实现要素：

4.针对现有技术中的问题，本发明的目的在于提供一种可实现体内外co定量检测的荧光技术。
5.本发明的第二个目的在于提供上述技术中荧光分子探针的高效制备方法。
6.本发明的第三个目的在于提供上述荧光分子探针在体内外co检测的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
8.本发明提供了一种新型荧光检测试剂，该试剂所用荧光探针的结构式如式ⅰ所示：式i上述荧光探针的制备方法，包括以下步骤：1)将化合物1和化合物2溶解于5ml浓硫酸中，并于90oc下加热回流，tlc监测至反应结束后，取下反应，冷却至室温，倒入冰水中，并加入1ml高氯酸，可见大量沉淀析出，抽滤、收集、洗涤滤饼，并用乙醇重结晶，可得化合物3；2)将纯化后的产物、水合肼和bop加入50ml圆底烧瓶中，并加入10ml二氯甲烷溶解。将反应体系置于室温下搅拌反应，tlc监测至反应结束。取下反应，减压除去溶剂，经柱层析纯化后，可得化合物4；3)将纯化后的产物和2-吡啶甲醛盐溶解在10ml无水甲醇中，并于室温搅拌反应至结束。反应结束后，减压除去溶剂，经柱层析纯化后，可得目标分子探针；上述目标分子探针的制备反应式如下：本发明还提供了一种上述的分子荧光探针的应用，所述荧光探针可以应用于水环境和生物细胞体系中co的含量传感检测。该探针的检测原理如下：
相对现有技术，本发明的技术方案带来的有益技术效果：本发明所涉及的一种新型荧光检测试剂及定量检测体内外co的技术，具有以下优势：（1）本发明所提供的荧光检测试剂具有水溶性好、特异性高的优点，能够避免其他待测物的干扰，有利于环境中co的快速检测，在环境科学领域具有较强的实际应用价值。
9.（2）该探针具有较强的红光发射，能有效避免生物自发荧光的干扰，细胞膜渗透性好，细胞毒性小，能够用于co的生物成像，在生命科学领域具有较强的实际应用价值，可用于体内外co的定量分析检测。
附图说明
10.【图1】本发明实施中荧光检测试剂的荧光强度随co浓度变化的发射光谱图；【图2】本发明实施中荧光检测试剂的荧光强度和co浓度的线性关系;【图3】本发明实施中荧光检测试剂对co的选择性图；【图4】本发明实施中荧光检测试剂对空气中co的荧光响应图【图5】本发明实施中荧光检测试剂在hela细胞内荧光共聚焦成像图。
具体实施方式
11.以下实施方式旨在进一步阐释说明本发明而不是对本发明的限定。
12.实施例1化合物3的合成将化合物1 (1.56 g, 5mmol) 和化合物2 (1.30 g, 5mmol) 溶解于5ml浓硫酸中，并于90oc下加热回流，tlc监测至反应结束后，取下反应，冷却至室温，倒入冰水中，并加入1ml高氯酸，可见大量沉淀析出，抽滤、收集、洗涤滤饼，用乙醇重结晶，可得深绿色固体1.50 g，产率为55.7 %。
13.化合物4的合成室温下，将化合物3 (1.34 g, 2.5mmol)，水合肼(1.64ml, 25mmol)和bop(1.13 g, 2.6mmol) 加入50ml的圆底烧瓶中，并加入10ml二氯甲烷溶解。将反应体系置于室温下搅拌
反应，tlc监测至反应结束。取下反应，减压除去溶剂，经柱层析纯化后，可得黄色固体1.12 g, 产率为78.3 %。1h nmr (400 mhz, dmso-d6): δ=7.93 (d, j=7.6 hz, 1h), 7.78 (t, j=7.2, 1h), 7.58 (t, j=7.2, 1h),7.53(s, 1h), 7.49 (d, j=7.6 hz, 1h), 7.41(t, j=7.8 hz, 1h), 6.70-6.67 (m, 2h), 6.52 (s, 1h), 6.22 (d, j=6.8 hz, 1h), 6.15 (s, 1h), 5.47(s,1h), 3.38 (q, j=6.8 hz, 4h), 3.31 (q, j=6.8 hz, 4h), 1.17-1.13(m, 12h).目标分子探针的合成将化合物4（550.65 mg, 1mmol）和2-吡啶甲醛盐（240.05 mg, 1mmol）溶解在10ml无水甲醇中，并于室温搅拌反应至结束。反应结束后，减压除去溶剂，经柱层析纯化后，可得红色固体638.63 mg, 产率为81.7 %。1h nmr (400 mhz, cdcl3): δ=9.13(d, j=7.2, 1h), 8.48 (t, j=8.2, 1h), 8.01 (t, j=8.2, 1h), 7.91 (d, j=7.6 hz, 1h), 7.82 (t, j=7.2, 1h), 7.60-7.56 (m, 2h), 7.50(s, 1h), 7.43-7.40 (m, 2h), 7.18 (d, j=7.6 hz, 1h), 6.88 (d, j=8.2 hz, 1h), 6.69 (d, j=8.0 hz, 1h), 6.54 (s, 1h), 6.20 (d, j=6.8 hz, 1h), 6.13 (s, 1h), 5.47 (s, 1h), 4.39 (s, 3h), 3.41 (q, j=7.2 hz, 4h), 3.31 (q, j=7.1 hz, 4h), 1.16 (t, j=7.0 hz, 6h), 1.21 (t, j=7.1 hz, 6h). hrms-esim/z: calc. for [m-i]
+
:654.3074; found, 654.3719。
[0014]
实施例2荧光检测试剂对不同浓度co的响应配制5ml浓度为1mm co的水溶液及浓度为1mm的实施例1制备的荧光检测试剂作为备用。用pbs缓冲溶液（10mm，ph=7.4)稀释，调节到溶液中含有探针化合物的浓度为10 μm，而co的浓度为0μm、1μm、2μm、4μm、7μm、10μm、15μm、20μm、30μm，室温孵育20 min后，分别在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱（图1）。计算各体系中荧光强度，建立荧光强度与co浓度标准曲线。如图2所示，当co的浓度处于0-4μm的范围区间时，荧光强度与co的浓度有着良好的线性关系，回归线性方程为 y=18.56897x+6.60021，线性相关系数为：0.99153，并计算出检测限 (lod)为1.02μm(s/n＝3)，表明该荧光探针具有良好的灵敏度。
[0015]
实施例3荧光检测试剂对co的选择性配制5ml浓度为50mm的各种常规的离子及氨基酸的pbs水溶液及浓度为1mm实施例1制备的荧光检测试剂作为备用。用pbs缓冲溶液（10mm，ph=7.4)稀释，调节到溶液中含有探针化合物的浓度为10μm，co的浓度为30μm，而o
2-、
·
oh、h2o2、hocl、onoo-、cn-、h2s、gsh的浓度为100μm。室温孵育20 min后，分别在10 mm的比色皿中测试不同体系的荧光光谱（图3）。结果表明，其他待测物对荧光分子探针的荧光几乎没有影响，而co的加入使荧光分子探针的荧光显著增强。
[0016]
实施例4荧光检测试剂对co气体的响应据研究报道，当空气中co的浓度达到100ppm（约3.57mm）时，人体就会产生头晕、乏力等不适感。向10μm的荧光检测试剂中通入含有co气体的空气（其中，co的浓度为3.57mm），室温孵育20 min后，在紫外灯下观察其荧光，并与荧光检测试剂本身比较（图4）。结果表明，荧光检测试剂的荧光由无荧光变为明亮的红色荧光，可用于检测空气中的co。
[0017]
实施例5荧光检测试剂对细胞中co的响应首先在hela培养基中加入探针溶液，置于 37oc，5 %的co2氛围下在培养箱中孵育30 min，然后用 pbs 缓冲液洗涤三次，除去未进入细胞的探针分子，移至荧光显微镜下成像，然后更换培养基，再由co缓冲溶液（30μm）培养30分钟，用 pbs 缓冲溶液洗三次，置于荧光显微镜下观察其荧光变化，结果如附图4所示。实验表明进入细胞体内的探针分子和co发生了反应，因此该荧光探针对细胞中的co有良好的成像作用，可用于检测生物体内的co。
[0018]
上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明范围的限制，本领域的相关技术人员能从发明公开的内容不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围之内。