一种金黄色大球盖菇菌株的制作方法

[0001]
本发明属于食用菌育种领域，具体涉及一种金黄色大球盖菇菌株，尤其是一株适合大田、林下等推广种植的金黄色大球盖菇菌株。


背景技术：

[0002]
大球盖菇(stropharia rugosoannulata farlow)隶属于球盖菇科 (strophariaceae)，球盖菇属(stropharia)，是国际菇类交易市场上的十大品种之一[1]。欧洲、北美洲，亚洲等地均有野生大球盖菇的种质资源，我国野生大球盖菇主要分布于云南、四川、西藏、吉林等地。1969年东德首次人工驯化栽培成功，随后波兰、匈牙利、前苏联等地区规模栽培，成为了许多欧美国家人工栽培的食用蕈菌，我国于1980年由上海市农业科学院食用菌研究所引进波兰菌种，并试栽成功，近年来在全国各地均有规模栽培[2]。大球盖菇含蛋白质、多糖、矿质元素、维生素等生物活性物质，氨基酸含量达17种，人体必需氨基酸齐全，并且原料来源广泛，种植技术粗放简单，是一种可以大量消耗农业废弃物，变废为宝的真菌[3-4]。
[0003]
目前栽培的大球盖菇菌盖为酒红色或暗褐色，也被称作酒红球盖菇，菌种的获得主要通过野生分离驯化、单孢杂交等途径获得。2018 年四川叙永县报道发现白色大球盖菇，2019年郭耀辉、金伟、杨敬等申请了“一种白色大球盖菇栽培器”的实用新型专利，不过关于白色大球盖菇生物学研究及其可否具遗传性等没有相关报道。2019年山东农业大学姜淑霞、任纪帆等申请“耐高温大球盖菇菌株及其应用”专利，通过单孢杂交获得耐高温的大球盖菇酒红菌株。
[0004]
发明概述
[0005]
本发明的目的在于提供一株适合大田、林下等推广种植的金黄色大球盖菇菌株。
[0006]
本发明菌株以云南省普洱市种植的酒红大球盖菇的孢子紫外诱变获得，菌盖颜色为金黄色，显著区别于目前推广种植的所有大球盖菇品种。通过6年的迭代栽培选育，选育出的菌株的金黄色菌盖的遗传性状稳定，并对其进行了形态学、生物学特性、its分子鉴定和issr 分子标记差异性研究，该菌株被命名为大球盖菇(strophariarugosoannulata)jsj-hsr-101，属于球盖菇科(strophariaceae)，球盖菇属(stropharia)，于2020年6月11日，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为：cgmcc no.19657。
[0007]
本发明提供一种大球盖菇菌株，其子实体颜色为黄色或金黄色，所以商品名称黄松茸(stropharia rugosoannulata)，属于球盖菇科 (strophariaceae)，球盖菇属(stropharia)。
[0008]
本发明提供一种黄松茸(stropharia rugosoannulata)菌株，其主要形态特征和生物学特性包括下列特征:
[0009]
该菌株在改良pda培养基上，22℃暗培养，菌丝洁白、浓密，在光学显微镜下锁状联合明显；
[0010]
在种植过程中，子实体丛生，或群生，菌盖近半球形，后扁平，直径5-16厘米，菌柄粗3-8cm、长5-15cm，菌盖肉质，湿润时表面稍有粘性；
[0011]
幼嫩子实体初为黄白色，常有乳头状的小突起，随着子实体逐渐长大，菌盖由淡黄色转至黄色、金黄色；
[0012]
菌环膜质，较厚或双层，位于柄的中上部，白色或近白色，上面有粗糙条纹，深裂成若干片段，裂片先端略向上卷，易脱落，在老熟的子实体上常消失；以及
[0013]
孢子光滑，棕褐色。
[0014]
根据本发明，改良pda包括马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉18g/l，豆粕5g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁1.5g/l，ph 6.5。
[0015]
本发明还提供一种金黄色大球盖菇菌株，其包含its序列seq idno:3，且经由引物u862(seq id no:4)扩增与其母本sr-68相差750bp 和1500bp两个条带。
[0016]
发明效果
[0017]
本发明的金黄色大球盖菇菌株是通过孢子紫外诱变得到，颜色为黄色、金黄色，区别于所有现有大球盖菇菌株。
[0018]
本发明菌株的优点在于：该菌株子实体结实率高，菌丝生长速度较酒红色菌株快，在大田出菇过程中杂菌少、菇大小均匀、菌柄结实、孢子量少、颜色黄色、金黄色，商品性状好，具有较高的推广价值。
[0019]
附图及其简要说明
[0020]
为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式。本发明包括但不限于下列附图：
[0021]
图1a和图1b分别示出金黄色大球盖菇菌株“黄松茸
”ꢀ
(jsj-hsr-101)的子实体；以及
[0022]
图2示出u862引物pcr扩增胶图，其中jsj-hsr-101是本发明新突变的菌株；sr-68是母菌株。
具体实施方式
[0023]
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分，而非全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在无需作出创造性劳动前提下所获得的所有变例，都落入本发明要求保护的范围。
[0024]
除非特别说明，本发明百分比为重量百分比。
[0025]
实施例
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1.母本的选择
[0027]
本发明母本来源于2013年云南省普洱市推广种植的sr-68菌株 (产量高、商品性状好)。该菌株属于普洱普研科创生物科技有限公司主推品种。
[0028]
2.孢子紫外诱变
[0029]
2.1母本形态
[0030]
于2013年11月16日，采自云南省普洱市思茅区倚象镇鱼塘村阿里河种植地块，为第一潮菇sr-68菌株特级菇，菌柄直径4.8cm，高 8.2cm，菌盖成半球形未开伞，菌褶有少量
孢子。
[0031]
2.2紫外诱变
[0032]
于2013年11月16日，在超净工作台上，将采摘的母本用酒精表面消毒，拔去菌柄，然后将菌帽置于无菌培养皿里，获得孢子印。于 2013年11月17日，用接种针划线涂布法将孢子接种于改良pda培养基中，一共接种32个培养皿。
[0033]
接种后利用30w紫外灯照射，照射距离为30cm，照射2min停10 分钟，如此反复10次，然后转入培养箱25℃暗培养。
[0034]
改良pda：马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂粉18g/l，豆粕 5g/l，磷酸二氢钾3g/l，硫酸镁1.5g/l，ph 6.5。
[0035]
3.多孢培养获得突变菌株
[0036]
在32个培养皿中，仅有13个培养皿孢子萌发，菌丝粗壮、浓密。将13个培养皿中菌丝分别转接至改良pda培养基中，暗培养12天，作为一级种。11个培养皿菌丝长势及形态无显著差异，另外2个培养皿中的菌丝长势稍弱但生长速度快。
[0037]
4.二级、三级种制备
[0038]
分别将13个培养皿分别编号，进行菌种扩繁，制备二级种、三级种。二级种、三级种配方均为：木屑30％、玉米芯30％、谷壳20％、麦麸10％、豆粕8％、轻质碳酸钙2％；
[0039]
5.出菇试验
[0040]
5.1栽培料配方
[0041]
木屑40％、玉米芯30％、谷壳25％、麦麸3％、轻质碳酸钙2％；
[0042]
5.2建堆发酵
[0043]
按配方将原料拌匀后，加水调节含水量至65％，建成高1.5米，长度3米的堆。当堆内温度升至60℃时，开始第一次翻堆，重复三次。
[0044]
5.3播种
[0045]
将发酵好的原料平铺至整好的地面，宽度为60cm，第一层厚度为 12cm，整平料表面后播撒菌种(菌种掰成小碎块)，接着铺设第二层料，料厚度为8cm,总高度控制在20cm，最后盖一层3cm的土，并在土层上加盖一层草即可。
[0046]
5.4发菌、出菇管理
[0047]
菌丝生长阶段要求堆温22℃～28℃，培养料的含水量为60～65％，空气相对湿度为85％～90％
[0048]
培养40天后，土表菌丝开始扭结，有白色小突起，此阶段理重点是保湿及加强通风透气，相对湿度宜控制90％～95％；气候干燥时，要注意菇床的保湿，通常是保持覆盖物及覆土层呈湿润状态。至47天，采收第一潮菇。
[0049]
6.发现突变的金黄色子实体，从突变的金黄色子实体中分离得到突变菌种，重复继代出菇试验
[0050]
在此次大球盖菇孢子紫外诱变的13个编号的菌株的出菇试验中，其中一个菌株(长势弱但生长速度快的其中之一)中约10％的子实体的菌盖表面为金黄色，其余仍为酒红色。
[0051]
7.迭代栽培选育，得到金黄色子实体性状稳定的菌株
[0052]
选取金黄色子实体，通过菌种分离、扩繁的方式，重复播种。结果表明，金黄色子实
体的比例逐步增加。从2014年开始，不断栽培选育，到2018年11月20日播种，2019年1月5日出菇的继代试验中，子实体全部为金黄色，此后又经过4次重复试验，子实体均为金黄色，无酒红色子实体，最终保存菌种，得到jsj-hsr-101菌株，并命名为大球盖菇(stropharia rugosoannulata)。
[0053]
8.菌株jsj-hsr-101的鉴定
[0054]
分子鉴定：根据试剂盒操作步骤提取金黄色大球盖菇基因组dna (百泰克生物科技有限公司真菌基因组dna提取试剂盒)，并以1％的琼脂糖凝胶电泳检测。使用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物its1 (5
’-
tccgtaggtgaacctgcgg-3’，seq id no:1)和its4 (5
’-
tcctccgctta-ttgatatgc-3’，seq id no:2)，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。将所提取到的金黄色大球盖菇基因组 dna作模板，its1和its4(用ddh2o稀释到10um)分别为正向、反向引物进行pcr扩增，pcr反应扩增总体系为50ul：首先加入混合mix： 25ul，其次加入ddh2o：22ul，再分别加入正反向引物its1、its4各1ul，将其混合均匀后最后加入基因组dna：1ul。充分混合均匀后，于pcr仪中进行扩增反应，pcr扩增程序为：94℃-5min，94℃-30s，56 ℃-45s，72℃-1min，35个循环，72℃-10min，4℃-∞。pcr扩增产物经 1％的琼脂糖凝胶电泳检测，将剩余产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行双向测序，得到一条691bp的序列。进入ncbi，应用blast 将序列进行同源性搜索，与数据库中各菌株序列进行相似性分析，与数据库中的stropharia rugosoannulata各个菌株序列覆盖率达到了 99％-100％，则该菌株被鉴定为大球盖菇。
[0055]
its序列：
[0056]
1 ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt attgaataaa cctggcttgg ttgttgctgg
[0057]
61 tcttttcgga gacatgtgca cgccttgtca tctttatatt tccacctgtg caccttttgt
[0058]
121 agacttgagg acagatttcc gaggcaactc ggtcgtgagg aattgcttta accggctttc
[0059]
181 cttgaatgtc ttcaagccta tgtttcatat acaccataag aatgtaacag aatgtcatta
[0060]
241 ttagacttat gtcttataaa ctatatacaa ctttcagcaa cggatctctt ggctctcgca
[0061]
301 tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat
[0062]
361 cgaatctttg aacgcacctt gcgctccttg gtattccgag gagcatgcct gtttgagtgt
[0063]
421 cattaaattc tcaaccttta tcagcttttt ggttgataaa tggcttggat gtgggagctt
[0064]
481 gcaggtttct cttttgaaat cagctctcct gaaatacatt agctggttgc cttgtgtaga
[0065]
541 ctagtctatt agtgtgataa ttatctacgc tgtggactgt ttaccgatta tagcactgct
[0066]
601 tctaatcgtc tgttaactcg gacaatatat gacaatttga cctcaaatca ggtaggacta
[0067]
661 cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg a(seq id no:3)
[0068]
9.金黄色大球盖菇与普通大球盖菇issr差异筛选：
[0069]
使用哥伦比亚大学所公布100条issr随机引物(见参考文献5)，从中经过三轮筛选后从100条引物中找出8条能与金黄色大球盖菇、普通大球盖菇所能配对且扩增出多态性条带的引物，并且用美国哥伦比亚大学发表的issr引物u862(agc agc agc agc agc agc，seq idno:4)，由上海生工生物工程股份有限公司合成的u862引物扩增，发现母本菌种和诱变的大球盖菇jsj-hsr-101菌株之间差异明显，诱变的大球盖菇jsj-hsr-101菌株缺失母本菌株具有的750bp与1500bp两条条带 (见图2)。
[0070]
扩增条件及体系为：总体系为25ul，首先加入混合mix:14ul，其次加入ddh2o:
8.5ul，再加入引物u862:1.5ul，最后加入基因组dna： 1ul，充分混合均匀后放入pcr仪中进行扩增反应，其扩增条件为：94 ℃-5min，94℃-1min，63℃-1min，72℃-1min，(35个循环)72℃-10min， 4℃-∞。扩增结束后上样于1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，由图2中2、 4泳道为金黄色大球盖菇，3、5泳道为普通大球盖菇，金黄色大球盖菇与普通大球盖菇于750bp与1500bp处具有差异条带，经重复实验后确定此处为二者间的差异条带。由此可见，金黄色大球盖菇与普通大球盖菇存在着基因上的差异。
[0071]
参考文献
[0072]
[1]黄年来.大球盖菇的分类地位和特征特性[j].食用菌，1995， 17(6)：11.
[0073]
[2]萨仁图雅.图力古尔.大球盖菇研究进展[j].食用菌学报，2005， 12(4)：57-64.
[0074]
[3]杨新美.中国食用菌栽培学[m].北京：农业出版社.1988.
[0075]
[4]黄年来.中国大型真菌原色图鉴[m].北京:中国农业出版社， 1998.
[0076]
[5]周延清.dna分子标记技术在植物研究中的应用[m].北京:化学工业出版社,2005.